FREQUENCY OF DISEASES CAUSED BY GROUP A STREPTOCOCCI AMONG INVASIVE INFECTIONS OF SOFT TISSUES AND CHARACTERISTICS OF THE CAUSATIVE AGENT

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Во многих странах мира регистрируются случаи тяжелых генерализованных форм стрептококковой инфекции, вызванных стрептококками группы А (СГА, Streptococcus pyogenes), которые часто заканчиваются летально. К ним относятся синдром токсического шока, септицемия, некротический миозит и фасциит и другие; 44% случаев синдрома стрептококкового токсического шока (СТШ) и 19% случаев инвазивной стрептококковой инфекции (ИСИ) в целом заканчиваются летально в течение 7 дней от начала заболевания. По имеющимся на 2011 г. данным смертность в Европе при целлюлите (флегмоне) составляет 17%, при некротическом фасциите - 32%, при СТШ - 44%, а в Новой Каледонии и Фиджи смертность от СТШ составляет 100% [10]. В 2012 и 2013 гг. в некоторых странах отмечено увеличение частоты случаев ИСИ [11]. На основании изучения 5957 историй болезней и протоколов патологоанатомических вскрытий лиц, госпитализированных в четыре городские клинические больницы Москвы в период с октября 2003 г. по май 2005 г. с подозрением на ИСИ, частота ИСИ составляла 17,9% (1066 случаев); при этом достоверными (с выделением СГА) и вероятными (при наличии клинических признаков заболевания без лабораторного подтверждения) были признаны 851 и 213 случаев соответственно [5]. Исследования ИСИ мягких тканей, которые проводятся нами в гнойно-хирургическом отделении 23 ГКБ «Медсантруд» Москвы с 2008 г., показали, что они представлены целым рядом тяжелых генерализованных состояний, сопровождающихся высокой летальностью [1]. Инвазивные СГА инфекции определяют как инфекции, связанные с выделением из стерильной в норме среды организма человека стрептококка группы А и наличием характерных клинических проявлений: падение систолического артериального давления, мультиорганные поражения с вовлечением двух и более органов. При этом начальная стадия заболевания характеризуется гриппоподобным лихорадочным состоянием с ознобом и болью, которая может быть как сильной, не соответствующей выраженности внешних признаков, так и не интенсивной, но продолжительной, тупой [22]. Некротический фасциит отличается стремительным нарастанием некроза тканей: прогрессирование некроза поверхностной фасции со скоростью 2,5 см за 1 ч [12]. Рост заболеваемости инвазивной стрептококковой инфекцией среди практически здоровых детей и взрослых связывают с появлением вариантов возбудителя с повышенной вирулентностью. Появление таких эпидемически значимых клонов СГА может быть вызвано приобретением ими дополнительных генов, участвующих в формировании вирулентности. Так, например, появление высоковирулентных клонов СГА типа emm1 может быть связано с горизонтальным переносом генов, в том числе, генов токсинов, опосредованных умеренными бактериофагами [19]. Возникновение высоковирулентного клона СГА типа emm3, ассоциированного с синдромом токсического шока, связывают с интеграцией в геном СГА нескольких бактериофагов, содержащих ряд генов вирулентности, таких как speA, speK, sla и ssa [9]. Цель работы - определить долю заболеваний, вызываемых СГА, среди инвазивных инфекций мягких тканей; идентифицировать emm-типы выделенных стрептококков и охарактеризовать наличие в их геномах генов интеграз и токсинов, кодируемых умеренными бактериофагами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Обследование пациентов и выделение биологического материала проводили с мая 2008 г. по март 2011 г. в гнойно-хирургическом отделении 23 ГКБ «Медсантруд» Москвы. Всего за исследуемый период в отделении проходили лечение 4750 пациентов, истории болезни которых были проанализированы. К инвазивным инфекциям были отнесены 132 случая. СГА выделяли из крови или материала, полученного во время операции при первичном нарушении целостности кожного покрова от пациентов с инвазивным течением стрептококковой инфекции: некротизирующий фасциит, буллезно-геморрагическая рожа, осложненная некрозом мягких тканей, и др. В ряде случаев имело место развитие синдрома стрептококкового токсического шока. Посев пробы осуществляли на кровяной агар с 5% крови барана. После учета результатов первичного посева на агар выделяли чистую культуру и культивировали ее в бульоне Todd-Hewitt (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., India) в течение 18 часов при 37°C. Идентификацию стрептококков группы А проводили методом латекс-агглютинации с использованием набора реагентов для групповой идентификации (Slidex Strepto-Kit bioMerieux, Франция). Большинство молекулярно-генетических процедур (выделение геномной ДНК, электрофорез ДНК и др.) осуществляли в соответствии с [4]. ДНК выделяли из штаммов СГА, полученных от 37 пациентов с инвазивными стрептококковыми инфекциями мягких тканей. Наличие генов бактериофаговых интеграз int2, int3, int4, int5, int6, int7, int49 и бактериофаговых токсинов speA, speI, sla, speC/J, speL, speH, speC, ssa, а также гена токсина speB, кодируемого хромосомой, определяли методом ПЦР при условиях, описанных ранее [20]. Амплификацию фрагмента гена speB проводили с использованием праймеров: 5’-ACTTATGCTGGTACCGCTGAG-3’; 5’-GAGAGCTAC CTGCAGAACCAC-3’; emm-типирование культур СГА проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным Centers for Disease Control and Prevention, USA [http:// www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocol_emm-type.htm]. Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля посредством набора «Bacterial Genomic DNA Miniprep kit» («Axygen», США). Секвенирование ДНК проводили с использованием набора BigDye v.3.1 (Applied Biosystems) на генетическом анализаторе ABI 3130x.1 С целью установления emm-типа и emm-подтипа штаммов полученные последовательности сравнивали с данными, опубликованными в Streptococcus pyogenes emm sequence database [http://www.cdc.gov/ ncidod/biotech/strep/strepblast.htm] c помощью программы BLAST 2. Экспрессию эритрогенного токсина SpeB определяли по наличию зоны протео-лиза вокруг колонии, посеянной уколом на агаризованную среду, содержащую 10% обезжиренного молока. РЕЗУЛ ЬТАТЫ За период 2008 - 2011 гг. при инвазивных инфекциях мягких тканей в отделении гнойной хирургии 23 ГКБ «Медсантруд» Москвы выявлено 132 случая инвазивных инфекций. Наиболее часто выделяли чистые культуры стафилококков (31,1%, 41 изо-лят). Они были представлены видами Staphylococcus aureus (26,5%, 35 изолятов) и Staphylococcus epidermidis (4,6%, 6 изолятов). В 25,0% случаев выделяли монокультуры Streptococcus pyogenes (33 изолята). Большую группу составляла микст-инфекция (27,3%, 36 случаев инвазивных инфекций). Среди случаев микст-инфекций часто одновременно выделяли S. aureus и S. pyogenes (22,2%, 8 случаев инвазивных инфекций), S. aureus и другие микроорганизмы (27,7%, 10 случаев инвазивных инфекций), S. pyogenes и другие микроорганизмы (13,8%, 5 случаев инвазивных инфекций). В целом, за период наблюдений было зарегистрировано 46 случаев инвазивных инфекций, вызванных или монокультурами СГА, или культурами СГА совместно с другими патогенными микроорганизмами. Методом случайной выборки для молекулярно-генетических исследований взято 34 инвазивных штамма СГА. Для инвазивных штаммов СГА были определены emm-типы и подтипы Наиболее распространенными среди культур СГА, выделявшихся при ИСИ, были типы emm28, emm66 и emm88 (по 4 штамма каждого типа). Каждый из emm-типов 1, 64, 84 и st1731 был представлен двумя штаммами (табл. 1). Штамм 64.0 выделен от двух больных, у одного с летальным исходом. Летальные исходы также зафиксированы для пациентов, у которых были выделены СГА emm-типов 1.47, 64.0, 66.1 и 77.0. Девять эпидемически несвязанных инвазивных штаммов СГА (табл. 2) были отобраны для дальнейшего анализа с целью обнаружения возможной корреляции между наличием генов токсинов, приобретаемых стрептококками, в частности, посредством горизонтального переноса бактериофагов, и инвазивностью стрептококков. Среди всех генов токсинов, проанализированных в данной работе, лишь ген speB (также как и экспрессия токсина SpeB) был выявлен у всех штаммов, тогда как гены sla и speI не были обнаружены ни у одного из штаммов. Гены остальных токсинов (ssa, speL, speC, speA, speH, speC/J) встречались лишь у ряда штаммов. Гены фаговых интеграз были обнаружены среди всех штаммов, но в различных сочетаниях (от одного до четырех генов). ОБСУЖДЕНИЕ Случаи ИСИ в России регистрируются сравнительно редко, хотя, по-видимому, встречаются значительно чаще, но проходят под другими диагнозами [2]. Отсутствие системы слежения и контроля, слабая лабораторно-диагностическая база, недостаточность методической подготовки врачей и лаборантов не позволяют судить об истинных масштабах распространения ИСИ. В нашем исследовании СГА в качестве монокультуры вызывал развитие тяжелой генерализованной формы инфекции в 25,0% случаев, а также в 9,9% случаев при микст-инфекции, характеризуясь более стремительным течением по сравнению с инфекциями, вызываемыми другими видами микроорганизмов. № штаммаemm-тип, подтипКоличество больных, диагнозы 16-09emm1.01 - параоссальная флегмона бедра 09-11emm1.471 - множественные гнойно-некротические раны голени, СТШ, летальный исход 14-09emm28.02 - флегмона предплечья, осложненная некрозом участков ткани 06-10 08-101 - флегмона стопы, осложненная некрозом участков ткани 07-101 - флегмона шеи, осложненная некрозом участков ткани 21-09emm41.21 - некротизирующая инфекция голени 04-11emm44.01 - буллезно-геморрагическая рожа, осложненная некрозом участков ткани голени 28-11emm49.81 - некротизирующая инфекция мягких тканей голени и стопы; ампутация конечности на уровне середины бедра 36-10emm53.01 - некротизирующая инфекция 15-09emm60.11 - гнойно-некротические раны левого предплечья 12-09emm64.01 - некротизирующая инфекция (целлюлит, фасциит) верхней конечности, тяжелый сепсис 19-091 - некротизирующая инфекция верхней конечности с переходом на шею; крестцово-ягодичной области с переходом на спину и бедра, СТШ, летальный исход 10-10emm66.0,2 - флегмона предплечья, осложненная некрозом участков ткани 35-10emm66.1 22-091 - некротическая инфекция мягких тканей бедер, тяжелый сепсис 02-091 - буллезно-геморрагическая рожа, осложненная флегмоной и некрозом участков ткани, СТШ, летальный исход 20-09emm73.01 - некротизирующая инфекция мягких тканей нижней конечности 10-08emm74.01 - буллезно-геморрагическая рожа, осложненная некрозом участков ткани стопы; гнойно-некротические раны голени 21-11emm77.01 - флегмона бедра, осложненная некрозом участков ткани, летальный исход 02-10emm80.01 - флегмона предплечья, осложненная некрозом участков ткани 24-11emm84.01 - буллезно-геморрагическая рожа, осложненная флегмоной и некрозом участков ткани голени 11-111 - флегмона предплечья и кисти, осложненная некрозом участков ткани 12-10emm88.21 - флегмона стопы, осложненная некрозом участков ткани 19-101 - флегмона голени, осложненная некрозом участков ткани 23-101 - гнойно-некротические раны голени 23-111 - флегмона предплечья, осложненная некрозом участков ткани 44-10emm115.01 - некротизирующая инфекция (фасциит) голени 06-09emm117.01 - некротизирующая инфекция голени, гнойно-некротическая рана передней брюшной стенки, тяжелый сепсис 45-10emm27G.61 - флегмона предплечья, осложненная некрозом участков ткани 03-10st2211 - флегмона стопы, осложненная некрозом участков ткани 19-11st17311 - буллезно-геморрагическая рожа, осложненная некрозом участков ткани 05-111 - флегмоны стоп, осложненные некрозом участков ткани 16-10st29401 - некротизирующая инфекция (фасциит), тяжелый сепсис Определенные emm-типы S. pyogenes часто ассоциируются с развитием той или иной формы СГА-инфекции, в частности, штаммы emm12 типа ассоциируются с развитием скарлатины, а emm49 - гломерулонефрита [20]. Штаммы, наиболее часто вызывающие развитие ИСИ в европейских странах, принадлежат к типам emm1, emm3 и emm28 [16, 17]. В частности, случаи ИСИ, вызванные типом emm28, часто регистрируются в Испании, Франции, Португалии и Финляндии. В то же время, в других регионах мира преобладают иные emm-типы СГА, ассоциированные c ИСИ. Так, в Канаде наиболее часто вы- Таблица 2. Распространенность генов интеграз и токсинов среди зывающими инвазивные ин- СГА, от болшш ишюзшшы- , _ ми стрептококковыми инфекциями фекции были штаммы СГА типов emm1, emm4 и emm12 [18], на Тайване - emm11, emm102 и emm106 [22], в Индии - emm12, emm30 и emm48 [21]. По последним данным, в США при инвазивной СГА инфекции увеличивается частота встречаемости штаммов типа emm59 [13]. Во многих странах при некротическом фасциите и СТШ выделяют штаммы СГА типа emm1 [10]. Номера штаммов и emm-типы Ген16-1020-0928-1116-0923-1109-1124-1112-0919-09 st2940emm73emm49emm1emm88emm1emm84emm64emm64 Гены токсинов ssa speL speC speA speB speI speH speC/J sla int2 int3 int4 int5 int6 int7 int49 -++-+--- +++++++++ ----+-+-- ---+-++-- +Гены интеграз ++-+-+--- ----+-+-- +++-+--++ ++++++-++ --+------ Примечание. + Наличие, - отсутствие гена. В данном исследовании преобладающими типами СГА, вызывающими ИСИ, были типы emm1 и emm28, наиболее характерные для Европы, а также типы emm64, emm66, emm84, emm88 и st1731. Следует отметить, что штаммы типа emm28 выделяли в основном у молодых людей, что подтверждает наличие у возбудителей особых свойств, обеспечивающих штаммам этого типа повышенную вирулентность [14]. С другой стороны, можно предположить в скором будущем увеличение числа случаев ИСИ, вызванных недавно появившимися на территории Российской Федерации типами emm64, emm66 и emm88. На сегодня нет однозначного ответа, с чем, в первую очередь, связаны инвазивные свойства штаммов - с определенными emm-типами или с наличием определенных профагов/профаговых генов. По данным ряда авторов, наличие эритрогенного токсина А, кодируемого бактериофаговым геном speA, является одним из маркеров агрессивности штамма. Однако в данном исследовании ген speA был обнаружен у инвазивных штаммов типов emm1.0 и emm49.8, но не обнаружен у штаммов типов emm73.0, emm88.2, emm84.0, emm64.0 и st2940. Примечательным представляется тот факт, что штаммы №№ 23-12-09 и 23-19-09, выделенные у разных пациентов одного и того же отделения, принадлежали к редко встречающемуся типу emm64 и характеризовались идентичным набором фаговых генов, не характерным для других штаммов. Не исключено, что эти штаммы являются эпидемически связанными. Штаммы СГА, вызывающие ИСИ, оказались крайне гетерогенны по наличию фаговых токсинов и фаговых интеграз. Известно, что каждая из фаговых интеграз обеспечивает способность интеграции бактериофага в геном стрептококка, а фаговые токсины принимают участие в вирулентности стрептококка. В данной работе инвазивные штаммы СГА характеризовались широким спектром бактериофагов, а их количество в геноме каждого из штаммов соответствует количеству выявленных генов интеграз. Во многом каждый бактериофаг характеризуется определенным геном интегразы и определенным геном токсина. В настоящем исследовании какой-либо значительной корреляции между этими генами обнаружено не было, за исключением гена int5 и гена speH, которые, по данным ряда авторов, принадлежат к одному бактериофагу [7]. Таким образом, не исключено, что изученные инвазивные штаммы СГА содержат ранее не известные бактериофаги, а их выявление и характеристика могут лечь в основу разработки метода идентификации инвазивных штаммов СГА. Лишь ген токсина SpeB был обнаружен у всех штаммов, что не удивительно, учитывая, что данный ген локализуется на хромосомной, а не на профаговой ДНК стрептококков группы А. Более того, экспрессия SpeB была выявлена у всех 37 инвазивных штаммов. Ранее рядом исследователей было отмечено, что многие из инвазивных штаммов СГА не экспрессируют токсин SpeB, и сделано предположение, что отсутствие экспрессии SpeB является одним из факторов, необходимых для инвазивности [8, 15]. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что, по-видимому, отсутствие экспрессии SpeB все же не так важно для инвазивности СГА. Более того, несколько неинвазивных штаммов, проанализированных нами ранее, не экспрессировали SpeB. Что касается приведенных выше результатов, то, по-видимому, инвазивные инфекции могут быть вызваны определенными клонами, а отсутствие у ряда из них экспрессии SpeB является лишь случайным признаком, достоверность которого невелика. Таким образом, показано, что инвазивные стрептококковые инфекции распространены значительно чаще, чем предполагалось ранее, и обнаружена высокая степень генетической гетерогенности инвазивных штаммов СГА. С целью выявления истинных масштабов инвазивной стрептококковой инфекции в России необходима разработка адекватной системы слежения и учета на основе дальнейшего развития лабораторно-диагностической базы. Нами предложена система эпидемиологического надзора за стрептококковой (группы А) инфекцией, в которой важная роль отведена микробиологической подсистеме [3]. Она направлена на мониторинг молекулярно-генетических свойств циркулирующих штаммов стрептококка и определение его типовой структуры. Внедрение в практическую деятельность здравоохранения страны учета стрептококковой септицемии, помимо скарлатины и других заболеваний, вызываемых стрептококками группы А [6], позволит существенно оптимизировать и информационно-аналитическую подсистему эпидемиологического надзора.

About the authors

N. I Briko

Sechenov First Moscow State Medical University, Russia

E. V Glushkova

Sechenov First Moscow State Medical University, Russia

A. G Nosik

Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg; St. Petersburg State University, Russia

A. V Dmitriev

Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg; St. Petersburg State University, Russia

N. F Dmitrieva

Sechenov First Moscow State Medical University, Russia

D. A Kleimenov

Sechenov First Moscow State Medical University, Russia

K. V Lipatov

Sechenov First Moscow State Medical University, Russia

References

Supplementary files