EVALUATION OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR EFFECTIVENESS FOR GROUP A ROTAVIRUS GENOTYPING

Full Text

ВВЕДЕНИЕ От острых диарейных заболеваний в мире умирают от 1 до 2 млн больных всех возрастных групп в год, причем одной из ведущих причин смертности является ротавирусная инфекция [16, 18]. Ежегодно в мире от ротавирусной инфекции умирают более 500 тыс. детей, главным образом в странах с низким уровнем развития экономики и здравоохранения. Для детей в возрасте младше пяти лет до 50% госпитализаций с ОКИ обусловлено ротавирусной инфекцией. В развитых странах гибель людей от ротавирусной инфекции носит спорадический характер, но затраты, связанные с ней, исчисляются миллиардами долларов ежегодно. Полноценный учет потерь от этого возбудителя в большинстве стран мира не ведется. В США ежегодно регистрируется около 2,7 млн случаев ротавирусной инфекции у детей, 0,5 млн обращений к врачу, 50 тыс. госпитализаций, около 20 смертельных исходов, более 1 млрд долларов социальных расходов [12, 15 - 17, 24]. Ротавирусы устойчивы в окружающей среде, санитарные мероприятия, адекватные для предупреждения бактериального заражения, в отношении этих вирусов не эффективны, а распространенность этого рода инфекции в странах с высоким и низким уровнем здравоохранения практически одинакова [13]. По данным Роспотребнадзора в структуре ОКИ установленной этиологии на территории Российской Федерации в 2010 году доля ротавирусного гастроэнтерита составила 45% [3]. По состоянию на сентябрь 2011 года (данные ВОЗ) противоротавирусные вакцины введены в национальные календари прививок в 28 странах, что составляет 15% от общего числа стран мира. В условиях современной высокой миграционной активности существует вероятность падения их эффективности при возникновении новых эпидемически значимых вариантов ротавирусов [14]. Неизвестно влияние на результаты вакцинации межвидовой трансмиссии, которая как явление вполне естественна для ротавирусов и частота которой имеет невысокие, но постоянные значения [11, 22]. Немалую проблему представляют нозокомиальные штаммы ротавируса, которые являются одной из наиболее частых причин острых диарейных заболеваний детей раннего возраста в стационарах и отягощают основное заболевание [2]. Результаты обсервационных и мониторинговых исследований, проводимых в различных частях мира, свидетельствуют о существовании значительных географических различий в распространенности серотипов и генотипов ротавирусов [14]. Попытками системного анализа и сопоставления отдельных региональных наблюдений показано, что во всем мире более 90% случаев ротавирусного гастроэнтерита эндемичны [10]. Имеющиеся в настоящее время сведения по генетическому составу циркулирующих в отдельных регионах РФ штаммов ротавирусов, бессимптомному носительству незначительны по объемам и бессистемны [3 - 9]. Одна из наиболее важных генетических и антигенных характеристик возбудителя - это генотип, определяемый сочетанием вариантов его генов. Учитывая генетическую изменчивость ротавирусов, связанную как с процессами реассортации генома, так и с накоплением точечных мутаций в генах VP4 и VP7, кодирующих протективные белки G и P, необходимы систематические мониторинговые наблюдения динамики генетических характеристик ротавирусов. В большинстве лабораторий, занимающихся мониторингом ротавирусной инфекции, для генотипирования применяется рекомендованные ВОЗ методики, основанные на мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результата [20]. Не менее доступным и информативным, но обладающим известными преимуществами является метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (МП ПЦР-РВ). В связи с этим, основная цель настоящей работы состояла в оценке разрешающей способности и диагностической ценности метода МП ПЦР-РВ в качестве базисной платформы для создания тест-систем для изучения динамики общих генетических характеристик и G/P генотипирования ротавирусов группы А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании использованы 116 фекальных образцов, содержащих ротавирусы и собранных в больницах Москвы и Московской области в 2009 - 2011 годах от детей дошкольного возраста, госпитализированных с симптомами ОКИ. Отбор проводился по принципу случайной выборки из 260 положительных образцов, тестированных на антигены и РНК ротавирусов группы А с использованием набора «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия) и лабораторного набора реагентов на основе ПЦР-РВ с видоспецифическими праймерами. Отобранные пробы были исследованы методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием праймеров и ДНК-зондов собственной разработки, направленных на дифференциальное выявление доминирующих в популяциях вариантов генов ротавирусов группы А: VP7 (G1, G2, G3, G4, G9), VP4 ([P4], [P6], [P8]) и VP6 (I1, I2). При конструировании экспериментальной тест-системы для подбора праймеров, ДНК-зондов и общего генетического анализа использовали общедоступные биоинфор-мационные ресурсы: GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database и др. Аналитические работы в автономном режиме выполнены с помощью программных продуктов Vector NTI suite9 Advance (Infomax, США), DNAStar (DNASTAR, США), MEGA5 (Япония, США). При подборе дифференцирующих праймеров и зондов выбор необходимых локусов осуществляли по усредненным значениям величин вариабельности и их положению на консенсусной последовательности теоретических карт сегментов. Величину относительной вариабельности по отдельным нуклеотидным позициям и локусам вычисляли на основе секвенсов, представленных в международных базах данных геномных последовательностей ротавирусов. Оптимизация выбора целевых локусов проведена методом ранжирования по критериям вариабельности и таксон-специфичности. Для выделения вирусной РНК использовали 10% фекальные экстракты и набор ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США). Реакции обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-РВ проводили с использованием наборов «ОТ-1» и «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ» («Синтол», Россия) на приборах «Терцик» и ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия) с предварительной денатурацией вирусной РНК прогревом при 95°C в течение 90 секунд. Оптимизация условий протокола проведения генотипирования ротавирусов методом МП ПЦР-РВ была достигнута подбором совместимых температурно-временных режимов, комбинаций праймеров и зондов, сведением к возможному минимуму вероятности образования конкатемеров, неспецифического отжига праймеров, возникновения условий конкуренции в реакционной смеси и по другим критериям. Диагностическую специфичность метода типоспецифической ПЦР-РВ оценивали по числу отрицательных реакций в процентах к общему количеству реакций, зарегистрированных при тестировании 14 фекальных образцов (11 - от пациентов с симптомами ОКИ и 3 образцов, содержащих ротавирусы группы В, полученных от животных), негативных по РНК ротавирусов группы А. Оценку результатов МП ПЦР-РВ осуществляли с помощью программного обеспечения, прилагаемого к прибору ДТ-96, по росту кривой интенсивности флуоресценции ДНК-зонда с определением значений пороговых циклов. Выборочный контроль продуктов амплификации на соответствие их размеров расчетным значениям выполнен электрофоретическим разделением ампликонов в 2% агарозном геле. Дополнительные контрольные измерения выполнены выборочным секвенированием ампликонов на автоматическом капиллярном секвенаторе (Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer, США). Филогенетический анализ проводили с использованием алгоритма Neighbor Joining Method в программе Vector NTI suite9 в различных вариантах с целью оценить достаточность участков амплификации для корректного определения генотипа. Корректность идентификации проверяли сравнением дистанций в филогенетических деревьях в вариантах последовательностей ампликонов и последовательностей сегментов референсных штаммов, рекомендованных в [22]. РЕЗУЛЬТАТЫ Для достижения поставленной цели был решен ряд практических задач: сформирована коллекция 260 биопроб, содержащих первично охарактеризованные «дикие» штаммы ротавирусов; на базе геномных последовательностей, представленных в общедоступных международных базах данных, определены локусы, уникальные для вариантов каждого гена, и сконструированы специфические пары праймеров с ДНК-зондами с учетом локу-сов, рекомендованных в [20]. При определении вариабельности и консервативности участков сегментов вирусного генома выявлены диагностически ценные локусы, позволяющие с высокой специфичностью и чувствительностью детектировать разные варианты вирусных генов. Конструирование системы генотипирования проводили путем подбора праймеров и зондов, гомологичных локусам сегментов генома, отвечающим условиям уникальности по критериям «вид» и «вариант гена», а также минимальной гомологии с вероятными контаминантами. В качестве вероятных контаминантов учитывали нуклеотидные последовательности геномов человека, кишечной микробиоты, возбудителей заболеваний, дающих сходную с ротавирусной инфекцией клиническую картину, а также типичные пищевые продукты, употребляемые населением обследуемого региона. За систему классификации генотипов ротавирусов группы А были приняты рекомендации ВОЗ [20] и международной инициативной Рабочей группы по классификации ротавирусов [22]. Распределение дискретных значений относительной вариабельности на теоретической консенсусной карте генома для сегмента 4 гена VP4 в доступных публикациях не встречается; для построения распределений проведены собственные оригинальные расчеты. Установлена высокая корреляция результатов собственных построений распределений для сегментов 9-VP7 и 6-VP6 с данными в рекомендациях ВОЗ и приводимыми Li W. et al. [19, 20]. Для дифференциального выявления 10 вариантов генов, кодирующих белки VP7 (G), VP4 (P) и VP6 (I), сформировано пять реакционных смесей, в каждой из которых выявляется по два варианта генов (табл. 1). Испытания на клинических образцах в моноспецифических ПЦР и МП ПЦР-РВ вариантах с последующей проверкой секвенированием позволили оценить диагностическую ценность выбранных локусов-мишеней (табл.1) и эффективность детектирования генотипов сконструированными парами праймеров и ДНК-зондов. Проверка путем выборочного элетрофоретического анализа и секвенирования продуктов ПЦР, полученных на «диких» штаммах, показала соответствие размеров амплико-нов ожидаемым, высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей исследованных штаммов референсным и соответствие результатов ПЦР-РВ анализа вариантам генов ротавирусов, установленным секвенированием. При сравнении результатов ПЦР-РВ, полученных в моноспецифическом и мультиплексном вариантах, различий между двумя вариантами постановки анализа и признаков конкуренции в реакционной смеси выявлено не было. Заметных несоответствий в филогенетических деревьях, которые могли бы приводить к противоречивым Таблица 1. Основные характеристики эксперименталь- результатам трактовки филогененой МП ПЦР-РВ системы генотипирования тических отношений различных ротавирусов штаммов при G/P-типировании экспериментальной тест-системой, не отмечено. Параллельно идентификацию генотипов по данным секвенирования проводили средствами вычислительной биологии ресурса «RotaC20 automated genoty-ping tool for Group A rotaviruses» (http://rotac.regatools.be/), результаты которой полностью совпали с данными, полученными при самостоятельном сравнении с референс-ными штаммами. № реакционной смеси Выявляемый вариант гена Ожидаемый размер ампликона (н.п.) № сегмента/ кодируемый белок Координаты интервалов локусов-мишеней (н.п.) Флуорофор ДНК зонда 1 G1 127 ROX 2 G2 208 250-400 3 G3 188 9/VP7 440-500 4 G4 133 580-620 5 G9 197 1 P4 152 R6G 2 P6 99 170-350 3 P8 235 4/VP4 460-820 4 I1 116 960-1130 5 I2 197 6/VP6 1210-1250 Корректность определения генотипов ротавирусов эксперимен-же при сопоставлении данных эпидемиологических наблюдений (табл. 2). Наблюдаемые отличия данных по РФ за 2005 - 2007 гг. [9] и данных по Омску и Омской области за 2005 - 2007 гг. [4], а также территориально удаленных Украины, Молдовы (2010, [P] генотип, % тальной тест-системой находит Таблица 2.Соотношения G[P] генотипов ротавирусов в регионах косвенное подтверждение так- Евразии, близких по условиям к московскому региону, в период с 2005 по 2011 годы Регион, период G1 [P8] G2 [P4] G3 [P8] G4 [P8] G9 [P8] Разные регионы РФ, 2005 - 2007 гг. 33 15 7 42 - Омская область, 2007, 2008 гг. 33 10 3 28 - Омск, 2007, 2008 гг. 3 - - 57 - Нижний Новгород, 2008, 2009 гг. - - - 60 - Украина, 2010, 2011 гг. 8 6 8 72 - Молдова, 2010, 2011 гг. 45 2 3 32 - Объединенная Европа, 2010 г. 32 10 10 25 7 Москва, Московская область, 2009 - 2011 гг. (собственные данные) 20 2 14 63 2 Примечание. Приведены округленные данные без учета доли нетипируемых штаммов; - нет данных. 2011 гг.) [16] и стран Евросоюза (2010 г.) [25] от результатов, полученных в настоящем исследовании по Москве и Московской области 2009 - 2011 гг., коррелируют с временными и географическими дистанциями. Доминирование G1[P8] и G4 [P8] генотипов, вероятно, обусловлено общими географическими условиями запада Евразии, также как и практически совпадающая доля генотипа G4[P8], доминирующего в Московском регионе и Нижнем Новгороде (2008, 2009 гг.) [5]. Испытанием на 116 положительных и 14 (11 ротавирус-отрицательных проб от человека, 3 диких штамма группы B от животных) отрицательных образцах показаны высокая специфичность и информативность тест-системы для генотипирования ротавирусов группы А на основе мультиплексной ПЦР-РВ. Показателем высокой диагностической чувствительности метода служат данные, отражающие долю ротавирус-содержащих образцов с определенными вариантами генов (G - 91,4%, P - 87,1%, I - 81,5%). Эти данные, имея высокую степень корреляций с данными выборочного секвенирования, подтверждают высокую чувствительность генотипирования ротавирусов методом МП ПЦР-РВ. Была проведена оценка диагностической эффективности тест-системы для G/P-типирования, являющегося обязательной частью программы ВОЗ по оценке бремени ротавирусных гастроэнтеритов и антигенной характеристике ротавирусов. Предварительная оценка эффективности (ГОСТ Р 53022.3-2008) как отношения количества изолятов с установленным генотипом и отрицательного контроля к общему количеству проб, подвергнутых G/P типированию, включая образцы с не полностью установленным генотипом, составила 89,1%. На основе всестороннего анализа и испытаний исходных материалов сформирована коллекция образцов, лабораторных эталонов в качестве положительного контроля ампликонов генотипов. ОБСУЖДЕНИ Е Результаты испытаний, проведенных в различных исследовательских центрах, показывают, что «быстрые», или экспресс-тесты, имеют чувствительность 40 - 60%, ИФА - 50 - 70%, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) - 55 - 75%, культуральное исследование - 60 - 80%, тогда как ПЦР-РВ - от 90 до 100% [1, 23]. Кроме того, метод ПЦР-РВ обладает специфичностью, приближающейся к 100%, что объясняется достаточностью определения только уникального фрагмента нуклеотидной последовательности, характерного исключительно для данного возбудителя или гена. Геном ротавирусов обладает уникальными нуклеотидными последовательностями, не встречающимися у других вирусов. Но в генных сегментах встречаются различной длины локусы размером от 6 до 60 н.п., которые имеют относительно высокую степень гомологии с участками геномов различных организмов, значительно удаленных таксономических групп. Это обстоятельство необходимо учитывать при решении задач конструирования высокоспецифичных тест-систем на основе ПЦР-РВ [21]. Вместе с тем, в геноме ротавируса имеется достаточно уникальных последовательностей, что позволяет конструировать эффективные ПЦР-РВ системы генотипирования, обладающие необходимыми значениями разрешающей способности, чувствительности и специфичности. Полученные в настоящем исследовании результаты показывают высокий потенциал и перспективность применения метода МП ПЦР-РВ для генотипирования ротавирусов. Большинство современных серийных приборов для ПЦР-РВ могут одновременно дифференциально детектировать от 4 до 6 флуорофоров, что позволяет за счет увеличения мультиплексности реакционных смесей увеличивать количество детектируемых генетических детерминант, повышать эффективность создаваемых на основе метода ПЦР-РВ систем генотипирования, приближая к теоретическому пределу их разрешающую способность. Проведенным исследованием показано, что, несмотря на постоянное улучшение существующих и внедрение новых, более информативных методов исследований, таких как секвенирование, системы генотипирования микроорганизмов, подобных ротавирусам, на основе МП ПЦР-РВ остаются менее затратными и наиболее эффективными и, вероятно, останутся широко востребованными в перспективе на ближайшее десятилетие.

About the authors

G. N Bakhtoyarov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

I. S Kiselev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

V. V Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

E. B Faizuloev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

References

Supplementary files