DECELERATION OF BACTERIAL GROWTH IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA CULTURES IN THE PRESENCE OF COPPER AND ZINC CATIONS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Токсическое действие катионов меди и цинка на микроорганизмы служит, как известно, одним из важных факторов защиты организма хозяина от патогенных бактерий [5, 16, 18]. В свою очередь, выживаемость Mycobacterium tuberculosis в фаголи-зосомах напрямую связывают с активностью систем эффлюкса бактериальной клеткой катионов меди и цинка, а способность бактерий к детоксикации по тяжелым металлам выступает одним из механизмов обеспечения их вирулентности [5, 9]. В реализации своего токсического действия катионы меди и цинка могут замещать атомы других металлов в каталитических центрах бактериальных белков [5], ингибировать включение клетками Staphylococcus aureus катионов кобальта и никеля [13], конкурировать между собой за сайты связывания и проявлять функциональный антагонизм [14], опосредовать прямое бактерицидное действие [18]. Как показывают результаты наших предшествующих исследований, даже в наномолярных концентрациях катионы меди и цинка в свободном виде или в связанном белками у-глобулиновой фракции состоянии реализуют бактериостатическое действие в культуре клеток S.aureus, а медь - и в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa [4], считающихся высокорезистентными к меди [16] и обладающих мощными системами экспорта металла [12]. Зарегистрировать действие катионов цинка в культуре P.aeruginosa не удается [4]. При этом, чувствительность систем индукции толерантности к меди у бактерий необычайно высока [8]. Она превосходит чувствительность к цинку: в клетках Escherichia coli фактор транскрипции CueR индуцирует экспрессию генов толерантности при концентрации меди 10-21 М, т.е. менее одного атома на клетку [8, 19], тогда как наиболее чувствительные к цинку сенсорные белки E.coli Zur и ZntR характеризуются аффинностью на уровне 10-15 М [19]. Кроме того, репрессия импортера цинка ZnuC в условиях длительного присутствия металла отмечается у E.coli при более низких концентрациях цинка, чем индукция экспортера ZntA [20]. Сказанное позволяет обосновать предположение о существовании определенного концентрационного диапазона, в котором при прочих равных условиях катионы меди будут подлежать активному экспорту или детоксикации секвестрированием внутри бактериальной клетки, а катионы цинка смогут реализовать свое антибактериальное действие. Целью работы явилась оценка антибактериального действия миллимолярных концентраций катионов меди и цинка, примененных в виде сульфатов или хлоридов, в культурах S.aureus и P.aeruginosa. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Первичные культуры бактерий S.aureus и P.aeruginosa получены принятым методом посева патологического биоматериала человека на элективные и селективные питательные среды [1]. В работе использовали пять клинических изолятов S.aureus и три клинических изолята P.aeruginosa. Для постановки реакций стандартизованную суспензию бактерий, полученную из суточных культур S.aureus и P.aeruginosa и содержавшую 108 КОЕ/мл, засевали газоном из объема 1,0 мл суспензии в физиологическом растворе на стандартные стерильные чашки Петри диаметром 90 мм с питательным агаром Nutrient Agar (HiMedia Lab.). Спустя 30 мин на поверхность газона с использованием 36-канального штампа-репликатора с диаметром наконечников 2,0 мм каплями объемом по 5 мкл наносили солевые растворы - сульфат меди CuSO4 x 5H2O, сульфат цинка ZnSO4 х 7H2O, хлорид меди CuCl2 x 2H2O и хлорид цинка ZnCl2 в 0,15 М NaCl (pH 7,21 - 7,43) с концентрацией по катионам металлов от 10-9 или 10-6 М до 5х10-1 М. На препаративном этапе исследования маточные растворы солей стерилизовали методом мембранной фильтрации с использованием насадок для водно-солевых растворов Millex с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore), после чего готовили серии последовательных разведений маточного образца в 0,15 М растворе NaCl, служившим внутренним контролем системы. После нанесения солевых растворов каплями на газон содержавшие культуры бактерий S.aureus и P.aeruginosa чашки Петри инкубировали в течение 16 - 18 час при 37°С. По истечении срока инкубации результат реакции учитывали, определяя диаметр зоны задержки роста культуры с использованием угловой линейки Partigen (Behringwerke AG). На каждом газоне реакцию бактерий на серию разведений соли металла воспроизводили трижды. Для каждого клинического изолята бактерий использовали при этом не менее двух параллельных чашек Петри. Для проверки наличия (отсутствия) в зонах задержки роста культур жизнеспособных бактерий и установления вклада бактерицидного компонента в действие солей металлов из центра зоны задержки роста микробиологической петлей диаметром 1,0 мм производили посевы материала в пробирки, содержавшие по 5,0 мл питательного бульона Nutrient Broth (HiMedia Lab.). Образцы термостатировали в течение срока от одних до пяти суток при 37°С, после чего оценивали прозрачность питательного бульона в сравнении с контрольным (стерильным). В ходе экспериментов кислотность 0,15 М раствора NaCl контролировали с помощью базового электронного рН-метра Sartorius PB-11, укомплектованного электродом Sartorius PY-P11. При математической обработке результатов исследования достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ Как показывают результаты, представленные на рис. 1, в культуре клеток S.aureus катионы меди и цинка, примененные в виде сульфата (рис. 1А) или хлорида (рис. 1Б) в миллимолярных концентрациях, реализуют выраженное антибактериальное действие, интенсивность которого при 10-кратном (с 50 до 500 мМ) повышении содержания катионов металлов в среде культивирования увеличивается в 1,5 - 2,3 раза (р<0,001 - 0,1). В отдельных случаях при низких концентрациях металлов в просвете зоны задержки роста наблюдали появление отдельных мелких колоний; однако сам просвет оставался заметно осветленным или абсолютно чистым, граница зоны определялась четко и позволяла характеризовать зону по ее диаметру. В микро- и наномолярных концентрациях катионов действие металлов не обнаруживалось. Обращает на себя внимание более выраженное, чем в присутствии меди, торможение роста бактерий S.aureus катионами цинка (рис. 1). В диапазоне концентраций металлов от 50 до 500 мМ активность сульфата цинка в 1,3 - 1,6 раза (р<0,001 - 0,05) превосходит действие сульфата меди (рис. 1А). Аналогично при концентрациях катионов 100 и 500 мМ действие хлорида цинка в 1,2 - 1,6 раза (р<0,02) превосходит эффекты хлорида меди (рис. 1Б). Действие катионов цинка усиливается при 10-кратном (с 50 до 500 мМ) повышении содержания металла в среде культивирования тоже более заметно, чем действие меди. Если для катионов меди прирост составляет по кратности 1,5 - 1,8 раза (р<0,001 - 0,1), то в условиях применения цинка размер зоны задержки роста бактерий увеличивается в 2,2 - 2,3 раза (р<0,001). Результат свидетельствует о специфичности действия катионов цинка по отношению к меди и(или) катионов меди по отношению к цинку в культуре S.aureus. При этом именно катионы ответственны за реализацию механизмов антибактериального эффекта. В пользу данного положения говорит практически полное соответствие Рис. 1. Торможение роста культуры S.aureus в присутствии миллимолярных концентраций катионов меди (1) и цинка (2), М±m, n=5 или n=10. Здесь и на рис. 2 по оси абсцисс: концентрация катионов металлов, мМ; по оси ординат: диаметр зоны задержки роста, мм. А - водные сульфаты меди (II) и цинка; Б - водный хлорид меди (II) и хлорид цинка. *р<0,05; **р<0,02; ***р<0,001 по сравнению с показателями меди. Рис. 2. Торможение роста культуры P.aeruginosa в присутствии миллимолярных концентраций катионов меди (1) и цинка (2), М±m, n=3 или n=6. *р<0,1 по сравнению с показателями меди; **р<0,05 по сравнению с показателями цинка. концентрационной зависимости, полученной в условиях смены аниона в составе соли металла. Это заключение правомочно и для цинка, и для катионов меди. Даже отсутствие действия катионов цинка при концентрации металла 10 мМ и, наоборот, торможение роста бактерий в присутствии меди отмечаются в условиях применения как сульфата, так и хлорида цинка и меди, соответственно. Посевы материала из зон задержки роста культуры S.aureus обнаруживают помутнение питательного бульона в пробах, содержавших образцы из лунок, обработанных сульфатом и хлоридом цинка, и соответствующую контрольной прозрачность питательного бульона в пробах, содержавших образцы из лунок, обработанных сульфатом и хлоридом меди. Аналогично культуре S.aureus в отношении клеток P.aeruginosa катионы меди и цинка, примененные в миллимолярных концентрациях в виде сульфата или хлорида, реализуют антибактериальное действие, интенсивность которого при 10-кратном (с 50 до 500 мМ) повышении содержания катионов металлов в среде культивирования увеличивается в 1,5 - 1,9 раза (р<0,001 - 0,01) (рис. 2). В отдельных случаях при низких концентрациях металлов результат реакции характеризовался просветлением зоны задержки роста, появления отдельных мелких колоний при этом не наблюдали. В микро- и наномолярных концентрациях катионов действие металлов не обнаруживалось. В отличие от стафилококков, в культуре P.aeruginosa обращает на себя внимание соизмеримая с эффектами цинка активность катионов меди, примененных в виде сульфата, которая при концентрации металла 500 мМ даже превосходит на 10% антибактериальное действие цинка (р>0,1) (рис. 2А). Использование меди в виде хлорида позволяет получить при концентрации металла 500 мМ торможение роста бактерий в 1,2 раза (р<0,05), превосходящее активность катионов цинка (рис. 2Б). Действие катионов меди усиливается при 10-кратном (с 50 до 500 мМ) повышении содержания металла в среде культивирования P.aeruginosa более заметно, чем действие цинка. Если для катионов цинка прирост составляет по кратности 1,5 - 1,6 раза (р<0,001 - 0,01), то в условиях применения меди размер зоны задержки роста бактерий увеличивается в 1,8 - 1,9 раза (р<0.001). Полученные в культуре P.aeruginosa данные обнаруживают определенную роль аниона, входящего в состав соли металла, в реализации ингибирующего действия катионов меди. Хлорид анион выделяют в ряду других галогенид-ионов как обладающий наименьшим дестабилизирующим, денатурирующим и высаливающим действием, в наименьшей степени затрагивающим нативные конформации биомакромолекул [2]. Замена в опытах с медью сульфата на хлорид позволяет получить усиление ингибирующего эффекта в отношении P.aeruginosa при концентрации соли 100 мМ по металлу в 1,2 раза (р<0,05). По-видимому, массивный и более сложный по структуре сульфат анион сам может взаимодействовать со структурами бактериальной стенки и создавать тем самым стерические препятствия катионам меди, реализующим собственное антибактериальное действие. В условиях применения хлорид аниона катионы меди таких препятствий не испытывают. Посевы материала из зон задержки роста культуры P.aeruginosa, как и в опытах на клетках S.aureus, обнаруживают помутнение питательного бульона в пробах, содержавших образцы из лунок, обработанных сульфатом и хлоридом цинка, и соответствующую контрольной прозрачность питательного бульона в пробах, содержавших образцы из лунок, обработанных сульфатом и хлоридом меди. Результат позволяет заключить, что действие катионов меди в культурах S.aureus и P.aeruginosa реализуется как бактерицидное, в то время как эффекты катионов цинка представляются по механизму бактериостатическими. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные в работе данные открывают несколько аспектов антибактериального действия катионов меди и цинка в культурах S.aureus и P.aeruginosa. Они могут рассматриваться с нескольких позиций и определять ряд новых направлений дальнейшего научного поиска, тем более что предсказуемость результата исследования на этапе постановки задачи во многом не была очевидной. Действительно, если преодоление катионами меди резистентности P.aeruginosa и реализация бактерицидного действия полностью соответствуют представлениям о высокой редокс-активности металла, его способности выступать в биологических системах в роли мощного окислителя и отчасти дестабилизировать взаимодействующие с ним биомакромолекулы, то очевидно, что вклад окислительно-восстановительных реакций в эффекты катионов цинка в большинстве своем отсутствует, поскольку цинк, как хорошо известно, в эти реакции не вовлечен. В то же время, антибактериальное действие катионов цинка, оцениваемое по зонам задержки роста, сопоставимо с эффектами катионов меди в культуре P.aeruginosa, а в культуре S.aureus заметно превосходит последние, что, с одной стороны, выглядит достаточно неожиданным, а с другой - требует детального анализа механизмов, определяющих возможность реализации подобных эффектов, пусть даже вклада бактерицидного компонента в антибактериальное действие катионов цинка не просматривается. Во вводной части работы приведены механизмы, формирующие концентрационный диапазон, в котором эффекты катионов цинка в отношении бактериальных клеток могут превалировать над действием катионов меди. Эти механизмы связаны с различной активностью транскрипционных факторов, индуцирующих экспрессию у бактерий генов импортеров и экспортеров цинка [20], с различной чувствительностью сенсорных бактериальных белков к катионам меди и цинка [8, 19], со специфическим ингибированием катионами цинка включения бактериями катионов кобальта и никеля, существенно значимых в вирулентности стафилококков [13]. Однако в первых двух случаях речь идет о концентрациях цинка, не превышающих 10-15 М [19], в последнем - о микромолярных концентрациях порядка 20 мкМ [13], т.е. о концентрациях, в 500 раз меньших, чем минимальные, действующие в настоящем исследовании. Они, как и механизмы их реализации, конечно, могут вносить известный вклад в развитие общего антибактериального эффекта миллимолярных дозировок катионов меди и цинка в отношении S.aureus и P.aeruginosa, но не будут определять исход воздействия в целом, поскольку количество катионов в среде культивирования, реализующих в данной работе антибактериальное действие, многократно превосходит уровень чувствительности описанных молекулярных механизмов реакций [8, 13, 19, 20]. Вопрос о действии катионов цинка в культуре S.aureus, следовательно, остается открытым. Попробуем для его разрешения рассмотреть цинк в биологических системах как металл, оппозитный по свойствам меди, и прописать его бактериостатическое действие, в отличие от редокс-активной и дестабилизирующей меди, с позиций стабилизации биомембран и биомакромолекул. Известно, что активность многих поверхностных белков и факторов вирулентности патогенных бактерий зависит от присутствия катионов цинка [17]. Распределенный в периклеточном пространстве цинк с высокой аффинностью связывается поверхностными белками бактерий и формирует стабильные металлокомплексы, образование которых создает структуру с минимальной необходимой пространственной потребностью [15]. Она настолько энергетически выгодна, что образование белковых металлокомплексов, в принципе, не требует экспрессии белком специализированных сайтов связывания металла [15], которое рассматривают как наиболее сильное в ряду всех нековалентных химических взаимодействий [10]. Образование металлокомплексов белков с минимальной свободной энергией может происходить не только за счет свободных катионов металлов, но очевидно, и в результате их перехвата у менее мощных хелаторов, присоединяющих металл на внешние связи макромолекулы с относительно невысокими константами связывания [3]. Формирующаяся в результате связывания катионов цинка поверхностная структура бактериальной клетки будет претерпевать выраженные конформационные преобразования и стабилизироваться связанным цинком в пространственной конфигурации, открывающей, как свидетельствуют результаты исследований [10, 15], новые исходно недоступные металлу сайты связывания меди. Катионы меди в условиях их присутствия в культуральной среде в свободном или относительно непрочно связанном по поверхностным структурам макромолекул состоянии получают тогда возможность быть хелатированными на стабилизированные цинком белковые молекулы клеточной стенки бактерий и атаковать последние по новым связывающим медь сайтам, реализуя характеристическую редокс-активность и проявляя дестабилизирующие свойства. Следовательно, в совокупном антибактериальном действии катионов цинка нельзя исключать компоненту, связанную с эффектами катионов меди, включая прямое бактерицидное действие металла. Это - первое важное обстоятельство, хотя его вклад в ингибирующие эффекты цинка, по понятным причинам, во многом зависит от состава питательной среды или периклеточного пространства. Второе не менее, а может быть, и более важное обстоятельство состоит в том, что одним из вариантов получения белковой структуры с минимальной необходимой пространственной потребностью и, следовательно, минимальной свободной энергией выступает образование надмолекулярных форм (агрегатов) белка [15]. Аналогично образованию мономерных металлокомплексов оно не требует экспрессии макромолекулой специализированных металлосвязывающих сайтов и нарастает по интенсивности пропорционально повышению концентрации металла [15], т.е. в определенном смысле более соответствует условиям проведения настоящего исследования. При миллимолярных концентрациях цинка агрегируют бактерии Streptococcus sanguis и Streptococcus mutans [7]. Связываясь со структурами бактериальной стенки и стабилизируя поверхностные белки бактерий, цинк вызывает формирование крупных асимметричных агрегатов, которые не образуются в условиях чисто белокбелковых взаимодействий [7]. Очевидно, что бактерии при этом обретают качественно новое, структурно «жесткое» состояние своей клеточной стенки и могут поэтому испытывать серьезные проблемы с обеспечением метаболических процессов, реализующихся с участием структур клеточной стенки, в первую очередь - процессов транспорта, конкретно - экспорта, т.е. проблемы с реализацией механизмов толерантности и детоксикации по тяжелым металлам. Жесткость структур, образуемых в результате агрегации поверхностных белков бактерий, столь велика, что вызываемая хелатированием двух-трех катионов цинка на молекулу белка димеризация G5 доменов поверхностного протеина стафилококков, ответственного за формирование биопленок, предотвращает образование последних у метициллинрезистентных Staphylococcus epidermidis и S.aureus [6], лишая тем самым бактерии всех уровней и степеней защиты от внешних воздействий, которые они приобретают в составе бактериального сообщества (биопленки) [6]. Агрегирование белков во внутриклеточных компартментах бактериальной клетки рассматривают в качестве одного из факторов старения, ведущих к гибели E.coli [11]. Сказанное подтверждает наличие у катионов цинка собственных отсутствующих у меди и, по-видимому, не реализуемых медью механизмов антибактериального действия в культуре S.aureus. Они связаны с образованием в присутствии цинка стабильных белковых металлокомплексов и агрегатов [6, 7, 10, 11, 15, 17] и могут вносить с учетом присутствия достаточного количества свободного или лабильного цинка в жидкостях и тканях организма существенный вклад в поддержание резистентности хозяина к бактериальным патогенам. Совершенно новое содержание в этом контексте получает первичная реакция ткани на любое повреждение или воспаление, которая реализуется за счет дегрануляции тромбоцитов и выброса в периклеточное пространство значительного, многократно превышающего физиологическое, количества свободного цинка. Бактерии S.aureus оказываются при этом более чувствительными к ингибирующему действию катионов цинка, оцениваемому по зонам задержки роста, чем P. aeruginosa. В культуре S.aureus эффект воздействия катионов цинка при сравнении соответствующих по анионному составу солей превосходит активность металла против бактерий P.aeruginosa в 1,2 - 1,8 раза (р<0,001 - 0,1). В свою очередь, в том же алгоритме сравнения P.aeruginosa проявляют более высокую толерантность как к цинку, так и к меди, хотя в сформировавшихся в присутствии катионов меди зонах задержки роста культуры жизнеспособные бактерии P.aeruginosa, как и S.aureus, отсутствуют. Следовательно, резистентность бактерий P.aeruginosa к действию катионов меди преодолима и, таким образом, не абсолютна. В работе достигнут концентрационный диапазон, в котором по зонам задержки роста клетки P.aeruginosa проявляют в 1,2 раза (р<0,05) более высокую чувствительность к антибактериальному действию катионов меди, чем цинка.

About the authors

S. B Cheknev

Moscow, Russia

E. I Vostrova

Moscow, Russia

M. A Apresova

Moscow, Russia

L. S Piskovskaya

Moscow, Russia

A. V Vostrov

Moscow, Russia

References

Supplementary files