COMPARATIVE ANALYSIS OF PARAMETERS OF HUMORAL AND CELL SPECIFIC IMMUNITY IN INDIVIDUALS IMMUNIZED WITH A LIVE TULAREMIA VACCINE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Туляремия является тяжелой токсико-аллергической инфекцией человека и животных. В связи с широким распространением природных очагов на территории бывшего СССР и крупными эпидемическими вспышками эта инфекция в прошлом представляла серьезную проблему здравоохранения [5]. Разработка живой туляремий-ной вакцины (ЖТВ) и внедрение в практику массовой иммунизации населения позволило резко снизить заболеваемость, и сегодня туляремия в РФ относится к контролируемым инфекциям. Однако стабильность эндемичных очагов и снижение иммунной прослойки населения в последние годы определяет неблагополучие по туляремии в отдельных регионах страны. Например, по данным Роспотребнадзора, крупная вспышка туляремии в 2013 г. в Ханты-Мансийском автономном округе обусловлена не только активизацией природного очага, но и резким сокращением объема вакцинации населения в предшествующие годы. Поэтому вопросы специфической профилактики инфекции сохраняют свою актуальность. Установлено, что даже однократная иммунизация человека ЖТВ обеспечивает длительный и напряженный поствакцинальный иммунитет [1, 5, 7, 13]. Вместе с тем, при высокой эффективности ЖТВ обладает реактогенностью и может вызывать у некоторых людей поствакцинальные осложнения - аллергическую реакцию, повышение температуры, местное воспаление, увеличение регионарных лимфоузлов. Кроме того, в современных условиях совершенствование системы вакцинопрофи-лактики инфекционных заболеваний должно быть больше ориентировано на индивидуализацию подхода для каждого защищаемого человека [2]. Поэтому для решения вопроса о необходимости повторной иммунизации в действующих нормативных документах регламентировано определение напряженности противотуляремийного иммунитета через 5 лет после первичной вакцинации [4]. При сохранении положительных показателей специфического иммунитета срок ревакцинации переносится. В настоящее время для оценки состояния противотуляремийного иммунитета у людей рекомендовано использование одного из иммунологических методов исследования, направленных на выявление либо специфических антител (гуморальное звено), либо аллергической реакции гиперчувствительности замедленного типа (клеточное звено) [4]. При этом известно, что ведущая роль в защите человека от туляремийной инфекции принадлежит клеточному звену, тогда как антительный ответ имеет подчиненное значение [1, 18]. Однако опыт показывает, что наиболее широко в практике применяются именно серологические методы, характеризующие гуморальный ответ организма на F.tularensis [3]. Вопрос о том, насколько данный показатель отражает степень защиты человека от возбудителя и коррелирует с клеточным иммунитетом, остается открытым. Целью настоящей работы явился сравнительный анализ результатов оценки гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных ЖТВ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использована коллекция образцов крови и сывороток от 258 сотрудников противочумного института после их иммунизации живой туляремийной вакциной (через 21 день - 22 года). В качестве контроля были обследованы 15 человек, не имевших в анамнезе вакцинацию ЖТВ. Для оценки напряженности гуморального противотуляремийного иммунитета определяли титр противотуляремийных антител в сыворотках крови с помощью ре- 33 3. ЖМЭИ 5 № 33 акции непрямой гемагглютинации (РНГА) с коммерческим эритроцитарным диа-гностикумом производства Ставропольского НИПЧИ. Исследуемые сыворотки инактивировали при 56°C 30 минут и адсорбировали контрольными эритроцитами барана в соответствии с рекомендациями производителя. Контроль специфичности выявленных антител проводили в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Все реакции ставили микрометодом согласно [4]. Титры специфических антител 1/10 - 1/20 оценивали как отрицательные или сомнительные, 1/40 - слабоположительные, 1/80 и выше - четко положительные. Определение показателей клеточного звена противотуляремийного иммунитета проводили с помощью аллергических методов: пробы с тулярином и реакции лейко-цитолиза (РЛ) [4]. Аллергическую пробу выполняли накожным методом с соответствующим тулярином производства НПО «Микроген», Омск. Учет и оценку реакции производили через 24 - 48 часов [4]. В качестве антигена для выполнении реакции лейкоцитолиза использовали накожный тулярин. Средние значения коэффициента лейкоцитолиза (КЛ) в трех независимых пробах рассчитывали по рекомендованной формуле [4]. Результаты реакции лизиса иммунных лейкоцитов учитывали следующим образом: КЛ<15% - отрицательный результат; КЛ=15 - 20% - сомнительный или слабоположительный результат; КЛ>20% - четко положительный результат. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Для реализации поставленных целей были использованы иммунологические методы, характеризующие гуморальное (РНГА) и клеточное (РЛ) звенья противотуля-ремийного иммунитета. При постановке экспериментов для подтверждения достоверности и специфичности результатов первоначально были изучены 15 нормальных (неиммунных) сывороток и образцов крови от неиммунизированных людей. Ни в одном случае нам не удалось выявить взаимодействия туляремийного диагностикума с сывороткой или повреждающего действия тулярина на лейкоциты людей контрольной группы. При исследовании коллекции 258 сывороток от иммунизированных ЖТВ людей в РНГА установлено, что подавляющее большинство проб (95,7%) содержали специфические антитела в титрах 1/40 - 1/1280. Доля сывороток с сомнительными или отрицательными титрами антител (<1/20) составляла лишь 4,3%. Наиболее высокие титры 1/640 - 1/1280 были зарегистрированы через 1 - 3 месяца после первичной иммунизации людей, но в дальнейшем они имели тенденцию к снижению (срок наблюдения 5 лет). Дополнительно было проанализировано состояние специфического иммунитета у 30 человек, привитых против туляремии 10 - 22 года назад. У 28 из 30 обследованных (93%) были выявлены в сыворотках противотуляремийные антитела в титрах 1/40 - 1/160. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что иммунизация человека живой туляремийной вакциной вызывает выраженную продукцию специфических иммуноглобулинов, которые могут сохраняться в сыворотках вакцинированных людей в течение длительного времени. Для оценки аллергической перестройки организма у привитых, характеризующей индукцию клеточного звена иммунитета, использовали реакцию лизиса иммунных лейкоцитов (in vitro) или пробу с тулярином (in vivo). Предварительно для корректности сравнения результатов этих двух методов и их интерпретации мы провели параллельное изучение реакции аллергии у 10 вакцинированных людей с помощью РЛ и пробы с тулярином. Полученные данные показали, что у всех исследуемых положительный коэффициент лейкоцитолиза подтверждался позитивными результатами реакции с тулярином. В связи с тем, что проба с тулярином, требующая проведение манипуляций с людьми, связана с определенным риском, а учет результатов возможен только через 24 - 48 часов, для выполнения дальнейших исследований мы предпочли использовать реакцию лейкоцитолиза, выполняемую in vitro в течение 2 - 3 часов. При изучении клеточного звена иммунитета у 258 вакцинированных людей с помощью РЛ выявлено, что у большинства (76,7%) регистрируется положительная реакция гиперчувствительности замедленного типа. Более того, в специальной группе людей (30 человек), последняя вакцинация которых была проведена 10 - 22 года назад, нам удалось подтвердить сохранение показателей клеточного иммунитета у 26 человек (87%). В то же время, сравнительное исследование показателей клеточного и гуморального звеньев противотуляремийного иммунитета у общего числа обследованных выявило частичное несоответствие результатов двух методов - РЛ и РНГА. В частности, обращает на себя внимание тот факт, что если наличие специфических антител было обнаружено у 95,7% вакцинированных, то положительные показатели клеточного иммунитета зарегистрированы только у 76,7%. При анализе индивидуальных проб оказалось, что позитивные результаты совпадали в обоих тестах у 73,2% привитых людей, а отрицательные - в 0,8% случаев. Таким образом, у 26% исследованных людей результаты одного метода не подтверждались данными другого, что существенно затрудняло оценку состояния их противотуляремийного иммунитета. Например, у 22,5% людей, имеющих специфические антитела, отсутствовал антиген-индуцируемый лизис иммунных лейкоцитов, а в 3,5% случаев при наличии выраженной реакции лейкоцитов на туляремийный антиген специфические иммуноглобулины в сыворотках не регистрировали. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что оценка показателей с использованием только одного из рекомендуемых методов (серологического или аллергического) не всегда дает возможность достоверно определить состояние противотуляремийного иммунитета у человека. Известно, что целью изучения напряженности специфического иммунитета после вакцинации человека ЖТВ является как оценка эффективности первичной иммунизации, так и вопрос о сроках и необходимости проведения ревакцинации. На наш взгляд, только положительные показатели двух звеньев противотуляремийного иммунитета позволяют более обоснованно судить о сохранении иммунитета и сроках проведения ревакцинации. В случае отрицательных результатов или их расхождения представляется целесообразным проведение повторной иммунизации. Учитывая данные о высоком риске внутрилабораторного заражения F.tularensis, особое значение это приобретает для сотрудников, непосредственно работающих с возбудителем туляремии [17, 19]. ОБСУЖДЕНИЕ В настоящее время изучению иммуногенеза при туляремии посвящены многочисленные исследования, однако большинство современных работ выполнено на модели лабораторных животных или культур клеток [12, 16]. Наиболее подробное изучение индукции протективного поствакцинального иммунитета против туляремии у человека относится ко времени создания советскими исследователями живой туля-ремийной вакцины и внедрения ее в практику [1, 6, 8]. Так, по мнению разработчиков вакцины, длительный поствакцинальный иммунитет обусловлен нестерильным характером, т.е. персистенцией бактерий вакцинного штамма в организме человека (Элберт Б.Я., Гайский Н.А., 1941). Вместе с тем, в последние годы появляются данные о возможности сохранения специфического иммунитета в течение многих лет без персистенции возбудителя. Так, найдены уникальные субпопуляции долгоживущих В-лимфоцитов, ответственных за синтез специфических антител и антиген-специфических Т-клеток иммунологической памяти, поддержание популяции которых не требует постоянного присутствия антигена [10, 11]. Таким образом, вопрос о механизмах формирования стойкого длительного противотуляремийного иммунитета нуждается в дальнейшем уточнении. Сегодня не вызывает сомнения тот факт, что эффективная защита против туляремии определяется сложным взаимодействием клеточного и гуморального звеньев иммунитета [14, 15]. Однако, по мнению большинства исследователей, протективное действие вакцины обусловлено индукцией клеточного звена иммунитета. Целью настоящей работы явился сравнительный анализ результатов оценки гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных ЖТВ При обследовании 258 вакцинированных установлено, что положительные показатели двух звеньев иммунитета зарегистрированы у большинства людей (73,2%). Более того, нам удалось подтвердить наличие противотуляремийных иммуноглобулинов и специфического клеточного ответа на туляремийный антиген у людей, привитых 10 - 22 года назад. Наши результаты согласуются с данными Савельевой Р.А. и др. [7] и Eneslatt K. et al. [13] о сохранении поствакцинального иммунитета у людей более 20 лет и подтверждают высокую эффективность живой туляремийной вакцины, обеспечивающей долговременную защиту организма хозяина от инфекции. В то же время, следует отметить, что у 26% иммунизированных людей нам удалось выявить расхождение показателей в РНГА и РЛ. В таких случаях сделать однозначное заключение о состоянии их противотуляремийного иммунитета и соответственно о необходимости проведения ревакцинации представляется затруднительным. Необходимо иметь ввиду, что при высокой эффективности ЖТВ против голарктических штаммов иммунизация в значительно меньшей степени защищает человека против респираторного заражения штаммами F.tularensis subsp. tularensis [16]. В данной связи, особую актуальность приобретает вопрос об иммунизации (ревакцинации) против туляремии сотрудников лабораторий особо опасных инфекций, ведущих исследования с возбудителем туляремии этого подвида. Результаты проведенного нами исследования предполагают, что для повышения достоверности и информативности оценки специфического иммунного статуса вакцинированного человека целесообразно одновременное использование двух методов, отражающих как гуморальное, так и клеточное звенья противотуляремийного иммунитета. На наш взгляд, только положительные иммунологические показатели в обоих тестах могут являться основанием для проведения повторной иммунизации.

About the authors

N. V Aronova

Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia

N. N Onoprienko

Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia

M. V Tsimbalistova

Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia

N. V Pavlovich

Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia

References

Supplementary files