PROTEIN PROFILE STRAIN SPECIFICITY OF BIFIDOBACTERIUM GENUS MEMBERS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Если принять, что бифидобактерии являются «ключевыми» игроками кишечной микробиоты, то станет понятен всеобщий интерес к микробиоте кишечника человека, вовлеченной в нашу всеобщую «гонку» за здоровьем. Значительная доля этого успеха принадлежит скромным «труженикам» - бифидобактериям, которые сопровождают нас практически всю жизнь. Именно эти микроорганизмы обеспечивают «устойчивость к заселению» (колонизации), и мы по праву считаем их «своими», а они препятствуют заселению тканей и органов человека другими патогенными возбудителями. Почему выбор эволюции пал на эти микроорганизмы? Чем они лучше других? Почему именно они стали доминантной микрофлорой и оказывают нам постоянную помощь? Прямого ответа на этот вопрос пока нет, но можно допустить, что их генетический «паспорт» в наибольшей степени удовлетворяет нашу «цензорную» службу, не вызывая у нее особого протеста. Вместе с тем, при изучении генотипической характеристики бифидофлоры мы обратили внимание на штаммовую специфичность бифидобактерий. Современные методы исследования и описания генома и метаболома микроорганизмов свидетельствуют о том, что один и тот же вид микроорганизмов варьируется по составу генов и метаболическому профилю, благодаря чему, за счет объединения в популяции одного вида и экономии ресурсов микробной клетки, реализуется единая адаптивная стратегия в разных условиях среды [3]. Известно, что развитие изолированных лимфоидных фолликул специализированных кишечных структур, составленных из дендритных клеток и агрегатов В-клеток, зависит от микробиоты [15]. А если учесть, что популяции кишечных иммунных клеток «требуют» микробиоту с ее бифидобактериями для своего развития и функционирования, то очевиден огромный вклад микробиоты, а с ней и бифидофлоры в развитие иммунной системы, предоставляющей место жительства этим комменсаль-ным микроорганизмам. Это значит, что механизмы хозяина и микробиоты вовлечены в тесное сотрудничество для своего синергидного существования в целях сохранения симбиоза. В настоящее время в России и за рубежом активно развиваются новые подходы не только к изучению и описанию физиологии микроорганизмов, в том числе бифидобактерий, с использованием достижений и методов протеомики - области современной биологии, занимающейся инвентаризацией белков живых организмов, изучением их экспрессии и взаимодействия в клетке в различных физиологических состояниях. В частности, использование знаний о геноме и протеоме микроорганизмов в совокупности с масс-спектрометрическим анализом белков (MALDI) делает возможным определение характерного спектра белков (биомаркеров) микроорганизмов как на уровне вида, так и штаммового разнообразия, позволяя узнавать бактерии по принципу «фингерпринта» (отпечатка пальца) [7]. Данный подход был впервые применен для исследования популяции Neisseria gonorrhoeae [6]. В литературе даны протеометрические характеристики штаммов Vibrio spp., Legionella spp., Bacillus spp., Escherichia coli, Actinomyces spp., Peptostreptococcus spp., Prevotella spp., Fusobacterium spp. и дрожжевых грибов [8, 12]. В настоящее время имеются единичные данные прямого белкового профилирования бифидобактерий, которые представлены в работе [11] по определению четырех белковых маркеров L1, L2, A1 и A2 для культур Bifidobacterium animalis. Учитывая важную регуляторную роль бифидобактерий в организме человека, мы поставили цель - проанализировать различия белкового спектра у различных штаммов бифидобактерий кишечного микросимбиоценоза с использованием результатов идентификации на масс-спектрометре MALDI-TOF. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В настоящей работе приведены результаты масс-спектрометрии 57 штаммов Bifidobacterium spp., изолированных при обследовании пациентов на дисбиоз толстого кишечника. Исследуемые штаммы культивировали на агаризованной Шедлер среде (BBL, США) в течение 48 часов в анаэробных условиях при температуре 37°C. Масс-спектрометрический анализ был осуществлен на базе Тюменского НИИ краевой инфекционной патологии с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра «Microflex» («Bruker Daltonics», Германия). Подготовку образцов и масс-спектрометрический анализ проводили согласно стандартной методике, разработанной фирмой «Bruker Daltonics» для идентификации микроорганизмов посредством программного обеспечения Biotyper (Freiwald, Sauer, 2009). Для получения каждого масс-спектра суммировали данные 500 лазерных импульсов с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона от 1000 до 18 000 m/z (масса на заряд). Внутреннюю калибровку указанного диапазона проводили с использованием точных значений масс реперных белков бифидобактерий. При анализе белковых спектров бифидобактерий учитывали численный рейтинг точности идентификации, представленного в виде логарифмической шкалы от 0 до 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Предварительно проведенные тесты выявили широкое варьирование белковых спектров у разных видов бифидобактерий, что может быть использовано для определения внутривидовых биомаркеров штаммоспецифичности и, как следствие, оперативной идентификации микроорганизмов. В зависимости от вида бифидобактерий в исследуемом диапазоне масс-спектрометрии регистрировали разнообразное количество маркеров (от 4 до 56). На масс-спектрах культур, которые были идентифицированы как B. bifidum, количество спектров варьировало от 4 до 37, для дендрограмм B. longum было характерно 26 - 56 пиков, для B. adolescentis - 3 - 16 пиков, для B. animalis - 20 и для B. dentium - 40 пиков. Лимит разброса пиков также различался у разных видов бифидобактерий: у B. bifidum нижний и верхний пределы обнаружения спектров белков составляли соответственно 1156 и 10 385 m/z, у B. longum - 1157 и 13 278, у B. adolescentis - 2524 и 3586, у B. аnimalis - 4376 и 10 079 и B. dentium - 1140 и 10 368 m/z. Пики более 10 000 m/z регистрировались у 9 штаммов B. longum, 3 штаммов B. bifidum и 1 штамма B. dentium. Пики в диапазоне 5006 - 5737 и 9285 - 9955 m/z были специфичны для 88±4,3% и 96±2,6% штаммов бифидобактерий соответственно (рис.). Эти результаты отражают их тесное филогенетическое родство и совпадают с результатами других исследователей [9, 14]. Оказалось, что более 30 - 50% из рассматриваемых вершин имеют разную массу, что определяет потенциальные маркеры для дискриминации рода и видов Bifidobacterium spp. У представителей В. bifidum массы основных пиков ионов биомаркеров наблюдали в диапазоне от 200 до 18 000 m/z: 1157:5389, 1157:5390:9838, 5382:6778, 5392:6385:9631, 5387:7500, 1157:5388:7501, 5393:9846; у культур B. longum - 3570:5304, 5377:9823, 3082:5391:9824, 3570:5392:9826; штаммов B. adolescentis - 2524:3586, 3790:5320; у культур B. 8nimaHs - 4376:6954:8120:9796 и B. dentium - 1140:6466:9826 m/z. В работе [13] H. Sato et al. по результатам MALDI-TOF MS провели дифференци-ровку вида Bifidobacterium longum при изучении масс-спектров их рибосомаль-ных белков. MALDI масс-спектры Bifidobacterium spp. Сверху вниз: B. longum, B. bifidum, B. ado-lescentis, B. dentium, B. animalis. Стрелками указаны характерные пики (биомаркеры) для каждого вида Bifidobacterium spp. Метки указывают общие биомаркеры в диапазоне 5006-5737 и 9285-9955 m/z для рода Bifidobacterium. Известно, что существенные отличия биомаркеров отмечаются и среди микроорганизмов, принадлежащих к одному виду, что было описано для масс-спектров штаммов Bacillus cereus [12]. Наши результаты масс-спектрометрии подтвердили эти выводы для бифидофлоры. Так, для штаммов вида B. bifidum у 67±7,5% культур выявлено наличие пиков в диапазоне 9282-9901 m/z, тогда как в других диапазонах оказались существенные различия в наблюдаемых белковых спектрах. Масс-спектр штамма B. bifidum 310 содержал только четыре пика в диапазоне от 7484 до 7502 m/z по сравнению с 28 пиками в спектре штамма B. bifidum 15. Тем не менее, все четыре пика были сопоставлены с молекулярной массой белков в базе данных. На масс-спектре штамма B. bifidum 85 отмечались 17 пиков массы основных ионов биомаркеров, наблюдаемые в широком диапазоне от 140 до 10 385 m/z. Спектры, полученные из образцов B. bifidum 15, более разнообразны (28 спектров) и регистрировались в диапазоне от 162 до 9839 m/z. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты подтверждают известное мнение, что штаммоспецифичность микроорганизмов определяет их различные эффекты. К настоящему времени появились убедительные доказательства штаммоспецифичности действия пробиотических бифидобактерий. Так, в ходе экспериментального исследования O. Menard et al. [10] установили, что разные виды B. longum действуют на состояние иммунитета новорожденных безмикробных мышей разнонаправленно: B. longum CUETM-85 в микробной ассоциации индуцировали продукцию цитокинов Th2 лимфоцитов, в то время как B. longum NCC2705 индуцировали продукцию цитокинов Th1 лимфоцитов. Штаммоспецифические эффекты бифидобактерий J. Aires et al. [5] связывают с различиями протеома штаммов B. longum. При сравнении биологических свойств и эффектов на клетки иммунной системы цитозольных белков трех изолятов из организма человека B. longum и пробиотического штамма B. longum NCC2705 было обнаружено, что белковое разнообразие штаммов связано с различиями в спектре ферментов, прямо или косвенно участвующих в синтезе клеточной стенки, и процессами биогенеза мембран бифидобактерий. Штаммы, синтезирующие RmlB1 DTDP-глюкоза 4,6-дегидратазы BL0228 DTDP-4-кето-6-дезоксиглюкозы-3,5-эпимеразы/DTDP-4-кето-L-рамнозы редуктазы, фермент GalT, UDP-галактозы, имеющие значение в синтезе углеводов клеточной стенки и экзополисахаридов, обладали лучшей способностью к аутоаггрегации, большей гидрофобностью поверхности и индуцировали Т-хелперы 2 порядка в отличие от штаммов, имеющих другой ферментативный спектр, низкую гидрофобность поверхности и индуцирующих Т-хелперы 1 порядка. Это исследование показало, что протеомный подход позволяет понять различные эффекты бифидобактерий и оценить пробиотический потенциал штаммов внутри вида. Вместе с тем, при изучении генотипической характеристики бифидофлоры мы обратили внимание на штаммовую специфичность бифидобактерий. Современные методы исследования и описания генома и метаболома микроорганизмов свидетельствуют о том, что один и тот же вид микроорганизмов варьируется по составу генов и метаболическому профилю, благодаря чему за счет объединения в популяции одного вида и экономии ресурсов микробной клетки реализуется единая адаптивная стратегия в разных условиях среды. Аналогичный принцип применим и для бифидобактерий, у которых проведение белкового профилирования позволило выявить наряду с общностью штаммов и различия между ними внутри вида. Какую перспективу это открывает? Очевидно, что штаммоспецифические различия следует учитывать при решении самых разных фундаментальных проблем. Так, при характеристике состояния биотопа (эубиоз и дисбиоз) определение только видовой принадлежности не может свидетельствовать о функциональной активности штамма и дает сравнительно узкое представление (в пределах core-генома). Наиболее полная характеристика доминантной микрофлоры должна, на наш взгляд, включать параметры, позволяющие оценивать функциональную активность микросимбионтов. К таким параметрам относят способность микробов к выживанию, что обусловлено физиологической функцией адаптации бифидобактерий. В предыдущей нашей работе [2] было показано, что при различных состояниях микросимбиоценоза бифидобактерии различаются по экспрессии персистентных свойств и антагонистической активности. Наличие штаммовой специфичности бифидофлоры объясняет колебание биоэффектов при взаимодействии «доминант-ассоциант», что используется в межмикробном распознавании «свой-чужой» [1]. К тому же, наличие штаммовой специфичности бифидобактерий, вероятно, является аргументом в нецелесообразности использования примененного методического приема для возможного выявления структур родственности микроорганизмов, по крайней мере у бифидобактерий. Штаммоспецифичность бифидобактерий может также определить их разное влияние на ассоциативную микробиоту. Материал, полученный нами [4], демонстрирует, что эффект влияния доминантов на ассоцианты имел не только видовые различия, но варьировал в пределах одного вида. В связи с этим, судить о взаимодействии Bifidobacterium spp. с ассоциативной микробиотой необходимо не только по видовой принадлежности, но и, возможно, по выделению каких-то определенных функциональных кластеров доминантов. Подтверждают наличие штаммоспецифичности бифидофлоры и важность этого признака для выполнения доминантами своих функций исследования по изучению состава карбоновых кислот бифидобактерий. Полученные данные показали, что спектр короткоцепочечных и длинноцепочечных жирных кислот, как и белковый профиль, является индивидуальной характеристикой, «фингерпринтом» («отпечатком пальца») штамма. Если к этому присовокупить имеющиеся в литературе данные о значении метаболитов бифидофлоры для организма человека, то становится понятно, что для сохранения гомеостаза хозяина необходимы бифидобактерии, обладающие определенным набором метаболических функций, способных дополнить недостающие звенья метаболизма макропартнера (хозяина). Аналогичный принцип применим и для бифидобактерий, у которых проведение белкового профилирования позволило выявить наряду с общностью штаммов и различия между ними внутри вида. Таким образом, различия белкового профиля микроорганизмов рода Bifidobacterium отражают уникальность спектра белков (протеома) каждого отдельного штамма (штаммоспецифичны), что, вероятно, определяет их функциональную активность, особенности взаимодействия с ассоциативными микросимбионтами и интеграцию с организмом хозяина в условиях ассоциативного симбиоза человека. Работа выполнена по программам Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», «Механизмы интеграции молекулярных систем при реализации физиологических функций» и Программе фундаментальных исследований, выполняемых совместно с организациями СО и ДВО РАН, государственных академий наук России, национальных академий наук стран СНГ и отраслевых академий.

About the authors

O. V Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

T. F Stepanova

Tumen Research Institute Regional Infectious Pathology

Tumen, Russia

N. B Perunova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

E. V Ivanova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

S. V Andryuschenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

L. V Kataeva

Tumen Research Institute Regional Infectious Pathology

Tumen, Russia

References

Supplementary files