QUANTITATIVE AND QUALITATIVE COMPOSITION OF AXILLA MICROBIOTA IN PRACTICALLY HEALTHY INDIVIDUALS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Кожа - самый большой орган человеческого тела, охватывающий поверхность площадью 1,8 м2, является нестерильным органом, который, с одной стороны, обеспечивает защиту организма от химических и биологических факторов окружающей среды, а с другой, является индикатором внутреннего здоровья человека, реагируя на любые изменения. Кожа является экологической нишей для резидентной микрофлоры, обеспечивающей защиту от патогенов [3 - 5, 10, 11, 13]. Количество исследований микробиоты кожи человека достигает на сегодняшний день всего около 10% от числа научных проектов, связанных с изучением микробиоценоза желудочнокишечного тракта. Это связано, в первую очередь, с медленным изменением узкого восприятия микроорганизмов микробиоты кожи лишь в качестве агентов, потенциально вызывающих заболевания. Новое видение по данному вопросу предполагает наличие хрупкого равновесия, построенного на функциональном взаимодействии микробиоты кожи и врожденного иммунитета человека, поддерживающего как здоровье кожи, так и всего макроорганизма в целом. Существенный вклад в изучение микробиоты кожных покровов человека вносит осуществляемый в настоящее время международный проект Human Microbiome Project, инициированный в 2008 году National Institutes of Health [4], с целью идентификации микроорганизмов, находящихся в ассоциации с макроорганизмом в качестве симбионтов или патогенных агентов. В рамках данного проекта изучается микрофлора таких экологических ниш как ротовая полость, верхние дыхательные пути и легкие, желудочно-кишечный тракт, половые органы и, безусловно, кожа. Представителей родов Corynebacterium, Propionibacterium, Brevibacterium, Staphylococcus, Streptococcus и Micrococcus относят к резидентной микрофлоре кожи, осуществляющей положительные симбиотические взаимоотношения с макроорганизмом посредством мутуализма, комменсализма и протокооперации и образующей уникальный нормобиоценоз на поверхности кожи, нарушения в котором могут приводить к патологическим процессам [4, 5, 10, 11, 13]. Нормоценоз биотопа кожи имеет важное значение и для качества жизни человека, так как играет существенную роль в формировании запаха тела [3, 5, 11]. Биотоп кожи подмышечных впадин уникален, сочетает в себе наличие микробного сообщества в нише, характеризующейся определенными физиологическими свойствами - определенный температурный режим, влажность, наличие волосяных фолликул, сальных желез, экринов, апокринов, солей, белков, стеринов, сложных эфиров стерина, сложных эфиров воска, различных липидов, жирных кислот и д.р. [3, 11]. Поэтому целью исследования явилась характеристика количественного и качественного состава культивируемых микроорганизмов, выделенных с кожи подмышечных впадин у практически здоровых лиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Обследованы 77 практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 40 лет в период с сентября 2013 г. по апрель 2014 г. Из них 44 (57,1%) были женщины и 33 (42,9%) - мужчины. В качестве контрольных штаммов использовали: Corynebacterium jeikeium ATCC 43734, Corynebacterium minutissimum ATCC 23348, Corynebacterium xerosis ATCC 373 (Thermo scientific, США); Staphylococcus aureus ATCC25923, Staphylococcus aureus ATCC2075, Staphylococcus epidermidis ATCC 1228, Micrococcus luteus ATCC 7468, Streptococcus agalactiae CGB (МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского). Взятие материала с кожи подмышечных впадин осуществляли с помощью стерильных одноразовых сухих коммерческих тампонов («Copan», Италия). Доставка материала производилась в течение 2 часов с момента обследования пациентов с соблюдением температурного режима. Для стандартизации количественной оценки роста микроорганизмов клинический материал с тампона засевали по Голду тампоном на 0,5 чашки с 20% агаром с кровью крупного рогатого скота («Лейтран», Москва), в качестве агаровой основы использовали сухой питательный агар («Микроген», Махачкала). Посев осуществляли плотными непрерывными штрихами (сектор А) и рассевом калибровочной петлей 10 мкл на сектора I, II и III. Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 37°С в течении 24 - 48 часов. Для оценки качественного состава микробиоты кожи подмышечных впадин клинический материал также засевали на несколько питательных сред: кровяной агар с добавлением 20% крови крупного рогатого скота, кровяно-теллуритовый агар с добавлением 10% крови крупного рогатого скота («Микроген», Махачкала), уриселект («Bio-Rad», США), желточно-солевой агар Таблица 1. Шкала оценки степени микробной (на основе солевого агара) и агар Сабуро обсемененности Количество выросших колоний в секторах Степень микробной обсемененности (lg КОЕ/мл) А II III о о 0 0 0 < 3 10-50 0 0 0 4 100-150 о о 0 0 5 н. с. 10-50 0-5 0 6 н. с. 100-150 10-50 0 7 н. с. н. с. 50-100 о о 8 Примечание. н. с. - нельзя сосчитать. («HiMedia», Индия). Все посевы также культивировали по стандартной методике при температуре 37°С в течении 24 - 48 часов. Идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Тинкториальные свойства изучали путем окраски по Граму по общепринятой методике в соответствии с инструкцией производителя. Биохимическую идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли с помощью коммерческих биохимических тест-систем Стафитест-24 («PLIVA-Lachema Diagnostica», Чехия), для дрожжевых грибов Candida-тест («PLIVA-Lachema Diagnostica», Чехия), Pastorextmstrep - сенсибилизированный латекс для дифференциации Streptococcus групп A,B,C,D,F,G («Bio-Rad»), оптохиновый тест, тест с желчью, определение каталазной активности. Гемолитическую активность культур изучали на агаре с добавлением 5% эритроцитов барана. Видовую идентификацию трудно культивируемых микроорганизмов и корине-бактерий проводили масс-cпектрометрическим методом с использованием время пролетного масс-спектрометра BioMerieux VITEK MS MALDI-TOF («BioMerieux», Франция) с предварительной пробоподготовкой. Идентификацию выделенных коринебактерий проводили путем амплификации гена rpoB и последующего прямого секвенирования амплифицированных фрагментов согласно [8, 9]. Хромосомальную ДНК выделяли методом кипячения согласно (Маниатис Т, 1984) из 72-часовой культуры коринебактерий, выращенной на кровяном агаре. Далее одну микробиологическую петлю культуры суспендировали в 150 мкл деионизированной воды и инкубировали 20 минут при 95°С, после чего центрифугировали при 12 000 об/мин. Выявление фрагментов гена rpoB осуществляли с помощью ПЦР. Реакционная смесь содержала растворы 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,0 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого дезокси-нуклеозидтрифосфата («Fermentas», Литва) и 1UTaq-DNA полимеразы («Fermentas», Литва) в окончательном объеме 25 мкл. Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Детекцию результатов амплификации осуществляли путем постановки горизонтального электрофореза в 1,8% агарозном геле при 160 V в течение 1 часа с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Секвенирование фрагментов ДНК штаммов коринебактерий осуществляли согласно общепринятому методу Sanger F. с помощью ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA-секвенаторе («Perkin Elmer Applied Biosystems») в НИИ ФХМ ФМБА России (Москва). Результаты секвенирования обрабатывались с помощью программного обеспечения BLAST и ChromasLite (для формата хроматограммы), секвенированные последовательности сопоставляли с международной on-line базой данных EMBL/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). РЕЗУЛЬТАТЫ С целью установления количественного состава микрофлоры обследованы 33 практически здоровых человека в возрасте от 18 до 30 лет в период с февраля по апрель 2014 г. Из них 20 (60,6%) были женщины и 13 (39,4%) - мужчины. Полуколичест- Таблица 2. Полуколичественная оценка микробного роста в зависимости от количества выросших колоний при прямом посеве биоматериала от практически здоровых лиц, в перерасчете в КОЕ/мл/г Образец Количество выросших колоний в секторах Степень микробной обсемененности (lg КОЕ/мл) А II 72 ж 10-150 1 0 5 73 ж 0-10 (7) 0 0 3 74 ж 0-10 (10) 0 0 3 75ж 100-150 2 0 5 77ж 100-150 1 0 5 78ж 100-150 1 0 5 79ж 10-50 0 0 4 80м н. с. 10-50 (45) 0-5 (5) 6 81ж 0-10 (10) 0 0 3 82м 0-10 (3) 0 0 3 83ж н. с. 0-10 (10) 0 5 84ж н. с. 10-50 (23) 0 6 85ж н. с. 10-50 (48) 0-5 (5) 6 86ж 100-150 0-10 (2) 0 5 87ж 100-150 0-10 (6) 0 5 88м 100-150 0-10 (3) 0 5 89м н. с. 100-150 10-50 (48) 7 90ж н. с. 0-10 (10) 0 5 91ж 0-10 (8) 0 0 3 92м н. с. 10-50 0-5 (7) 6 93ж н. с. 100-150 0-5 (2) 6 94ж 10-50 (50) 2 0 4 95ж 100-150 0-10 (4) 0 5 96 100-150 0-10 (10) 0 5 97 10-50 (48) 0 0 4 98 100-150 0-10 (10) 0 5 99 10-50 (50) 0 0 4 100 0-10 (10) 0 0 3 101 10-50 (48) 0 0 4 102 10-50 (46) 0 0 4 103 0-10 (10) 0 0 3 104 100-150 0-10 (12) 0 5 105 10-50 (43) 0 0 4 венную оценку микробного роста провели на основе эмпирических исследований в зависимости от количества выросших колоний при прямом посеве биоматериала в перерасчете в КОЕ/мл/г согласно табл. 1. Полученные результаты суммированы в табл. 2. Видно, что у практически здоровых лиц количество выросших колоний при прямом посеве составило: в концентрации 3 lg КОЕ/мл - 18,2%, 4 lg КОЕ/ мл - 22,3%, 5 lg КОЕ/мл - 40,9%, 6 lg КОЕ/мл - 15,1% и 7 lg КОЕ/мл - 3,1%, микроорганизмы в количестве 8 lg КОЕ/мл не определялись. Следовательно, количественная оценка микробного состава микробиоты кожи подмышечных впадин у большинства практически здоровых лиц варьировала в интервале 4 - 5 lg КОЕ/мл; обсемененность кожи данной микробиоты в высокой концентрации 8 lg КОЕ/мл не обнаружено. При оценке микробного пейзажа микроорганизмов, выделенных от 77 практически здоровых лиц, идентифицировано 158 штаммов, которые принадлежали к 24 видам грамположительных микроорганизмов. Из них большинство 109 (68,9%) штаммов принадлежало к роду Corynebacterium, 34 (21,6%) штамма - к роду Staphylococcus, 12 (7,6%) штаммов - к роду Micrococcus и в единичном количестве выделены Candida albicans - 3 (1,9%) штамма. Следовательно, микробиота кожи подмышечных впадин представляет Примечание. н. с. - нельзя сосчитать. В секторе собой гетерогенную бактериальную «III» колонии отсутствуют. популяцию (консорциум) с определенной плотностью с преимущественным преобладанием грамположительных микроорганизмов. Наиболее многочисленной и разнообразной по видовому составу была группа микроорганизмов рода Corynebacterium. Учитывая, что идентификация микроорганизмов рода Corynebacterium с помощью классических микробиологических методов исследования имеет целый ряд трудностей, обусловленных сходной их метаболической активностью, основным методом идентификации является секвениро-вание фрагментов гена rpoB [1, 8, 9]. Нами с помощью комплекса классических микробиологических, масс-спектрометрических методов исследования и секвенирования проведена внутривидовая идентификация коринебактерий. Идентифицировано 109 штаммов, относящихся к 16 видам микроорганизмов этого рода. Из них наибольший удельный вес имели Corynebacterium tuberculostearicum - 44 (40,3%) штамма, Corynebacterium amycolatum - 20 (18,4%) штаммов и Corynebacterium ureicelerivorans - 16 (14,8%) штаммов, в несколько меньшем проценте случаев идентифицированы штаммы Corynebacterium xerosis - 9 (8,4%) штаммов и Corynebacterium coyleae - 5 (4,6%) штаммов. Остальные виды выделенных коринебактерий были представлены в единичных случаях: Corynebacterium afermentas - 2 (1,8%) штаммa, Corynebacterium aurimucosum - 2 (1,8%) штаммa, Corynebacterium mucifaciens - 2 (1,8%) штаммя, Corynebacterium accolens - 2 (1,8%) штаммa, Corynebacterium afermentas subspecies afermentas - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium imitans - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium afermentas subspecies lipophilum - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium variabile - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium freneyi - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium auris - 1 (0,9%) штамм, Corynebacterium lipophiloflavum - 1 (0,9%) штамм. Данные результаты свидетельствуют о многообразии коринеформых бактерий, колонизирующих этот биотоп кожи макроорганизма - идентифицировано 15,8% видов коринебактерий из 101 опубликованного в настоящее время вида микроорганизмов рода Corynebacterium [1, 2, 6, 7, 12]. В микробиоме кожи данного биотопа второй по распространенности была группа микроорганизмов рода Staphylococcus. Нами идентифицировано 34 штамма, относящихся к 6 видам микроорганизмов этого рода. Из них превалировали штаммы Staphylococcus epidermidis - 21 (61,7%) штамм и Staphylococcus hominis - 7 (20,7%) штаммов. Следующими по частоте выделения были штаммы Staphylococcus haemo-lyticus - 3 (8,9%) штамма, остальные виды встречались в единичном проценте случаев: Staphylococcus lugdunensis - 1 (2,9%) штамм, Staphylococcus caprae - 1 (2,9%) штамм и Staphylococcus capitis - 1 (2,9%) штамм. Также нами выявлено 12 (7,6%) штаммов Micrococcus luteus и 3 (1,9%) штамма Candida albicans. Примечательно, что выделение штаммов M.luteus отмечалось только в ассоциациях микроорганизмов, причем в сообществах, включающих от 4 до 8 видов микроорганизмов. Выделение штаммов C.albicans также было зарегистрировано в ассоциациях, но включающих 2 - 3 вида микроорганизмов. Полученные нами результаты подтверждают ранее проведенные на 10 добровольцах исследования [3], показавшие, что в этом биотопе наблюдается преобладание коринеформных бактерий до 30,7% и стафилококков - до 24%. Анализ микробного пейзажа показал, что у большинства (77,9%) обследуемых лиц микробиота кожи подмышечных впадин представлена консорциумами из микроорганизмов и у 22,1% лиц выделена монокультура. У 17 обследуемых лиц в монокультуре идентифицированы в одинаковом проценте случаев C.tuberculosteari-cum, C.ureicelerivorans и S.epidermidis. Анализ ассоциаций микроорганизмов в консорциумах микробиома кожи подмышечных впадин у 60 обследуемых лиц показал, что превалирующими (41,7%) были ассоциации из 3 микроорганизмов (у 25 человек). Ассоциации из 2 микроорганизмов выявлены у 3 человек (5%). Ассоциации из 4 и 5 микроорганизмов обнаружены в двух группах по 11 человек (18,3 и 18,3%, соответственно), у 7 человек (11,7%) выявлены ассоциации из 6 микроорганизмов и у 3 человек (5%) - ассоциации из 8 микроорганизмов. Наиболее часто в ассоциациях встречались штаммы C.tuberculostearicum (в 78,9% случаев), C.ureicelerivorans (в 63,1% случаев), C. amycolatum (в 31,6% случаев), С.xerosis (в 21% случаев) и C.coyleae - (в 10,5% случаев). Причем в ассоциациях преобладали штаммы C.tuberculostearicum - C.ureicelerivorans (в 36,8% случаев), C.tuberculostearicum - C.amycolatum (в 26,1% случаев). Следовательно, подтверждаются многочисленные результаты зарубежных работ, свидетельствующих о том, что поверхность различных биотопов человеческого организма представлена целыми консорциумами из микроорганизмов, находящихся в постоянном динамическом взаимодействии, сдвиг равновесия в которых приводит к развитию патологического процесса [10, 11, 13]. Количество выделенных культур было одинаковым у обследуемых женщин и мужчин. Однако в клиническом материале, полученном от мужчин, идентифицировано в 1,6 раза больше видов микроорганизмов, чем от женщин (16 против 10, соответственно), и ассоциации из микроорганизмов были выделены в два раза чаще от мужчин, чем от женщин. Следует отметить, в материале от женщин ассоциации из 2 - 3 микроорганизмов были выделены в 10,5 - 21% случаев, из 5 микроорганизмов - в 10,5% и в одном случаев - из 6 микроорганизмов, в то время как в материале от мужчин ассоциации из 2 - 3 микроорганизмов были выделены в одинаковом проценте (14,3%) случаев из 4 микроорганизмов - в 28,6% и в единичном проценте случаев - из 5 - 6 - 8 видов микроорганизмов. ОБСУЖДЕНИЕ Впервые охарактеризован микробных пейзаж культивируемых микроорганизмов биотопа кожи подмышечных впадин у практически здоровых лиц, в котором превалируют микроорганизмы рода Corynebacterium, на втором месте по частоте встречаемости выделены микроорганизмы рода Staphylococcus, в меньшем проценте случаев - штаммы рода Micrococcus и в единичном количестве выделены C.albicans. У большинства (77,9%) обследуемых лиц микробиота кожи подмышечных впадин представлена консорциумами из микроорганизмов. С помощью секвенирования идентифицировано 24 вида микроорганизмов, из которых 16 видов коринебактерий и 6 видов стафилококков. Таким образом, экосистема биотопа кожи подмышечных впадин представляет собой сбалансированную гетерогенную популяцию микроорганизмов, осуществляющих функцию колонизационной резистентности в отношении транзиторной микрофлоры. Изменение качественного и количественного состава резидентной микрофлоры кожи может рассматриваться как микроэкологические нарушения, на фоне которых могут развиваться различные патологические состояния. Знания о состоянии различных биотопов человеческого организма открывают новые пути для развития фармацевтических и косметологических разработок.

About the authors

O. Yu Borisova

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. V Aleshkin

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

N. T Gadua

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

S. S Bochkareva

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

B. A Efimov

Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, Russia

V. A Chernova

Pirogov National Medical-Surgical Centre Children’s Consultative-Diagnostic Unit

Moscow, Russia

V. A Aleshkin

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

L. I Kafarskaya

Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, Russia

S. S Afanasiev

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

E. A Voropaeva

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

E. O Rubalsky

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

M. S Afanasiev

Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia

Moscow, Russia

A. V Karaulov

Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia

Moscow, Russia

References

Supplementary files