ANTIVIRAL ACTIVITY AND POSSIBLE MECHANISMS OF ACTION OF MORAPRENIL PHOSPHATES DURING EXPERIMENTAL INFECTION CAUSED BY HERPES SIMPLEX TYPE 1 VIRUS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Герпетическая инфекция, вызываемая вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ 1), продолжает оставаться актуальной для человека и животных. Для ВПГ 1 характерна длительная персистенция вируса в организме, а также хроническое иммунодефицит-ное состояние [1]. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики герпеса используется достаточно большое количество иммуномодуляторов и противовирусных средств (ацикловир, ридостин, панавир, гепон, алломедин и др.), поиск и внедрение препаратов, повышающих резистентность к герпетической инфекции, остается актуальной задачей. Очевидно, что подобные препараты должны не только подавлять размножение вируса герпеса и способствовать коррекции вирус-индуцированного иммунодефицита, но и соответствовать требованиям безопасности, включающим отсутствие токсичности, аллергенности и реактогенности. В предыдущих исследованиях было показано, что морапренилфосфаты (МПФ) подавляют размножение многих вирусов в чувствительных культурах клеток, а также обладают противовирусной активностью при инфицировании животных [2 - 5, 8 - 10]. Целью данной работы было исследование влияния пути введения МПФ на их противовирусную активность при экспериментальной инфекции, вызванной ВПГ 1 у мышей. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали ВПГ1 (штамм VR-3), полученный из НИИВП им. О.Г. Анджапаридзе. Вирус пассировали и титровали на перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки VERO. Титр вируса оценивали в lg ТЦД50/мл.. Статистическую обработку результатов исследования проводили по Фишеру [7], среднюю продолжительность жизни (СПЖ) вычисляли по Мойнелу [12]. Для оценки специфической активности препарата использовали культуру клеток VERO, которую заражали ВПГ1, штамм VR-3. В зараженной культуре оценивали количество симпластов. Для культивирования клеток VERO использовали ростовую питательную среду: 2/3 среды Игла МЕМ (ПанЭко) и 1/3 среды ДМЕМ (ПанЭко), 15 МЕ/мл гентами-цина (ICN, США), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США). Клетки рассевали в концентрации 1,5х105 кл/мл в 24-луночных планшетах (ПанЭко) по 1 мл в лунку. Культивировали в СО2-инкубаторе при 37°C, 5% СО2 и 90% влажности 24 часа до образования монослоя, после чего добавляли по 1 мл вируса в разведении от 10-3 до 10-7 (исходный титр 107 ТЦД50/мл). В опытные лунки добавляли МПФ в конечной концентрация 400 мкг/мл, в контрольные лунки вносили в том же объеме раствор плацебо. Через 24 часа подсчитывали число симпластов и вычисляли процент подавления симпластообразования по формуле: х=100 - [(а х 100) : b], где: a - количество симпластов в опытных лунках; b - количество симпластов в контрольных лунках. Для экспериментов in vivo была отобрана серия МПФ, после воздействия которого на клетки VERO оставалось 2 симпласта на лунку (в контроле - 68). В опытах использовали аутбредных беспородных мышей обоего пола массой 10 - 12 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Использовали МПФ производства ООО «ГамаВетФарм» при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, содержавший 5 мг активного вещества в 1 мл. Исходный препарат разводили в 50 раз стерильной дистиллированной водой и вводили мышам в объеме 0,2 мл (20 мкг/мышь) или 0,4 мл (40 мкг/мышь). В качестве препарата сравнения использовали ридостин производства ЗАО «Вектор-Медика», п. Кольцово Новосибирской области, серии № 10206, содержащий 8 мг активного вещества в 1 мл. Использовали дозу 200 мкг/мышь, обычно применяемую у мышей при моделировании инфекции. На первом этапе исследовали противовирусную активность МПФ при введении до появления первых клинических признаков заболевания. Под наблюдением находились 4 группы животных (по 16 особей в каждой): 1 группа - заражение ВПГ1 в дозе 105 ТЦД5о/0,5 мл, в/б; 2 группа - то же через 24 часа после введения ридостина в дозе 200 мкг/мышь/0,2 мл, в/б; 3 группа - то же + 3-кратное (одновременно с ВПГ1, через 24 и 48 часов после заражения) п/к введение МПФ в дозе 20 мкг/мышь/0,2 мл; 4 группа - то же + 4-кратное введение МПФ п/к в дозе 20 мкг/мышь/0,2 мл на 1, 2, 3, 4 сутки после заражения до появления первых клинических признаков заболевания. На втором этапе изучали лечебное действие МПФ у мышей с клиническими признаками заболевания. Под наблюдением находились 4 группы животных (по 26 особей в каждой): 1 группа - заражение ВПГ1 в дозе105 ТЦД50 /0,5 мл, в/б; 2 группа - то же через 24 часа после введения ридостина в дозе 200 мкг/мышь/0,2 мл, в/б; 3 группа - то же + 4-кратное п/к введение МПФ в дозе 20 мкг/мышь/0,2 мл на 4, 5, 6 и 7 сутки после заражения; 4 группа - то же + 4-кратное п/к введение МПФ в дозе 40 мкг/мышь/0,2 мл на 4, 5, 6 и 7 сутки после заражения. За мышами ежедневно наблюдали в течение 14 суток, выявляли больных и павших особей. Клинические признаки заболевания регистрировали с 4 по 8 сутки после заражения. У больных мышей наблюдались характерные признаки герпетической инфекции с поражениями ЦНС: вялость, взъерошенность шерсти, парезы задних конечностей, судороги с последующей гибелью. По окончании наблюдений рассчитывали показатели летальности по каждой группе: отношение павших животных к общему количеству мышей в группе (в %) и СПЖ в сутках. Синтез кДНК проводили при помощи набора с MMLV обратной транскриптазой (ОТ) фирмы «Силекс», Россия. При постановке ПЦР в реальном времени использовали наборы с Hot Start Taq ДНК-полимеразой и интеркалирующим красителем SYBR GREEN производства фирмы «Синтол», Россия. Подбор праймеров осуществляли в программе OLIGO 6. Для предотвращения синтеза с геномной ДНК, присутствующей в образцах РНК, праймеры подбирали таким образом, чтобы 3’-концевой участок хотя бы одного из пары, состоящий не более чем из 5 нуклеотидов, перекрывал границы двух соседних экзонов исследуемого гена. Величину относительной экспрессии (ОЭ) исследуемого гена вычисляли по формуле: ОЭ гена х = 2(Оконтр. - С^бр), где: С^онтр. - среднее значение порогового цикла C(t) для контрольного образца, Ообр. - среднее C(t) для экспериментального образца. Значения относительной экспрессии исследуемых генов нормировались по уровню относительной экспрессии гена HPRT1. Фрагменты кДНК исследуемых генов амплифицировали с использованием праймеров следующих последовательностей: HPRT1: прямой 5'GGA TAC AGG CCA GaC TTT GTT 3' и обратный 5' GGC TTT TCC AGT TTC ACT AAT G 3'; FoxP3: прямой 5’ GCA ATA GTT CCT TCC CAG AGT T 3’ и обратный 5’ TGA GTG TCC TCT GCC TCT CC 3’. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96, Bio-Rad, США. Анализ результатов ПЦР и статистическую обработку производили при помощи программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager Software Ver. 1.6. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Опыты по исследованию противовирусной активности МПФ in vitro показали, что препарат подавляет вирусиндуцированное симпластообразование в клетках линии Vero более, чем в 30 раз. Данные, представленные в табл.1, показывают, что доза ВПГ, использованная в данном опыте (105 ТЦД50), соответствует 1 ЛД75. Ридостин защищал 44% мышей (гр.2), а МПФ в дозе 20 мкг/мышь после 3-кратного введения защищал 50% мышей; показатель СПЖ был значительно больше контрольного (гр. 1 и 3); после 4-кратного введения МПФ защищал 57% мышей, а СПЖ повышалась более чем в 2 раза (группы 1 и 4). Данные, представленные в табл. 2, показывают, что доза ВПГ, использованная в данном опыте (105 ТЦД50), соответствует 1 ЛД84 для мышей. Ридостин защищал 50% мышей (гр. 2), а МПФ в дозе 20 мкг/мышь, введенный четырехкратно в течение острого периода, вызывал защиту в 39% случаев: летальность в группе 3 составила 61%; показатель СПЖ был достоверно больше контрольного (группа 1 и 3); МПФ в дозе 40 мкг/мышь, введенный четырехкратно в течение острого периода, вызывал защиту животных в 27 % случаев: летальность в группе 4 составила 73%; показатель СПЖ не превышал контрольного (группа 1 и 4). После заражения мышей ВПГ1 в дозе «10 ЛД50 летальность животных составляла около 80%. Инкубационный срок составлял 3 суток, на 4 сутки после заражения начинали проявляться клинические признаки инфекции, неврологическая симптоматика и гибель экспериментальных животных. На рисунке показана динамика экспрессии гена FoxP3 в селезенках мышей с 1 по 4 сутки после заражения ВПГ1 и на фоне введения МПФ. Величина экспрессии гена FoxP3 в тимусах на 4 сутки после заражения в группе мышей с выраженной неврологической симптоматикой значительно превышала контрольные значения (4,95+0,29, p<0,05), в то время как величина относительной экспрессии в группе без выраженных клинических признаков заболевания не отличалась от контроля. Таблица 1. Противовирусная активность МПФ в инкубационном периоде при экспериментальной инфекции, вызванной ВПГ1 Дни после ^\заражения № группы^'-..0679Летальность (в %)СПЖ (в сут.) кол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-во 10/1612/1612/1612/16755,2 20/167/169/169/1656*7,4* 30/166/166/168/1650*8,9* 40/167/167/167/1643*10,2* П римечание. * - Разница между показателями летальности и СПЖ статистически достоверна (при Р<0,05) в группах 1 и 2; 1 и 3, 1 и 4. Таблица 2. Противовирусная активность МПФ при клинически выраженной инфекции, вызванной ВПГ1 Дни после0679Летальность (в %) № группы^'ч.кол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-вокол-во павших/ общее кол-воСПЖ (в сут.) 10/2618/2622/2622/26844,5* 20/2613/2613/2613/2650*7,4* 30/2616/2616/2616/2661*6,8* 40/2615/2615/2619/2673**5,1** Примечание. * Разница между показателями летальности и СПЖ статистически достоверна (при Р<0,05) в группах 1 и 2; 1 и 3; ** недостоверна (при Р<0,05) между группами 1 и 4. X 2 0.6- 1,5ай.я- Динамика экспрессии FoxP3 в селезенках мышей с 1 по 4 сутки после заражения ВПГ1 и на фоне введения МПФ. По оси абсцисс: 1 - заражение ВПГ1, 2 - заражение ВПГ1 и введение МПФ, 3 - введение МПФ, К - контроль. В каждой группе столбиков слева направо - сутки: 1, 2, 3, 4. ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что вирусы семейства Herpesviridae, используя приемы молекулярной мимикрии, обеспечивают защиту зараженных ими клеток от уничтожения цитоток-сическими Т-лимфоцитами и естественными киллерами, вследствие чего ВПГ может беспрепятственно размножаться, инфицировать новые клетки организма хозяина или персистировать в них. При этом особую опасность представляет герпетическая инфекция, развивающаяся на фоне иммунодефицита. Использующиеся в настоящее время антигерпетические препараты не только стимулируют интерфероны, но активируют моноциты/макрофаги, нейтрофилы, естественные киллеры в инфицированном организме, что и обеспечивает его защиту [15]. В настоящей работе использован МПФ (препарат на его основе рекомендован для профилактики и лечения герпесвирусных инфекций кошек), который обладает свойством формировать адекватный и сбалансированный клеточный и гуморальный иммунный ответ, в частности, стимулировать моноциты/макрофаги, а также подавлять созревание вирусных белков в чувствительных клетках [2, 4 - 6]. Ранее было показано, что МПФ подавляет размножение вирусов клещевого энцефалита (КЭ), энцефаломиелита Тейлера, желтой лихорадки, диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в чувствительных культурах клеток, а также обладает противовирусной активностью при инфицировании мышей вирусом КЭ и гриппа [2 - 5, 9, 10]. Кроме того, показана эффективность МПФ при профилактике и лечении герпетической инфекции кошек [13], аденовирозов и парагриппа собак [14], при инфицировании кроликов вирусом болезни Ауески и при экспериментальном генитальном герпесе морских свинок [8]. В настоящей работе представлены результаты, характеризующие антивирусную активность МПФ при инфицировании мышей ВПГ1. Показано, что МПФ в дозе 20 мкг/мышь при п/к введении обладает выраженным лечебно-профилактическом действием при экспериментальной герпетической инфекции. Впервые экспериментально показана эффективность МПФ при клинически выраженном герпесе на фоне развивающейся неврологической симптоматики: МПФ проявлял выраженное лечебное действие при ежедневном однократном введении в течение острого периода (на 4, 5, 6 и 7 сутки после заражения ВПГ1). При этом МПФ по протективной активности был сравним с ридостином. Визуальное наблюдение за мышами, которым вводили МПФ при появлении первых клинических симптомов, показало, что на фоне инъекций препарата клинические признаки прекращались через 2 - 3 суток и не регистрировались, по крайней мере, в течение всего периода наблюдений (14 суток). Мы показали, что повышение экспрессии гена FoxP3 в селезенках мышей наблюдается на 1 и продолжается на 2 сутки после заражения. Также показано, что активная герпетическая инфекция сопровождается увеличением экспрессии FoxP3 в тимусах мышей. Это может быть связано с тем, что ВПГ1 активирует Т-reg лимфоциты, проявляющие иммуносупрессивную активность, что может являться одним из механизмов противодействия вируса реакциям естественного иммунитета на ранних стадиях инфицирования. В случае заражения мышей ВПГ1 и введения МПФ активации экспрессии FoxP3 в селезенках не наблюдается. Это может объясняться либо способностью МПФ активировать реакции врожденного иммунитета и блокировать вирусопосредованную инактивацию таких реакций, что приводит к ранней элиминации вируса из организма, либо МПФ может непосредственно влиять на этапы жизненного цикла вируса и таким образом подавлять его репродукцию. Ранее было показано, что защитный эффект фосфорилированных полипренолов (ФП) при вирусных заболеваниях опосредован как прямым противовирусным действием, так и иммуномодулирующей активностью препаратов, связанной с усилением продукции цитокинов [11]. В частности, при совместном введении вируса клещевого энцефалита и ФП наблюдалась более ранняя продукция ФНОа и ИЛ-6. Известно, что применение иммуномодуляторов в остром периоде вирусных инфекций является крайне проблематичным, так как в этих случаях в организме зачастую регистрируется развитие цитокинового или токсического шока, что может обусловливать летальный исход. Ранее нами были выявлены адаптогенные и антитоксические свойства препаратов на основе ФП [2]. По-видимому, все эти свойства МПФ и обусловливают его эффективность при клинически выраженном герпесе. Кроме того, в предыдущих исследованиях было показано, что МПФ нетоксичен для клеток VERO, а также обладает значительной антигерпетической активностью в культуре клеток этой линии. Об этом свидетельствует способность препарата подавлять вирусинду-цированное симпластообразование в 30 раз. Полученные данные указывают на противовирусную активность МПФ на этапах взаимодействия вирус-клетка, которая была выявлена ранее в исследованиях МПФ других полипренолсодержащих препаратов [5, 8, 9]. Не исключено, что в инфицированном ВПГ организме мышей реализуется антивирусный механизм действия МПФ в клетках, в том числе в ЦНС. Важным, на наш взгляд, является то обстоятельство, что МПФ достаточно эффективен как при профилактике, так и при его использовании в период острого клинически выраженного герпеса у мышей, что дает основание для дальнейшего его продвижения в практику в качестве антигерпетического препарата.

About the authors

A. N Narovlyansky

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

S. V Ozherelkov

Chumakov Research Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis, Moscow Region, Russia

A. V Sanin

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

V. V Kozlov

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

A. V Salichev

Chumakov Research Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis, Moscow Region, Russia

A. S Esman

Chumakov Research Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis, Moscow Region, Russia

T. M Parfenova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

A. V Pronin

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

A. V Deeva

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

A. V Izmestieva

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

T. N Kozhevnikova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

O. Yu Sosnovskaya

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

References

Supplementary files