STUDY OF SENSITIVITY OF LABORATORY ANIMALS TO A CAUSATIVE AGENT OF ARGENTINE HEMORRHAGIC FEVER

Full Text

Анализ данных литературы свидетельствует о чувствительности ряда лабораторных животных (новорожденные мыши BALB/с, крысята 10-дневного возраста, морские свинки, обезьяны (Cebus paello, Callihrix jacchus, Macaca mulatus)) к возбудителю Аргентинской геморрагической лихорадки (АГЛ) [4 - 10, 12]. Однако зарубежными специалистами до настоящего времени не был предложен наиболее адекватный вид животных для изучения эффективности создаваемых медицинских средств защиты (вакцина, иммуноглобулин, химиопрепарат, интерферон и его индуктор). Целью данной работы явилось изучение чувствительности лабораторных животных к вирусу Хунин. В эксперименте использовали вирус Хунин штамм XJ P37, полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных геморрагических лихорадок I группы патогенности НИЦ 33 ЦНИИИ с исходной биологической активностью 3,0 lg БОЕхмл-1. После освежения исходной культуры вируса Хунин в культуре клеток Vero (B) была получена биомасса возбудителя с биологической активностью 5,2 lg БОЕхмл-1. Использовали беспородных мышей-сосунков 2 - 4-суточного возраста, беспородных белых мышей отъемышей 1 - 2-недельного возраста; беспородных морских свинок массой от 200 до 250 г обоего пола; кроликов породы шиншилла массой от 1,8 до 2,5 кг обоего пола; обезьян яванских макак массой от 2 до 3 кг. Все виды животных получены из вивария НИЦ 33 ЦНИИИ, Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях лаборатории с уровнем биобезопасности Р-4 и с соблюдением «Правил работ с использованием экспериментальных животных». Умерщвление выживших животных осуществляли эфиром для наркоза. Работу проводили на постоянных линиях клеток Vero (B), GMK-AH 1(Д) трехсуточного возраста, полученных из отдела биотехнологии культур клеток НИЦ 33 ЦНИИИ. Использовали куриные эмбрионы КЭ трехсуточного возраста от кур породы леггорн. Использовали различные способы инфицирования лабораторных животных: мыши - интрацеребрально, интраназально; морские свинки - внутрибрюшинно, интраназаль-но; кролики - подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно; обезьяны - внутримышечно. Специфичность гибели животных подтверждали методом негативных колоний в монослое культуры клеток GMK - AH - 1 (Д) под агаровым покрытием, инфицированной суспензией головного мозга мышей-сосунков или печени морских свинок и кроликов соответственно. Животное считали погибшим специфически, если на инфицированном монослое образовывались негативные колонии. У морских свинок, кроликов, обезьян измеряли ректальную температуру в течение 21 суток, отбирали пробы крови для определения вирусемии и вируснейтрализующих антител. За клиническими проявлениями инфекции наблюдали в течение 30 суток (период наблюдения). В динамике оценивали уровень накопления вируса в пробах головного мозга живых и погибших мышей-сосунков и отъемышей при инфицировании в головной мозг и интраназально. Наличие вируса в моче мышей отъемышей определяли через 21 сутки после интраназального введения 2х103 БОЕ вируса Хунин. Уровень накопления вируса в пробах печени, селезенки, легкого живых и погибших морских свинок оценивали в динамике после внутрибрюшинного и интраназального инфицирования. В желточный мешок КЭ вводили по 0,5 мл разведений инфицирующего материала. Инкубирование КЭ проводили в течение 10 суток при температуре от 36,5 до 37,5°C и относительной влажности от 50 до 60%. Инфицированные КЭ отбирали на 2, 4, 6, 8, 10 сутки после заражения и хранили в холодильнике при температуре от 2 до 6°C до проведения исследований. Постановку реакции нейтрализации осуществляли в модификации: разведения сыворотки - постоянная доза вируса [2]. Концентрацию вируса в партиях с иммунной и контрольной сыворотками крови определяли подсчетом негативных колоний на монослое клеток GMK - AH-1 (Д) под агаром. Титр вируснейтрализующих антител (ВНА) определяли как величину наибольшего разведения антисыворотки, подавляющей количество негативных колоний на 50 % и более по сравнению с контролем (нормальной сывороткой крови животного). Уровень накопления вируса в вируссодержащих материалах определяли подсчетом негативных колоний на монослое клеток Vero (B) или GMK- AH-1 (Д) под агаром. Определение биологической активности вируса Хунин при титровании на культурах клеток проводили по методике Кербера в модификации И.П. Ашмарина [1]. При оценке экспериментальной формы инфекции АГЛ установлено, что лабораторные животные на введение вируса Хунин реагируют различно. У морских свинок, инфицированных внутрибрюшинно или интраназально, лихорадочная реакция была выявлена в 62,5 - 100% случаев. Гибель морских свинок при внутрибрюшинном и интраназальном способах заражения была примерно одинаковой и составляла от 12,5 до 50%. Летальность у кроликов при внутрибрюшинном и подкожном способах инфицирования составила 18,7 и 33,3% соответственно при высоком уровне лихорадки (от 81,3 до 100%). При внутримышечном инфицировании вирусом в очень высокой дозе (1,0х105 БОЕ) у половины взятых в опыт кроликов фиксировали только повышенную до 40,1°C температуру при отсутствии гибели животных. Невысокой летальностью (от 12,5 до 50%) отреагировали мыши отъе-мыши на интраназальное инфицирование вирусом в дозах от 2,0х102 до 2,0х103 БОЕ. При инфицировании в мозг мышей отъемышей вирусом Хунин в дозе 0,4 БОЕ летальность составила 12,5% случаев. Такой же эффект наблюдали у этих животных при интраназаль-ном введении вируса в дозе, в 500 раз превышающей вводимую интрацеребрально. У мышей-сосунков при интрацеребральном способе инфицирования в дозе 2,0х103 БОЕ летальность составила 37,5%, в то время как при интраназальном инфицировании гибель отсутствовала. Обезьяны яванские макаки на внутримышечное заражение вирусом в дозе 1,0х104 БОЕ не отреагировали. Для выявления вируса Хунин в головном мозге белых мышей в динамике инфекции оценивали накопление возбудителя на 6, 7 и 8 сутки после заражения. У мышей-сосунков и отъемышей возбудитель накапливался не выше 3,3 lg БОЕхг-1. У инфицированных морских свинок возбудитель выявляли в крови, тканях печени, селезенки, легкого. При интраназальном заражении дозой 2,5х104 БОЕ в печени погибших животных вирус накапливался до 4,0 lg БОЕхг-1, в селезенке и в легком - до 2,4 - 2,5 lg БОЕхг-1. Максимальный уровень накопления (5,3 lg БОЕхг-1) вируса Хунин был выявлен в печени погибших и умерщвленных морских свинок на 8 сутки при внутрибрюшинном заражении. В селезенке морских свинок уровень накопления вируса составил 4,2 lg БОЕхг-1. При оценке накопления вируса Хунин в КЭ было выявлено, что репродукции вируса в КЭ практически не происходит: даже после введения в желточный мешок 5,3 lg БОЕ концентрация вируса в пределах срока наблюдения постоянно снижалась. Изучение чувствительности лабораторных животных к возбудителю АГЛ и выбор наиболее чувствительного вида животного необходимы для оценки эффективности создаваемых медицинских средств защиты в отношении данной аренавирусной инфекции. В связи с невысоким уровнем накопления вируса Хунин в головном мозге мышей их целесообразно использовать лишь для поддержания возбудителя в лабораторных условиях и приготовления музейных культур, поскольку эти животные наиболее близки к естественным хозяевам возбудителя АГЛ [6]. В наших экспериментах при инфицировании мышей вирус Хунин выделялся от животных с мочой в течение, как минимум, 21 суток (срок наблюдения). Полученные результаты согласуются с данными литературы [3], свидетельствующими о том, что при интраназальном инфицировании взрослых СаЬшш musculinus с 21 по 150 день у половины животных выявлены персистенция вируса и его выделение с мочой и слюной. Это свидетельствует о высокой эпидемиологической опасности инфицированных грызунов как распространителей АГЛ в естественных условиях. У яванских макаков при внутримышечном инфицировании вирусом Хунин штамм XJ P37 в течение всего периода наблюдения не было выявлено внешних признаков заболевания. Это обстоятельство свидетельствует о том, что данный штамм вируса Хунин ави-рулентен для обезьян яванских макаков. В то же время, в зарубежной литературе [12] представлены данные о выраженной реакции обезьян Cebus paello, Callihrix jacchus, Macaca mulatus на инфицирование культурами штаммов XJ и Romero, из чего следует, что использование яванских макаков для моделирования АГЛ с использованием культуры штамма XJ P37 вируса Хунин нецелесообразно. Обезьяны, кролики и морские свинки отреагировали выработкой вируснейтрализую-щих антител в сыворотке крови, взятой на 21 день после инфицирования, что согласуется с данными литературы [11] об иммунном ответе животных на введение вируса Хунин. Проведенные исследования по оценке чувствительности лабораторных животных к возбудителю АГЛ позволяют сделать следующие выводы: интрацеребрально зараженные мыши могут быть использованы для поддержания культур штаммов возбудителя; внутри-брюшинно или интраназально инфицированные морские свинки вирусом Хунин в высоких дозах могут использоваться для получения вируссодержащих культур и моделирования проявления инфекции у человека; внутримышечно инфицированные кролики могут использоваться для получения гипериммунных сывороток.

About the authors

S. I Syromyatnikova

V. B Pantyukhov

I. V Shatokhina

M. A Timofeev

T. E Sizikova

C. V Borisevich

References

Supplementary files