CLINICAL SIGNIFICANCE OF INTERLEUKIN-28B AND RNAse L GENE POLYMORPHISM DETERMINATION IN PATIENTS WITH CHRONIC VIRAL HEPATITIS C

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Инфекция вирусом гепатита С (ВГС) представляет собой важную проблему современности. Комбинированная терапия пегилированным интерфероном альфа и рибави-рином (PegIFN/RBV) является во многих странах стандартом помощи пациентам с хроническим гепатитом С (ХГС). Стойкий вирусологический ответ (СВО) на лечение в настоящее время достигает 54 - 63% в общем, составляя 40 - 50% для пациентов с генотипом 1 ВГС [4]. Определенное влияние на результат лечения, а также возможность самостоятельного выздоровления при заражении ВГС оказывает полиморфизм гена интерлейкина 28В (IL28B) [11]. Было показано, что единичные нуклеотидные замены (SNP) в гене IL28B коррелировали с ответом на лечение пациентов препаратами PegIFN/ RBV [3, 5, 14]. Два из этих SNP имеют более высокую прогностическую ценность ответа на лечение у ВГС-инфицированных пациентов с генотипом 1 ВГС: rs12979860 и rs8099917. Аллель С в rs12979860 ассоциируется с повышенной вирусной нагрузкой, со спонтанным клиренсом ВГС и вирусологическим ответом во время лечения [3, 5]. Демонстрируется, что С аллель rs12979860 является предиктором быстрого снижения вирусной нагрузки и достижения быстрого вирусологического ответа на 4 неделях лечения [7]. Другим по значимости является SNP rs8099917, отражающий СВО у пациентов с генотипом 1 ВГС [5, 12]. Предполагается, что генотипирование IL28B позволит выбрать оптимальную продолжительность лечения у пациентов с генотипом 1 ВГС. Рибонуклеаза L (РНКаза L) является ключевым компонентом врожденного клеточного иммунитета, расщепляя вирусные и клеточные одноцепочечные РНК. РНКаза L локализуется в цитоплазме и ядре и расщепляет вирусную РНК в области UA и UU динуклеотидов на фрагменты длиной 200 - 500 п.н. [2, 13]. Доказано влияние полиморфизма РНКазы L 1385G>A на риск развития рака простаты (генотип GA повышает риск на 50%, а генотип АА - на 100% по сравнением с «нормальным» генотипом GG) [2]. Клиническое значение РНКазы L для ответа на терапию ХГС интерфероном альфа (IFN) не известно. ВГС первого генотипа имеет меньшее количество UA и UU сайтов рестрикции и, таким образом, более резистентен к действию РНКазы L [9]. Эти результаты позволяют предположить, что чувствительность ВГС инфекции к терапии IFN может коррелировать с эффективностью, с которой РНКаза L расщепляет РНК ВГС. Однако ответ на терапию IFN не объясняется различиями в сайтах расщепления РНКазы L [15]. Цель работы - определение частоты встречаемости и клинического значения полиморфизмов гена интерлейкина 28B и РНКазы L у пациентов с ХГС. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Были обследованы 104 пациента с хронической ВГС-инфекцией, госпитализированных в отделение хронических гепатитов Гомельской областной инфекционной клинической больницы. Из них были 70 мужчин (65,1%) и 34 женщины (34,9%) в возрасте от 16 до 75 лет (средний возраст 39,7±1,6 лет). У 17 пациентов (16,3%) имелись признаки цирроза печени. Генотип вируса определяли у 91 пациента, у большинства (62,6%) выявлен генотип 1 ВГС. Получали противовирусную терапию 70 пациентов с ХГС: 50 с использованием стандартного интерферона (IFN) и RBV, 20 - PegIFN/RBV. Некоторые пациенты еще продолжают лечение, поэтому эффект терапии оценен у 57 пациентов. Для выявления SNP 39743165T>G (rs8099917) и SNP 39738787C>T (rs12979860) гена IL28B (классификация NCBI) использовали метод ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с применением технологии миссматч-праймеров по методике [1]. Для выявления точечной мутации гена РНКазы L 1385G>A (rs486907) у 89 из пациентов обследованной группы был также применен метод ПЦР-ПДРФ с применением технологии миссматч-праймеров. В качестве материала для исследований использовалась ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с использованием реагентов для выделения ДНК из клинического материала «Цитолизин» фирмы «АмплиСенс» (Россия). Используемые праймеры были синтезированы по нашему заказу фирмой «Primetech» (Беларусь). Для проведения ПЦР, электрофоретической детекции и рестрикционного анализа использовали реагенты фирмы «Fermentas» (Литва). Детекцию продуктов ПЦР проводили с помощью гель-электрофореза, достоверность полученных данных подтверждена с помощью мелтинга (плавления) рестрикционных фрагментов. Для сравнения частоты выбранных вариантов полиморфизма генов IL28B и РНКазы L с популяцией Европейского региона были взяты частоты полиморфизмов из базы данных GenBank NCBI. Контрольной группой для РНКазы L послужили 77 человек без признаков заболевания печени или наличия маркеров вирусного гепатита, проживающие в Гомельском регионе. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA v.6.0. Использовали критерий Манна-Уитни для сравнения в независимых группах, критерий %2 или точный критерий Фишера для сравнения частот. Для описания данных применялись медиана (Ме) и интерквартильный размах (25 - 75%). Статистически значимой считалась 95% вероятность различий (р<0,05). Для расчета 95% доверительного интервала (95% ДИ) в оценке долей использован откорректированный метод Вальда. РЕЗУЛЬТАТЫ Определена частота встречаемости SNP 39743165T>G гена IL28B у 104 пациентов. Для сравнения частоты носительства мутантного аллеля G с литературными данными нами проанализирована база данных GenBank, найдено исследование 226 лиц в Европейском регионе [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref. cgi?rs=8099917]. Результат представлен в табл. 1. Различие в частоте носительства мутантного аллеля G в сравниваемых группах статистически значимо (%2=15,2; р=0,0001). Анализ SNP 39738787c>T [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref. cgi?rs=12979860] проводился у 102 пациентов (в двух образцах наблюдали ингибирование Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей по SNP 39743165T>G гена IL28B в группе пациентов с ХГС и контрольной группе из базы данных GenBank Группа Частоты генотипов (%, 95% ДИ) Частоты аллелей (%, 95% ДИ) TT TG GG T G Группа пациентов с ХГС (n=104) 52,9 (43,4-62,2) 38,5 (29,7-48,1) 8,7 (4,4-15,8) 72,1 (65,7-77,8) 27,9 (22,2-34,4) HapMap-CEU ss44192664 72,6 24,8 2,7 85,0 15,0 (n=226) (66,4-78,0) (19,6-30,8) (1,1-5,8) (81,4-88,0) (12,0-18,7) Таблица 2. Частоты генотипов и аллелей по SNP 39738787C>T гена IL28B в группе пациентов с ХГС и группе сравнения Группа Частоты генотипов (%, 95% ДИ) Частоты аллелей (%, 95% ДИ) СС СТ TT С T Пациенты с ХГС (n=102) Европейская популяция (n=642) 37.3 (28,5-47,0) 52.4 (48,5-56,2) 46,1 (36,7-55,7) 39,7 (36,0-43,6) 16,7 (10,6-25,2) 7,9 (6,1-10,3) 60.3 (53,5-66,8) 72.3 (69,7-74,6) 39.7 (33,2-46,6) 27.7 (25,4-30,2) ПЦР). Так как в GenBank нами не найдена информация о частоте генотипов в европейской популяции, то в качестве группы сравнения была взята группа обследованных европейцев (642 человека) из исследования зарубежных авторов [14]. Результат представлен в табл. 2. Различия в частоте встречаемости аллелей в сравниваемых группах статистически значимы (%2=12,0; р=0,0001). Сравнивали результаты исследования частоты SNP 39743165T>G и 39738787C>T. Совпадение «благоприятных» генотипов ТТ и СС соответственно было у 37 чел. (36,3%), гетерозиготных вариантов TG и CT - у 33 чел. (32,4%), мутантных вариантов GG и TT - у 8 (7,8%). У 13 пациентов (12,7%) «благоприятный» генотип ТТ (SNP 39743165T>G) сочетался с генотипом СТ (SNP 39738787C>T). «Неблагоприятный» генотип ТТ (SNP 39738787C>T) у 6 пациентов (5,9%) сочетался с генотипом TG (SNP 39743165T>G) и у 3 (2,9%) - с генотипом ТТ. Анализ полиморфизма гена РНКазы L проводили у 84 пациентов с ХГС, у 77 лиц контрольной группы и в двух группах сравнения из базы данных GenBank (популяция Центрально-Европейского региона). Результаты представлены в табл. 3. Генотип GG по сравнению с иными вариантами у лиц контрольной группы встречался несколько чаще, чем у пациентов с ХГС (%2=3,62; р=0,057). Частота нормального генотипа GG была также несколько выше в популяции HapMap-CEU ss48422436 по сравнению с пациентами с ХГС (%2=3,51; р=0,061), однако значимо не отличалась от контрольной группы и двух групп сравнения. Проанализированы генотипы вируса ВГС (1 или не 1) у лиц с различными вариантами генов IL28B и РНКазы L у 73 пациентов. Представляется интересным, что у лиц с различными генотипами вируса частота вариантов SNP гена IL28B различается, причем у пациентов с 1 генотипом ВГС чаще встречаются мутантные аллели SNP 39743165T>G (%2=3,64, р=0,045) и SNP 39738787C>T (%2=7,81, р=0,005). Различий в частоте выявления Таблица 3. Полиморфизм гена РНКазы L у пациентов с ХГС, лиц контрольной группы и в двух популяциях Центрально-Европейского региона Популяции Полиморфизм гена РНКазы L 1385 G/A, % (95% ДИ) GG GA AA Пациенты с ХГС (n=84) Контрольная группа (n=77) HapMap-CEU ss48422436 (n=226) HapMap-CEU ss68786496 (n=120) 25.0 (16,9-35,3) 39.0 (28,8-50,1) 36,3 (30,3-42,7) 31,7 (24,0-40,5) 58.3 (47,7-68,3) 52.0 (41,0-62,8) 50.4 (44,0-56,9) 55.0 (46,1-63,6) 16,7 (10,1-26,2) 9,1 (4,2-17,9) 13.3 (9,4-18,4) 13.3 (8,3-20,7) 3. ЖМЭИ 4 № 32 33 нормального генотипа GG гена РНКазы L у лиц с 1 и не 1 генотипами вируса не обнаружено (%2=0,41; р=0,52). Сравнивали различные варианты SNP в 2 группах: с прогрессированием ХГС (развитие выраженного фиброза или цирроза) - 22 чел. и отсутствием прогрессирования (при наблюдении свыше 10 лет прогресии фиброза не отмечено) - 22 чел. Частота генотипов SNP 39743165T>G и SNP 39738787C>T не различалась (х2=0,37; р=0,54 и х2=0,05; р=0,83 соответственно). Различий в частоте генотипа GG SNP 1385G>A гена РНКазы L у лиц с различной скоростью прогрессирования ХГС также не выявлено (%2=1,56; р=0,21). Сравнение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) в группах с различными генотипами SNP 39743165T>G с помощью метода Манна-Уитни не выявило значимых различий (р=0,22). Выявлены более высокие значения АЛТ (Ме 114 Е/л, 25-75% 69 - 180,6) в группе с генотипом СС (SNP 39738787C>T) по сравнению с генотипами СТ и ТТ (Ме 69,8 Е/л, 25-75% 54,1-111), статистически значимые (тест Манна-Уитни р=0,016). Вирусная нагрузка ВГС при обоих полиморфизмах гена IL28B значимо не различалась (р=0,85 и р=0,59 соответственно). Генотип GG SNP 1385G>A гена РНКазы L в сравнении с генотипами GA и АА не оказывает влияния на уровень АЛТ и вирусной нагрузки ВГС (тест Манна-Уитни, р=0,52 и р=0,79 соответственно). Для исследования роли вариантов SNP гена IL28B в эффективности противовирусного лечения ХГС обследованы 70 пациентов, которые получали препараты IFN и RBV. Из них генотип 1 ВГС имели 45 человек (64,3%), генотип 2 или 3 - 25 человек (35,7%). Проанализированы результаты лечения препаратами интерферона (СВО или вирусологический ответ в конце курса лечения) у 57 пациентов. На терапию ответили 13 из 43 (30%) пациентов, получавших IFN и RBV, и 6 из 14 (43%) пациентов, получавших PegIFN/RBV Учитывая, что частота ответа в этих двух группах различалась несущественно (р=0,52, точный критерий Фишера), для дальнейшего анализа они были объединены. Проанализирована частота ответа на противовирусное лечение у пациентов с ХГС с различными аллельными вариантами гена IL28B и РНКазы L в общей группе пациентов и у лиц с 1 генотипом ВГС (табл. 4). Ответ на терапию был ниже у лиц с 1 генотипом ВГС по сравнению с иными генотипами (%2=12,7, р=0,0004). При сравнении частоты «благоприятных» гомозиготного носительства ТТ и СС у ответивших и не ответивших на интерферонотерапию выявлено, что частота генотипа ТТ (SNP 39743165T>G) была несколько выше у ответивших (68,4%), чем у не ответивших (44,7%, %2=2,8, р=0,09). Частота СС (SNP 39738787C>T) у ответивших (57,9%) была значительно выше, чем у не ответивших (18,4%, %2=9,1; р=0,003). Ни у одного из ответивших на терапию пациентов не встречались гомозиготные «неблагоприятные» варианты GG (SNP 39743165T>G) или ТТ (SNP 39738787C>T). Рассчитывали отношение шансов (OR, 95% ДИ) ответа на терапию у пациентов с «благоприятным» генотипом ТТ (SNP 39743165T>G) по сравнению с генотипами TG или GG, OR = 2,7 (0,8 - 8,5). Для генотипа СС (SNP 39738787C>T), по сравнению с генотипами СТ или ТТ, OR = 6,1 (1,8 - 20,7). Это доказывает более высокую прогностическую ценность определения SNP Таблица 4. Частота ответа на противовирусное лечение у пациен- 39738787C>T по сравнению с тов с ХГС с различными аллельными вариантами гена SNP 39743165T>G. IL28B и РНКазы L Для исследования роли вариантов SNP 1385G>A гена РНКазы L в эффективности противовирусного лечения ХГС обследованы 46 пациентов. Из них генотип 1 ВГС имели 29 человек (63,0%). На терапию ответили 18 пациентов, у 3 из которых был выявлен «нормальный» вариант (GG), у 7 пациентов - генотип GА, у 5 - генотип АА. Не ответили на терапию 22 пациента, из которых 4 имели генотип GG, 16 - генотип GT, 2 - генотип GG. В группах пациентов, ответивших и не ответивших на терапию интерфероном, частота нормального генотипа GG не различалась (р=0,61, точный критерий Фишера). Несколько чаще выявляли мутантный вариант АА у лиц, ответивших на терапию (р=0,079, точный критерий Фишера). Наличие «нормального» генотипа GG не является прогностическим фактором ответа на терапию: отношение шансов (OR, 95% ДИ) ответа на терапию у пациентов с генотипом GG по сравнению с генотипами GA или AA: OR = 1,15 (0,24 -5,54). ОБСУЖДЕНИ Е SNP генов IL28b и РНКазы L Варианты генотипов (n) Ответ, % (95% ДИ) все пациенты Ответ, % (95% ДИ) пациенты с генотипом 1 ВГС IL28B SNP 39743165T>G TT 43,3 (27,4-60,8) 29,4 (13,0-53,4) (n=57) TG 27,3 (12,9-48,4) 11,1 (1,9-34,1) GG 0 (0-48,9) 0 (0-48,9) IL28B 39738787C>T CC 61,1 (38,5-79,8) 50,0 (21,5-78,5) (n=57) CT 27,6 (14,5-45,9) 13,6 (3,9-34,2) TT 0 (0-32,1) 0 (0-32,1) РНКаза L, 1385G>A GG 12,5 (0,1-49,2) 0 (0-48,9) (n=46) GA 37,9 (22,6-56,1) 21,1 (8,0-43,9) AA 66,7 (35,1-88,3) 40,0 (11,6-77,1) У пациентов с ХГС мутантный аллель G SNP 39743165T>G выявляли чаще, чем в общей популяции Европейского региона (27,9% и 15%; р=0,0001). Аналогичным образом, мутантный аллель Т SNP 39738787C>T выявлен чаще в обследованной группе (39,7%), чем в группе сравнения (27,7%; р=0,0002). Частота аллеля С, который ассоциируется с более частым спонтанным клиренсом ВГС (самопроизвольным выздоровлением от инфекции) в общей популяции России составляет 61,4-64,1% [14], в общей европейской популяции - 72,3%, а у пациентов с ХГС - 60,3% (р=0,0005). Это можно объяснить спецификой исследованных лиц - в нашем исследовании обследованы пациенты с хроническими формами ВГС-инфекции, в то время как существуют данные о том, что мутантные аллели чаще встречаются у пациентов с хронизацией инфекции по сравнению с реконвалесцентами [12, 14]. Генотип GG SNP 1385G>A гена РНКазы L по сравнению с иными вариантами у лиц контрольной группы встречался несколько чаще, чем у пациентов с ХГС, что можно объяснить восприимчивостью лиц с мутантной аллелью гена РНКазы L к хроническому течению вирусных инфекций, в частности, ВГС-инфекции. Теоретически, риск развития рака простаты должен быть выше у пациентов с ХГС, что подтверждается в недавнем проспективном исследовании Lee M.H. et al. [6]. У пациентов с генотипом 1 ВГС чаще встречаются мутантные аллели в SNP 39743165T>G (р=0,045) и SNP 39738787C>T (р=0,005). Эти факторы являются взаимно отягощающими и уменьшают вероятность ответа на терапию у пациентов с 1 генотипом вируса. Такая же зависимость была выявлена Neukam K. et al. у пациентов с ХГС на фоне ВИЧ-инфекции [10]. Причины этого пока не установлены. Исследованные варианты SNP гена IL28B, по-видимому, не оказывают влияния на скорость прогрессирования ВГС-инфекции. Это согласуется с данными недавнего исследования Marabita F. et al. [8]. Выявление повышенных значений АЛТ у лиц с генотипом СС SNP 39738787C>T, возможно, свидетельствует о более эффективном иммунном ответе, сопровождающемся большей выраженностью синдрома цитолиза. Вирусная нагрузка ВГС по нашим данным не различалась при исследованных полиморфизмах, хотя в литературе имеются указания на более высокую вирусную нагрузку при генотипе СС SNP 39738787C>T [3]. Ответ на противовирусную терапию был выше при наличии у пациентов «благоприятных» вариантов ТТ (sNp 39743165T>G) и СС (SNP 39738787C>T), при гомозиготном носительстве «неблагоприятных» вариантов GG (SNP 39743165T>G) и ТТ (SNP 39738787C>T) ни один из больных на терапию не ответил. Можно отметить, что большую прогностическую ценность имеет определение SNP 39738787C>T по сравнению с SNP 39743165T>G. Установлено, что тестирование на полиморфизмы гена IL28B позволяет точнее прогнозировать эффективность терапии PegIFN/RBV и «тройной» терапии с ингибиторами протеазы у больных ХГС с генотипом 1 ВГС [4]. Тестирование SNP 1385G>A гена РНКазы L не позволяет прогнозировать ответ на интерферонотерапию, данный полиморфизм не имеет явного клинического значения у пациентов с ХГС.

About the authors

V. M Mitsura

Gomel State Medical University, Belarus

E. V Voropaev

Gomel State Medical University, Belarus

O. V Osipkina

Gomel State Medical University, Belarus

S. V Zhavoronok

Belarus State Medical University, Minsk, Belarus

D. V Tereshkov

Gomel Regional Infectious Clinical Hospital, Belarus

O. Yu Baranov

Gomel State Medical University, Belarus

References

Supplementary files