EVALUATION OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR EFFECTIVENESS FOR GROUP A ROTAVIRUS GENOTYPING


Cite item

Full Text

Abstract

Aim. Evaluate resolution and diagnostic significance of real-time multiplex PCR (MP RT-PCR) as a platform for group A rotavirus G/P genotyping test-systems. Materials and methods. Primer and DNA probe construction for an experimental test-system based on MP RT-PCR was carried out by using specialized PC programs and sequence databases GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database etc. The experimental genotyping test-system was tested using 116 clinical samples with confirmed rotavirus infection and 14 biosamples negative for group A rotavirus RNA. Selective sequencing of VP7, VP6, VP4 gene marker loci was carried out as a reference method for verifying determination of rotavirus genotype. Results. Specific interaction between primers and DNA probes with genotype-specific loci of retrovirus genome segments and a lack of false-negative signals, complete match of genotyping results obtained by MR RT-PCR and sequencing methods were established. Conclusion. The resolution of MP RT-PCR methods allows designing test-systems that can confidently identify rotavirus genotypes with effectiveness of 90% and above.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ От острых диарейных заболеваний в мире умирают от 1 до 2 млн больных всех возрастных групп в год, причем одной из ведущих причин смертности является ротавирусная инфекция [16, 18]. Ежегодно в мире от ротавирусной инфекции умирают более 500 тыс. детей, главным образом в странах с низким уровнем развития экономики и здравоохранения. Для детей в возрасте младше пяти лет до 50% госпитализаций с ОКИ обусловлено ротавирусной инфекцией. В развитых странах гибель людей от ротавирусной инфекции носит спорадический характер, но затраты, связанные с ней, исчисляются миллиардами долларов ежегодно. Полноценный учет потерь от этого возбудителя в большинстве стран мира не ведется. В США ежегодно регистрируется около 2,7 млн случаев ротавирусной инфекции у детей, 0,5 млн обращений к врачу, 50 тыс. госпитализаций, около 20 смертельных исходов, более 1 млрд долларов социальных расходов [12, 15 - 17, 24]. Ротавирусы устойчивы в окружающей среде, санитарные мероприятия, адекватные для предупреждения бактериального заражения, в отношении этих вирусов не эффективны, а распространенность этого рода инфекции в странах с высоким и низким уровнем здравоохранения практически одинакова [13]. По данным Роспотребнадзора в структуре ОКИ установленной этиологии на территории Российской Федерации в 2010 году доля ротавирусного гастроэнтерита составила 45% [3]. По состоянию на сентябрь 2011 года (данные ВОЗ) противоротавирусные вакцины введены в национальные календари прививок в 28 странах, что составляет 15% от общего числа стран мира. В условиях современной высокой миграционной активности существует вероятность падения их эффективности при возникновении новых эпидемически значимых вариантов ротавирусов [14]. Неизвестно влияние на результаты вакцинации межвидовой трансмиссии, которая как явление вполне естественна для ротавирусов и частота которой имеет невысокие, но постоянные значения [11, 22]. Немалую проблему представляют нозокомиальные штаммы ротавируса, которые являются одной из наиболее частых причин острых диарейных заболеваний детей раннего возраста в стационарах и отягощают основное заболевание [2]. Результаты обсервационных и мониторинговых исследований, проводимых в различных частях мира, свидетельствуют о существовании значительных географических различий в распространенности серотипов и генотипов ротавирусов [14]. Попытками системного анализа и сопоставления отдельных региональных наблюдений показано, что во всем мире более 90% случаев ротавирусного гастроэнтерита эндемичны [10]. Имеющиеся в настоящее время сведения по генетическому составу циркулирующих в отдельных регионах РФ штаммов ротавирусов, бессимптомному носительству незначительны по объемам и бессистемны [3 - 9]. Одна из наиболее важных генетических и антигенных характеристик возбудителя - это генотип, определяемый сочетанием вариантов его генов. Учитывая генетическую изменчивость ротавирусов, связанную как с процессами реассортации генома, так и с накоплением точечных мутаций в генах VP4 и VP7, кодирующих протективные белки G и P, необходимы систематические мониторинговые наблюдения динамики генетических характеристик ротавирусов. В большинстве лабораторий, занимающихся мониторингом ротавирусной инфекции, для генотипирования применяется рекомендованные ВОЗ методики, основанные на мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результата [20]. Не менее доступным и информативным, но обладающим известными преимуществами является метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (МП ПЦР-РВ). В связи с этим, основная цель настоящей работы состояла в оценке разрешающей способности и диагностической ценности метода МП ПЦР-РВ в качестве базисной платформы для создания тест-систем для изучения динамики общих генетических характеристик и G/P генотипирования ротавирусов группы А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании использованы 116 фекальных образцов, содержащих ротавирусы и собранных в больницах Москвы и Московской области в 2009 - 2011 годах от детей дошкольного возраста, госпитализированных с симптомами ОКИ. Отбор проводился по принципу случайной выборки из 260 положительных образцов, тестированных на антигены и РНК ротавирусов группы А с использованием набора «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия) и лабораторного набора реагентов на основе ПЦР-РВ с видоспецифическими праймерами. Отобранные пробы были исследованы методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием праймеров и ДНК-зондов собственной разработки, направленных на дифференциальное выявление доминирующих в популяциях вариантов генов ротавирусов группы А: VP7 (G1, G2, G3, G4, G9), VP4 ([P4], [P6], [P8]) и VP6 (I1, I2). При конструировании экспериментальной тест-системы для подбора праймеров, ДНК-зондов и общего генетического анализа использовали общедоступные биоинфор-мационные ресурсы: GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database и др. Аналитические работы в автономном режиме выполнены с помощью программных продуктов Vector NTI suite9 Advance (Infomax, США), DNAStar (DNASTAR, США), MEGA5 (Япония, США). При подборе дифференцирующих праймеров и зондов выбор необходимых локусов осуществляли по усредненным значениям величин вариабельности и их положению на консенсусной последовательности теоретических карт сегментов. Величину относительной вариабельности по отдельным нуклеотидным позициям и локусам вычисляли на основе секвенсов, представленных в международных базах данных геномных последовательностей ротавирусов. Оптимизация выбора целевых локусов проведена методом ранжирования по критериям вариабельности и таксон-специфичности. Для выделения вирусной РНК использовали 10% фекальные экстракты и набор ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США). Реакции обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-РВ проводили с использованием наборов «ОТ-1» и «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ» («Синтол», Россия) на приборах «Терцик» и ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия) с предварительной денатурацией вирусной РНК прогревом при 95°C в течение 90 секунд. Оптимизация условий протокола проведения генотипирования ротавирусов методом МП ПЦР-РВ была достигнута подбором совместимых температурно-временных режимов, комбинаций праймеров и зондов, сведением к возможному минимуму вероятности образования конкатемеров, неспецифического отжига праймеров, возникновения условий конкуренции в реакционной смеси и по другим критериям. Диагностическую специфичность метода типоспецифической ПЦР-РВ оценивали по числу отрицательных реакций в процентах к общему количеству реакций, зарегистрированных при тестировании 14 фекальных образцов (11 - от пациентов с симптомами ОКИ и 3 образцов, содержащих ротавирусы группы В, полученных от животных), негативных по РНК ротавирусов группы А. Оценку результатов МП ПЦР-РВ осуществляли с помощью программного обеспечения, прилагаемого к прибору ДТ-96, по росту кривой интенсивности флуоресценции ДНК-зонда с определением значений пороговых циклов. Выборочный контроль продуктов амплификации на соответствие их размеров расчетным значениям выполнен электрофоретическим разделением ампликонов в 2% агарозном геле. Дополнительные контрольные измерения выполнены выборочным секвенированием ампликонов на автоматическом капиллярном секвенаторе (Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer, США). Филогенетический анализ проводили с использованием алгоритма Neighbor Joining Method в программе Vector NTI suite9 в различных вариантах с целью оценить достаточность участков амплификации для корректного определения генотипа. Корректность идентификации проверяли сравнением дистанций в филогенетических деревьях в вариантах последовательностей ампликонов и последовательностей сегментов референсных штаммов, рекомендованных в [22]. РЕЗУЛЬТАТЫ Для достижения поставленной цели был решен ряд практических задач: сформирована коллекция 260 биопроб, содержащих первично охарактеризованные «дикие» штаммы ротавирусов; на базе геномных последовательностей, представленных в общедоступных международных базах данных, определены локусы, уникальные для вариантов каждого гена, и сконструированы специфические пары праймеров с ДНК-зондами с учетом локу-сов, рекомендованных в [20]. При определении вариабельности и консервативности участков сегментов вирусного генома выявлены диагностически ценные локусы, позволяющие с высокой специфичностью и чувствительностью детектировать разные варианты вирусных генов. Конструирование системы генотипирования проводили путем подбора праймеров и зондов, гомологичных локусам сегментов генома, отвечающим условиям уникальности по критериям «вид» и «вариант гена», а также минимальной гомологии с вероятными контаминантами. В качестве вероятных контаминантов учитывали нуклеотидные последовательности геномов человека, кишечной микробиоты, возбудителей заболеваний, дающих сходную с ротавирусной инфекцией клиническую картину, а также типичные пищевые продукты, употребляемые населением обследуемого региона. За систему классификации генотипов ротавирусов группы А были приняты рекомендации ВОЗ [20] и международной инициативной Рабочей группы по классификации ротавирусов [22]. Распределение дискретных значений относительной вариабельности на теоретической консенсусной карте генома для сегмента 4 гена VP4 в доступных публикациях не встречается; для построения распределений проведены собственные оригинальные расчеты. Установлена высокая корреляция результатов собственных построений распределений для сегментов 9-VP7 и 6-VP6 с данными в рекомендациях ВОЗ и приводимыми Li W. et al. [19, 20]. Для дифференциального выявления 10 вариантов генов, кодирующих белки VP7 (G), VP4 (P) и VP6 (I), сформировано пять реакционных смесей, в каждой из которых выявляется по два варианта генов (табл. 1). Испытания на клинических образцах в моноспецифических ПЦР и МП ПЦР-РВ вариантах с последующей проверкой секвенированием позволили оценить диагностическую ценность выбранных локусов-мишеней (табл.1) и эффективность детектирования генотипов сконструированными парами праймеров и ДНК-зондов. Проверка путем выборочного элетрофоретического анализа и секвенирования продуктов ПЦР, полученных на «диких» штаммах, показала соответствие размеров амплико-нов ожидаемым, высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей исследованных штаммов референсным и соответствие результатов ПЦР-РВ анализа вариантам генов ротавирусов, установленным секвенированием. При сравнении результатов ПЦР-РВ, полученных в моноспецифическом и мультиплексном вариантах, различий между двумя вариантами постановки анализа и признаков конкуренции в реакционной смеси выявлено не было. Заметных несоответствий в филогенетических деревьях, которые могли бы приводить к противоречивым Таблица 1. Основные характеристики эксперименталь- результатам трактовки филогененой МП ПЦР-РВ системы генотипирования тических отношений различных ротавирусов штаммов при G/P-типировании экспериментальной тест-системой, не отмечено. Параллельно идентификацию генотипов по данным секвенирования проводили средствами вычислительной биологии ресурса «RotaC20 automated genoty-ping tool for Group A rotaviruses» (http://rotac.regatools.be/), результаты которой полностью совпали с данными, полученными при самостоятельном сравнении с референс-ными штаммами. № реакционной смеси Выявляемый вариант гена Ожидаемый размер ампликона (н.п.) № сегмента/ кодируемый белок Координаты интервалов локусов-мишеней (н.п.) Флуорофор ДНК зонда 1 G1 127 ROX 2 G2 208 250-400 3 G3 188 9/VP7 440-500 4 G4 133 580-620 5 G9 197 1 P4 152 R6G 2 P6 99 170-350 3 P8 235 4/VP4 460-820 4 I1 116 960-1130 5 I2 197 6/VP6 1210-1250 Корректность определения генотипов ротавирусов эксперимен-же при сопоставлении данных эпидемиологических наблюдений (табл. 2). Наблюдаемые отличия данных по РФ за 2005 - 2007 гг. [9] и данных по Омску и Омской области за 2005 - 2007 гг. [4], а также территориально удаленных Украины, Молдовы (2010, [P] генотип, % тальной тест-системой находит Таблица 2.Соотношения G[P] генотипов ротавирусов в регионах косвенное подтверждение так- Евразии, близких по условиям к московскому региону, в период с 2005 по 2011 годы Регион, период G1 [P8] G2 [P4] G3 [P8] G4 [P8] G9 [P8] Разные регионы РФ, 2005 - 2007 гг. 33 15 7 42 - Омская область, 2007, 2008 гг. 33 10 3 28 - Омск, 2007, 2008 гг. 3 - - 57 - Нижний Новгород, 2008, 2009 гг. - - - 60 - Украина, 2010, 2011 гг. 8 6 8 72 - Молдова, 2010, 2011 гг. 45 2 3 32 - Объединенная Европа, 2010 г. 32 10 10 25 7 Москва, Московская область, 2009 - 2011 гг. (собственные данные) 20 2 14 63 2 Примечание. Приведены округленные данные без учета доли нетипируемых штаммов; - нет данных. 2011 гг.) [16] и стран Евросоюза (2010 г.) [25] от результатов, полученных в настоящем исследовании по Москве и Московской области 2009 - 2011 гг., коррелируют с временными и географическими дистанциями. Доминирование G1[P8] и G4 [P8] генотипов, вероятно, обусловлено общими географическими условиями запада Евразии, также как и практически совпадающая доля генотипа G4[P8], доминирующего в Московском регионе и Нижнем Новгороде (2008, 2009 гг.) [5]. Испытанием на 116 положительных и 14 (11 ротавирус-отрицательных проб от человека, 3 диких штамма группы B от животных) отрицательных образцах показаны высокая специфичность и информативность тест-системы для генотипирования ротавирусов группы А на основе мультиплексной ПЦР-РВ. Показателем высокой диагностической чувствительности метода служат данные, отражающие долю ротавирус-содержащих образцов с определенными вариантами генов (G - 91,4%, P - 87,1%, I - 81,5%). Эти данные, имея высокую степень корреляций с данными выборочного секвенирования, подтверждают высокую чувствительность генотипирования ротавирусов методом МП ПЦР-РВ. Была проведена оценка диагностической эффективности тест-системы для G/P-типирования, являющегося обязательной частью программы ВОЗ по оценке бремени ротавирусных гастроэнтеритов и антигенной характеристике ротавирусов. Предварительная оценка эффективности (ГОСТ Р 53022.3-2008) как отношения количества изолятов с установленным генотипом и отрицательного контроля к общему количеству проб, подвергнутых G/P типированию, включая образцы с не полностью установленным генотипом, составила 89,1%. На основе всестороннего анализа и испытаний исходных материалов сформирована коллекция образцов, лабораторных эталонов в качестве положительного контроля ампликонов генотипов. ОБСУЖДЕНИ Е Результаты испытаний, проведенных в различных исследовательских центрах, показывают, что «быстрые», или экспресс-тесты, имеют чувствительность 40 - 60%, ИФА - 50 - 70%, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) - 55 - 75%, культуральное исследование - 60 - 80%, тогда как ПЦР-РВ - от 90 до 100% [1, 23]. Кроме того, метод ПЦР-РВ обладает специфичностью, приближающейся к 100%, что объясняется достаточностью определения только уникального фрагмента нуклеотидной последовательности, характерного исключительно для данного возбудителя или гена. Геном ротавирусов обладает уникальными нуклеотидными последовательностями, не встречающимися у других вирусов. Но в генных сегментах встречаются различной длины локусы размером от 6 до 60 н.п., которые имеют относительно высокую степень гомологии с участками геномов различных организмов, значительно удаленных таксономических групп. Это обстоятельство необходимо учитывать при решении задач конструирования высокоспецифичных тест-систем на основе ПЦР-РВ [21]. Вместе с тем, в геноме ротавируса имеется достаточно уникальных последовательностей, что позволяет конструировать эффективные ПЦР-РВ системы генотипирования, обладающие необходимыми значениями разрешающей способности, чувствительности и специфичности. Полученные в настоящем исследовании результаты показывают высокий потенциал и перспективность применения метода МП ПЦР-РВ для генотипирования ротавирусов. Большинство современных серийных приборов для ПЦР-РВ могут одновременно дифференциально детектировать от 4 до 6 флуорофоров, что позволяет за счет увеличения мультиплексности реакционных смесей увеличивать количество детектируемых генетических детерминант, повышать эффективность создаваемых на основе метода ПЦР-РВ систем генотипирования, приближая к теоретическому пределу их разрешающую способность. Проведенным исследованием показано, что, несмотря на постоянное улучшение существующих и внедрение новых, более информативных методов исследований, таких как секвенирование, системы генотипирования микроорганизмов, подобных ротавирусам, на основе МП ПЦР-РВ остаются менее затратными и наиболее эффективными и, вероятно, останутся широко востребованными в перспективе на ближайшее десятилетие.
×

About the authors

G. N Bakhtoyarov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

I. S Kiselev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

V. V Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

E. B Faizuloev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

References

  1. Антонова О.С., Рудницкая Г.Е., Тупик А.Н., Буляница А.Л., Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. Полимеразная цепная реакция: приборная и методическая реализация. Обзор аналитических характеристик. Научное приборостроение. 2011, 4: 5-21.
  2. Бениова С.Н., Жидков Е.М. Клинико-патогенетические особенности течения нозокомиальной ротавирусной инфекции. Дальневосточный медицинский журнал. 2007, 4: 15-17.
  3. Основные направления профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний. М., Икар, 2012.
  4. Горбунова М.Г., Жираковская Е.В., Тикунова Н.В., Стасенко В.Л., Вайтович М.А., Тикунов А.Ю., Миленина В.М., Логиновских Н.В. Характеристика эпидемиологического процесса ротавирусной инфекции на территории Омской области в 1993-2007 годах. Сибирский медицинский журнал. 2008, 7: 113-116.
  5. Епифанова Н.В., Луковникова Л.Б., Голицына Л.Н., Фомина С.Г., Зверев В.В., Пономарева Н.В., Парфенова О.В., Новиков Д.В., Волкова М.А., Новикова Н.А. Этиологическая структура вирусных кишечных инфекций у детей в Нижнем Новгороде. Медицинский альманах. 2010, 2 (11): 233236.
  6. Мефодьев В.В., Устюжанин Ю.В., Козлов Л.Б., Фольмер А.Я. Эпидемиология и профилактика ассоциированных с водой кишечных антропонозов. Тюмень, 2006.
  7. Новикова Н.А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чупрова А.Б. G[P] типы ротавируса группы А человека и их распространение в г. Нижнем Новгороде и г. Дзержинске в период 1997-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2007, 3: 19-23.
  8. Подколзин А.Т, Мухина А.А., Шипулин ГА., Кузьмина В.Н., Браславская С.И., Малеев В.В., Горелов А.В., Белова Н.В., Боковой А.Г., Танина Н.Б., Новокшонов А.А., Соколова Н.В., Мазанкова Л.Н., Ильина Н.О., Шишкина С.В., Яковлева Г.Ю. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы. Инфекц. болезни. 2004, 2: 85-91.
  9. Подколзин А.Т, Фенске Е.Б., Абрамычева Н.Ю., Шипулин Г.А., Дорошина Е.А., Козина Г.А., Сагалова О.И., Мазепа В.Н., Иванова Г.И., Семена А.В., Тагирова З.Г., Иванова В.В. , Молочный В.П., Иволгина А.В., Малеев В.В., Покровский В.И. Молекулярная диагностика-2007. М., 2007.
  10. Leung A.K., Kellner J.D. Rotavirus gastroenteritis, Advances in Therapy. 2005, 22 (5): 476-487.
  11. Steyer A., Poljsak-Prijatelj M., Barlic-Maganja D., Marin J. Human, porcine and bovine rotaviruses in Slovenia: evidence of interspecies transmission and genome reassortment. J. General Virology. 2008, 89: 1690-1698.
  12. Bresee J. S., Glass R. I., Ivanoff B., Gentsch J. R. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine. 1999, 17: 2207-2222.
  13. Dennehy P.H. Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home. Pediatr. Infect. Dis. J. 2000, 19 (10; l): S103-105.
  14. Gentsch J.R., Laird A.R., Bielfelt B. et al. Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs. J. Infect. Dis. 2005, 192: 146159.
  15. Glass R.I., Gentsch J., Smith J.C. Rotavirus vaccines: success by reassortment? Science. 1994. 265: 1389-1391.
  16. Global rotavirus information and surveillance bulletin. WHO, October 2012.
  17. Kapikian A.Z., Hoshino Y., Chanock R.M. Rotaviruses. In: Fields Virology. Knipe D., Howley P., Griffin D. et al. (ed.). Lippincott, Williams and Wi, Philadelphia, PA, USA, 2001, р. 1787-1833.
  18. Kosek M., Bern C., Guerrant R.L. The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull. WHO. 2003, 81:197-204.
  19. Li W., Manktelow E., Kirchbach J. C. et al. Genomic analysis of codon, sequence and structural conservation with selective biochemical-structure mapping reveals highly conserved and dynamic structures in rotavirus RNAs with potential cis-acting functions. Nucl. Acids Res. 2010, 21: 7718-7735.
  20. Manual of rotavirus detection and characterization methods. WHO, October 2009.
  21. Martella V., Terio V., Arista S. et al. Nucleotide variation in the VP7 gene affects PCR genotyping of G9 rotaviruses identified in Italy. J. Med. Virol. 2004, 72: 143-148.
  22. Matthijnssens J., Ciarlet M., Rahman M. et al. Recommendations for the classification of group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch.Virol. 2008, 153 (8): 1621-1629.
  23. Natarajan G., Johnson Y.R., Zhang F. et al. Real-time polymerase chain reaction for the rapid detection of group B streptococcal colonization in neonates. Pediatrics. 2006, 1: 14-22.
  24. Parashar U. D., Gibson C. J., Bresee J. S., Glass R. I. Rotavirus and severe childhood diarrhea. Emerg. Infect. 2006, 12: 304-306.
  25. Patton J.T Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Article Published in the Author Account of http://www.discoverymedicine.com/John-T-Patton/2012.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML

Copyright (c) 2014 Bakhtoyarov G.N., Kiselev I.S., Zverev V.V., Faizuloev E.B.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies