EVALUATION OF FUNCTIONAL FEATURES AND STRESS RESISTANCE OF ISOGENIC TOXIGENIC AND NON-TOXIGENIC BIOVAR EL TOR VIBRIO CHOLERAE STRAINS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Холера продолжает оставаться одной из глобальных угроз человечества. Ежегодно в мире регистрируется более 2,8 млн случаев заболевания и более 93 тыс. смертей от холеры [10]. Широкое распространение холеры в последние годы регистрируется на таких территориях как Азия, Африка, Доминиканская республика, республика Гаити, Америка, а завозные случаи холеры регистрируются ежегодно во всем мире, включая Российскую Федерацию [4, 6, 15]. Естественным местом обитания холерного вибриона являются воды пресных и соленых водоемов, обусловливающие основной водный путь передачи инфекции [18]. В связи с этим, большое значение для понимания эпидемиологических механизмов распространения холеры приобретает изучения адаптации Vibrio cholerae к изменяющимся условиям окружающей среды (температуре, рН, осмолярности, питательному составу) при смене вибрионом экологической ниши (водная среда - человек - водная среда), климатических и географических условий обитания. Основным этиологическим агентом холеры на протяжении последних 50 десятилетий является V cholerae О1 биовара Эль Тор, который еще в середине прошлого века практически полностью вытеснил штаммы V. cholerae классического биовара [1]. Большой интерес и эпидемиологическую настороженность вызывают штаммы V cholerae Эль Тор биовара, лишенные тех или иных генов вирулентности. Такие штаммы выделяют из внешней среды в различных регионах мира и России. Так, нетокси-генные штаммы, утратившие профаг CTXф, с генами холерного токсина (ctxAB), ответственного за развитие основного клинического симптома при холере - профузной диареи, но сохранившие гены основного фактора колонизации тонкого кишечника человека - токсин-корегулируемые пили адгезии (tcpA), были выделены на территории Аргентины, Индии, Африки, Перу, Мальдивских островов, Китая, России и на других территориях [5, 7, 9, 18, 19]. Указанные атоксигенные штаммы, сохранившие способность к колонизации тонкого кишечника, способны вызывать вспышки или отдельные случаи диарейных заболеваний, а также обусловливать вибриононо-сительство [2, 5, 19]. Какова же причина и механизм образования подобных штаммов? Возможно, ответ на этот вопрос кроется в стрессовом воздействии, которое оказывает водная среда на организм холерного вибриона, вызывая генетические изменения в его геноме и приводя к появлению штаммов, лишенных ряда мобильных генетических элементов (МГЭ), ответственных, прежде всего, за вирулентные свойства возбудителя холеры, не являющиеся жизненно важными для клетки в данных условиях существования [8]. Выживание в водной среде именно этой группы штаммов указывает на то, что утрата профага СТХф дает нетоксигенным штаммам конкурентные преимущества в водной среде по сравнению с токсигенными штаммами [8]. Однако функциональные причины этого явления, а также адаптационные преимущества указанных штаммов к воздействию разного вида стресса (окислительному, оксида-тивному, солевому и т.д.) остаются мало изученными. В связи с этим, целью настоящей работы явилось проведение сравнительного анализа функциональных особенностей токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и их спонтанных нетоксиген-ных мутантов и изучение их устойчивости к действию солевого и окислительного стресса. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы 8 штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: 4 клинических штамма, выделенных в 1970 г. от больных в Астрахани (получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофи-лизированном состоянии), и 4 спонтанных нетоксигенных мутанта этих штаммов, утративших гены холерного токсина в результате пребывания в речной воде при температуре 25°С. Для культивирования бактерий использовали бульон и агар LB. Все работы проводили в соответствии с действующими Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)». Двумерный форез проводили по методу O'Farrell P.H. [16] со следующими модификациями: клетки лизировали в буфере L, содержащим 7 М мочевину, 2 М тиомо-чевину, 65 mM DTT, 5% Ampholine 3-10 (Amersham, USA), 4% CHAPS (Amersham, USA), 1,5% NP-40. Каждый образец (150 мкг белка) подвергали изоэлектрофокусированию с последующим разделением по молекулярным массам электрофорезом в денатурирующих условиях в 9 - 16% полиакриламидном геле по методу Laemmli U.K. [13]. Анализ различий в двумерных гелях производили, используя программу Melanie III (Genebio, Switzerland). Белковые пятна вырезали из геля и подвергали расщеплению трипсином (Promega, USA). Для последующей масс-спектрометрии полученные образцы наносили на мишень и добавляли насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Sigma, USA; дважды перекристаллизованная из метанола) в 80 % ацетонитриле, 0,1 % трифторуксусной кислоте. Высушивали на воздухе. Масс-спектры получали на MALDI-TOF масс-спектрометре Reflex III (Bruker, США) с УФ лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс от 500 до 8000 Да. Полученные масс-спектры калибровали, используя известные массы внутренних стандартов. Идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot (Matrix Science, США) с точностью определения массы МН+, равной 0,01%, допуская возможность модификации цистеинов акриламидом и окисления метионинов. При поиске привлекали базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Протеомный анализ проводился совместно с сотрудниками протеомного центра НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича (Москва). Протеинограмма исходного токсигенного штамма V. cholerae М888 ctxA+B+ (А) и его спонтанного М888 ctxA^- мутанта (Б) с идентифицированными белками. 198 - цитрат-синтаза; 221 и 222 - периплазматический белок МВР; 264 - трансальдолаза; 316 - фосфорилаза пуриновых нуклеозидов; 331 - триозофосфатизомераза. Для изучения устойчивости культур к высоким концентрациям перекиси водорода и соли использовали 3 мл 12-часовой культуры холерных вибрионов, выросшей в минимальной среде (рН 7,2) с добавлением глюкозы. Методом центрифугирования выросшие бактерии отделяли от супернатанта и разводили в минимальной среде (рН 7,2) с добавлением глюкозы до концентрации 1х109. Далее культуры подводили к одной концентрации на ФЭК и переносили по 3 мл в две пробирки. В первую пробирку добавляли перекись водорода до концентрации 20 мМ, во вторую NaCl до концентрации 3 мМ. Через разные промежутки времени делали высев культуры на агар LB, подсчитывая количество выросших колоний [20]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ В предыдущих исследованиях нами были получены четыре пары изогенных штаммов, состоящие из четырех токсиген- Таблица 1. Количественное выражение интенсивности белковых пятен в изогенных ctxA+B+ и clxA^- вариантах штамма М888 № пятна Интенсивность белковых пятен на геле М888 ctxA+E+ М888 ctxA-b- 174 0,00 0,15±0,01 198 0,03±0,04 0,17±0,01 209 0,45±0,07 0,21±0,00 221 0,43±0,06 1,02±0,04 222 0,22±0,07 0,60±0,05 261 0,20±0,01 0,43±0,01 264 0,12±0,03 0,43±0,02 295 0,38±0,04 0,78±0,00 316 0,24±0,06 0,55±0,08 331 0,77±0,03 0,18±0,08 338 0,42±0,05 0,21±0,02 344 0,35±0,04 0,84±0,09 384 0,44±0,05 0,21±0,04 388 0,95±0,01 0,20±0,05 391 0,65±0,01 0,24±0,06 424 0,47±0,03 0,25±0,03 442 0,00 0,16±0,01 Примечание. Приведены средние показатели по трем экспериментам, различия между которыми статистически незначимы. Жирным шрифтом выделены значения интенсивности белковых пятен, отличающихся по уровню экспрессии соответствующих белков в 3 раза и более. ных штаммов и их спонтанных нетоксиген-ных мутантов, утративших гены холерного токсина ctxAВ в результате пребывания в речной воде при температуре 25°С: М888 ctxA+В+ и М888 ctxA^-, М887 ctxA+В+ и М887 ctxA^-, М886 ctxA+В+и М886 ctxA^-, М890 ctxA+В+ и М890 ctxA^- [8]. Для выявления связи между изменением структуры генома и его функциями мы провели протеомный анализ изогенных ctxA+В+ и ctxA^- вариантов одного из полученных нами штаммов, а именно V. cholerae М888. Протеомный анализ был направлен на идентификацию и количественное определение всех индивидуальных белков токси-генных и нетоксигенных вариантов штамма М888 для выявления изменений в их экспрессии после утраты клетками генов ctxAВ. Согласно полученным данным в стандартных условиях культивирования (LB агар 37°С, 18 ч) в клетках двух сравниваемых штаммов экспрессировалось около 400 белков (рис. А, Б). При сопоставлении протеомным карт было выявлено, что потеря генов профага СТХф действительно сопровождалась изменением экспрессии 17 белков, из которых синтез 10 белков индуцировался, а 7 репрессировался. При этом уровень экспрессии 5 белков у ctxA^- вариантов отличался от таковой у исходных штаммов в 3 раза и более (табл. 1, рис. А, Б). Из 17 белков, экспрессия которых была достоверно различна у изогенных вариантов штамма М888, было идентифицировано лишь 5 белков (табл. 2). Обнаружено, что клетки изогенных вариантов ctxA+В+ и ctxA-В- отличаются по продукции ферментов, участвующих в метаболизме клетки, хемотаксисе и энергетическом обмене. Так, у ctxA^- мутанта экспрессия фермента цитрат-синтазы (катализирует конденсацию ацетил-KoA с оксалоацетатом с образованием цитрата), участвующего в цикле лимонной кислоты (важнейшем биохимическом механизме, обеспечивающим энергетический и конструктивный механизм клеток), увеличена в 5,6 раза. Повышена также в 3,5 раза продукция трансальдолазы (катализирует перенос дигидроксиацетонового остатка из кетосахара в альдосахар) - важнейшего фермента пентозофосфатного пути окисления углеводов, имеющего огромное значение в обмене веществ, синтезе нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и коферментов. Необходимо также отметить периплазматический белок МВР (maltose-binding protein), который участвует в транспорте и метаболизме полимеров глюкозы (мальтодекстрин) и, к тому же, принимает активное участие в хемотаксисе бактерий. Биосинтез этого белка в клетках ctxA-B- мутанта был выше в 2,5 раза. Кроме того, у нетоксигенных мутантов примерно в 2 раза повышен уровень биосинтеза фосфорилазы пуриновых нуклеозидов, которая играет большую роль в метаболизме клетки, поскольку с ее участием происходит образование нуклеотидов, формирующих нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), макроэргические соединения (АТФ, АДФ) и некоторые кофермен-ты (цАМФ и др.). Вместе с тем, при утрате профага генов холерного токсина почти в 4,3 раза понизился уровень экспрессии фермента триозофосфатизомеразы, который катализирует реакцию превращения диоксиацетонфосфата в D-глицеральдегит-3-фосфат (табл. 2). Именно этот триозофосфат далее включается в реакции II стадии гликолиза, в результате чего происходит аккумулирование энергии углеводов в АТФ [3]. Таким образом, представленные результаты протеомного анализа показывают, что потеря профага СТХф клетками штамма М888 сопровождается изменением уровня экспрессии 5 идентифицированных белков. Исходя из анализа функций данных белков у нетоксигенных мутантов, следует сделать предположение, что при утрате профага может изменяться энергетический обмен, транспорт глюкозы, хемотаксис, а также биосинтез пуриновых оснований. На следующем этапе работы были проведены исследования, направленные на оценку устойчивости вирулентных штаммов и их нетоксигенных мутантов к действию различных неблагоприятных факторов окружающей среды. С этой целью были взяты четыре пары изогенных вариантов V cholerae биовара Эль Тор - М888 ctxA+В+ и М888 ctxA-B-, М887 ctxA+В+ и М887 ctxA-B-, М886 ctxA+В+ и М886 ctxA-B-, М890 ctxA+В+ и М890 ctxA-B-. В качестве стрессового фактора использовали высокую концентрацию соли или перекиси водорода. Как известно, перекисные соединения образуются в клетках V cholerae под действием солнечного света, а соли натрия в среде выращивания (в количестве 2,0 - 2,5%) необходимы для нормального роста холерного вибриона, так как он является галотолерантным микроорганизмом [14, 17]. Для сравнительного изучения устойчивости сравниваемых штаммов V. cholerae к высоким концентрациям соли или перекиси водорода к культуральной взвеси добавляли перекись водорода до концентрации 20 ммоль или NaCl до концентрации 3 мМ. Через Таблица 2. Идентифицированные белки двух изогенных ctxA+B+ и ctxA-B- вариантов V. cholerae биовара Эль Тор Номер пятна Соотношение интенсивности белковых пятен Название белка Обозначение аминокислотной бпоследова-тельности в базе данных NCBI Мол. масса (Mr), Да Функция белка ctxA+E+ ctxA-B- 198 0,03+0,04 0,17+0,01 Цитрат синтетаза (EC 2.3.3.1) gi|15641349 41586 Энергетический обмен 221 222 0,43+0,06 0,22+0,07 1,02+0,04 0,6+0,05 Периплазматический белок МВР gi|116190942 42289 Транспорт глюкозы и хемотаксис 264 0,12+0,03 0,43+0,02 Трансальдолаза (EC 2.2.1.2 ) gi|15601381 34614 Энергетический обмен 316 0,24+0,06 0,55+0,08 Фосфорилаза пуриновых нуклеозидов (ЕС 2.4.1.1) gi|15642344 26107 Биосинтез пуриновых оснований 331 0,77+0,03 0,18+0,08 Триозофосфатизомераза (ЕС 5.3.1.1) gi|116190660 26984 Энергетический обмен П римечание. Приведены средние показатели по трем экспериментам, различия между которыми статистически незначимы. определенные промежутки времени делали высев 0,1 мл культуры на агар LB и подсчитывали количество выросших колоний [20]. В результате установлено, что все исследованные нетоксигенные мутанты отличались большей устойчивостью к действию солевого стресса. Так, количество выживших клеток нетоксигенных мутантов через 60 мин после действия 3 Моль раствора хлористого натрия составляет 400 - 1600 клеток в 0,1 мл взвеси, тогда как для исходных штаммов эти показатели были в 5 - 10 раз ниже. Такая же картина наблюдалась при воздействии на клетки токсигенных и нетоксигенных штаммов 20 мМ перекиси водорода. Выживаемость нетоксигенных мутантов была в 5 - 15 раз выше по сравнению с исходными штаммами. Таким образом, утрата генов профага СТХф приводит к заметному повышению выживаемости нетоксигенных вариантов в неблагоприятных условиях окружающей среды по сравнению с исходными штаммами. ОБСУЖДЕНИЕ Суммируя полученные данные, следует отметить, что смена холерными вибрионами среды обитания (человек - водная среда) может обусловить реорганизацию генома патогенных клонов. Выделение из внешней среды нетоксигенных штаммов V cholerae, сохранивших другие гены вирулентности, подтверждает это предположение [5, 7, 9, 18, 19]. Согласно данным протеомного анализа, потеря генов, не являющихся жизненно важными для клетки в водной среде, привели к изменению уровня экспрессии 17 белков, среди которых были белки, участвующие в энергетическом обмене, биосинтезе пуриновых оснований, а также в транспорте глюкозы и хемотаксисе. К тому же, нетоксигенные мутанты оказались более устойчивыми к действию солевого и окислительного стресса. Все эти события, происходящие в клетках, являются, видимо, одним из способов адаптации патогенных бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды. Полученные нами данные объясняют возможную причину потери штаммами V. cholerae генов ctxAB и образование ctxA^-tcpA+ штаммов, которые нередко присутствуют в природных популяциях. Такие штаммы представляют большой интерес, поскольку, во-первых, они сохраняют способность к колонизации тонкого кишечника и, следовательно, могут обусловить появление вибриононосителей, во-вторых, существует реальная возможность превращения их в токсигенные в результате фаговой конверсии. И хотя частота реверсии нетоксигенных клонов в токсигенные, по литературным данным, составляет лишь 10-6 - 10-9 [11, 12], в условиях макроорганизма вероятность такого события повышается за счет массового размножения холерных вибрионов. И наконец, штаммы с обнаруженной реорганизацией генома и измененной экспрессией ряда генов могут являться ценным материалом для последующих эволюционных преобразований возбудителя холеры.

About the authors

T. A Kulshan

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

S. P Zadnova

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

N. B Cheldyshova

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

N. I Smirnova

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

References

Supplementary files