MECHANISMS OF REALIZATION OF PROTECTIVE EFFECT OF MILIACIN DURING EXPERIMENTAL SALMONELLA INFECTION: EFFECT OF ENDOTOXINEMIA AND CYTOKINE PRODUCTION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Установленная ранее способность милиацина ослаблять тяжесть течения экспериментальной сальмонеллезной инфекции [8] обусловила необходимость исследования механизмов, лежащих в основе протективного действия тритерпеноида. В настоящее время в качестве универсального фактора патогенеза заболеваний как инфекционной, так и неинфекционной природы рассматривается повышенный уровень эндотоксина в системной циркуляции [2, 4 - 6]. Являясь детерминантой патологического процесса, эндотоксинемия на местном и системном уровне мобилизует ответные реакции организма, среди которых наиболее значимая роль принадлежит воспалению и иммунному ответу [1]. В свою очередь, известно, что оба этих процесса приоритетно регулируются цитокинами. Данные представления обосновывают целесообразность изучения влияния милиацина на эндотоксинемию и продукцию цитокинов как возможных мишеней при реализации его защитного действия. Целью настоящей работы являлась оценка влияния милиацина на выраженность эндотоксинемии и особенности продукции цитокинов при экспериментальной саль-монеллезной инфекции. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования выполнены на 128 мышах-самцах (CBAxC57Bl6)Fi массой 22 - 25 г из питомника «Столбовая» РАМН. Эксперименты проведены в соответствии с рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными. Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков или декапитацией под эфирным наркозом. Заражение животных выполняли внутрибрюшинным введением госпитального штамма Salmonella enteritidis в дозе 2х106 бактерий на мышь. Пентациклический тритерпеноид милиацин: 3-Р-метокси-А18-олеанен вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего введения тритерпеноида. Использовано 4 группы животных: I - интактные (положительная группа сравнения); II - зараженные (отрицательная группа сравнения); III - зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина: твин 21 в конечной концентрации 1,6х10-7 моль/кг (контроль); IV - зараженные после предварительного введения милиацина (опыт). Животных II - IV групп выводили из эксперимента на 10 сутки после заражения - в период, соответствующий наибольшей микробной обсемененности их внутренних органов [8]. В эти же сроки осуществляли эвтаназию интактных мышей. Определение эндотоксина в плазме крови мышей проводили с помощью хромогенного LAL-теста по конечной точке, основанного на способности эндотоксинов грамотрицательных бактерий активировать сериновые протеазы в лизате амебоцитов Limulus с последующим отщеплением хромофора: р-нитроанилина от хромогенного субстрата с развитием желтого окрашивания. Интенсивность последнего после остановки реакции измеряли на фотометре «Multiskan» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 405 нм. Количественное содержание эндотоксина в исследуемых пробах рассчитывали с помощью стандартной кривой, полученной при использовании серийных разведений референс-эндотоксина, и выражали в ЕД/мл. Выполнение данных исследований осуществляли с использованием наборов НЫ LAL (Hycult biotech, Нидерланды). Продукцию цитокинов изучали в культурах спленоцитов после 48-часовой инкубации клеток (2х106) при 37°C в атмосфере 5% СО2 в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотке (Sigma, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Оценивали спонтанную и индуцированную Кон А (5мкг/мл) продукцию ИЛ-12, у-ИФН, ИЛ-17, ИЛ-10 и ИЛ-4 путем определения их содержания в супернатантах культур спленоцитов методом ИФА («Bender MedSystems», Австрия). Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 10 [7] с оценкой различий между средними величинами по t-критерию Стьюдента. Статистические результаты выражали в виде медианы (Ме), нижних (Q25) и верхних (Q75) квартилей. Уровень статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Установлено, что сальмонеллезная инфекция (группа II) обусловливает значимое возрастание содержания эндотоксина в плазме крови зараженных мышей, уровень которого на 10 сутки после заражения (0,31+0,037 ЕД/мл) превосходит показатель, определяемый у интактных (группа II) животных (0,111+0,047 ЕД/мл) в 2,8 раза. Использование растворителя, предшествовавшее заражению (группа III), не оказало влияния на выраженность эндотоксинемии (0,324+0,043 ЕД/мл). Предварительное введение милиацина (группа IV), напротив, обеспечивало существенное снижение эндотоксинемии по отношению к другим группам зараженных животных: II (на 35,5%) и III (на 38,3%) до уровня (0,200+0,033 ЕД/мл), превосходящего показатель интактных мышей (группа I) лишь в 1,8 раза. Данные о влиянии милиацина на спонтанную и индуцированную продукцию ци- Влияние милиацина на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов токинов спленоцитами спленоцитами мышей (CBAxC57Bl6)F1 при сальмонеллезной инфекции различных групп инфи цированных животных представлены в табл. Как следует из табл., сальмонеллезная инфекция (группа II) характеризуется повышением способности спленоцитов в системе in vitro как к спонтанной (у-ИФН), так и к индуцированной (ИЛ-12, у-ИФН, ИЛ-17) продукции цито-кинов по сравнению с аналогичной продукцией культурой спле-ноцитов от интактных мышей (группа I). Ин-фек ци онный процесс со провождается также повышением митоге-ниндуцированной продукции ИЛ-10. Содержание ИЛ-4 в культуральной среде нести-мулированных сплено- СрокПродукция цитокинов Группынаблю денияспонтаннаяиндуцированная (сутки)МС (Q25-Q75)nМС (Q25-Q75)n ИЛ-12 I6,48 (0,03-8,89)88,81 (53,5-10,41)8 II1016,96 (6,22-20,65)1133,63* (17,25-51,75)11 III1014,26 (9,5-17,78)1128,14* (19,31-52,28)11 IV1030,82* (20,43-50,77)1038,64* (27,7-48,16)10 у-ИФН I6,03 (3,86-11,08)1023,32 (20,38-31,41)10 II1024,60* (19,69-31,9)11369,8* (234,3-843,9)11 III1017,38 (15,20-22,79)11395,1* (256,1-460,5)11 IV1035,36*° (33,79-38,53)10296,65* (256,1-880,8)10 ИЛ-17 I3,88 (2,87-4,80)85,40 (4,71-6,28)8 II103,85 (1,34-6,02)1154,50* (27,15-60,20)11 III102,67 (0,28-4,51)1151,37* (24,53-101,4)11 IV104,30 (0,36-5,89)1038,70* (16,67-52,21)10 ИЛ-10 I4,93 (1,50-5,97)85,19 (4,33-5,81)8 II105,1 (3,11-15,86)1122,95* (17,63-32,69)11 III107,14 (0,94-9,24)119,48 (6,87-25,29)11 IV109,42* (7,21 - 10,81)1030,54* (20,43-50,77)10 ИЛ-4 I1,64 (1,27-1,89)820,11 (11,63-30,85)8 II101,56 (1,41-2,02)119,13 (2,53-12,68)11 III101,42 (1,12-1,67)112,96* (2,15-3,67)11 IV101,37 (1,24-2,01)103,48* (3,38-3,76)10 Примечание. * р<0,05 с группой I, р<0,05 между группами IV и III, I - интактные, II - заражение, III - растворитель+заражение, IV цитов от зараженных - милиацин+заражение. мышей (группа II) соответствовало значениям, определяемым для спленоцитов от неинфицированных животных (группа I). Вместе с тем, заражение характеризовалось четкой тенденцией к снижению индуцированной продукции данного цитокина (в 2 раза). Введение растворителя, предшествовавшее заражению (группа III), не оказало влияния на направленность и выраженность изменений (по сравнению с группой II) спонтанной и митогениндуцированной продукции ИЛ-12, у-ИФН и ИЛ-17. Однако оно сопровождалось уменьшением стимулированной продукции ИЛ-10 (по отношению к группе II) и ИЛ-4 (по отношению к группам I и II). Использование милиацина (группа IV) не отменяло стимулирующей направленности влияния самой инфекции на продукцию ИЛ-12 и у-ИФН. Более того, милиацин обеспечивал наиболее значительный прирост их спонтанной продукции среди всех групп зараженных мышей. В отношении митогениндуцированной продукции данных цитокинов стимулирующего действия тритепреноида не наблюдали. Применение милиацина обусловливало также наиболее высокие показатели спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10. В отношении ИЛ-17 эффект милиацина носил противоположную направленность, а именно, в сторону не усиления, а ограничения прироста его митогениндуцированной продукции до минимальных значений по отношению к другим группам зараженных животных. Спонтанная продукция ИЛ-4 спленоцитами мышей IV группы не менялась, а индуцированная - характеризовалась его низким содержанием на уровне значений контроля (III группа). ОБСУЖДЕНИЕ Снижение выраженности эндотоксинемии у инфицированных животных под влиянием милиацина может отражать один из значимых механизмов его защитного действия. Наиболее очевидным объяснением такого эффекта тритерпеноида является снижение бактериальной нагрузки [8] в виде уменьшения микробной обсеменен-ности внутренних органов у животных опытной группы (IV) по отношению к контролю (III) и отрицательной группе сравнения (II). Вместе с тем, очевидно, что выраженность эндотоксинемии обусловлена не только поступлением эндотоксина в системную циркуляцию, но и возможностью его элиминации из крови. Последняя в наибольшей степени определяется активностью макрофагальной системы печени - клеток Купфера, характеризующихся высокой экспрессией рецепторов к ЛПС - TLR4 [14]. Клиренсную функцию выполняют и клетки печеночной паренхимы, в которые эндотоксин переносится ЛПВП, после чего подвергается лизосомальному процессингу и выведению с желчью [5]. Принимая во внимание полученные ранее данные [3] о способности милиацина оказывать гепатопротекторный эффект, в том числе и в отношении клеток Купфера, представляется вероятным, что влияние три-терпеноида реализовывалось в отношении этих механизмов антиэндотоксиновой защиты печени. Увеличение продукции ИЛ-12 и у-ИФН спленоцитами инфицированных животных, прежде всего, свидетельствует о том, что сальмонеллезная инфекция стимулирует Th-1 зависимый иммунный ответ. Снижение на этом фоне ИЛ-4 - показателя активации Th-2 клеток отражает реципрокные отношения между данными субпопуляциями Т-лимфоцитов и подтверждает существующие представления о значимости клеточных механизмов иммунной защиты при этой патологии [9, 12]. Милиацин усиливает мобилизацию этих клеточных механизмов в виде дальнейшего увеличения спонтанной продукции ИЛ-12 и у-ИФН. Отсутствие значимого прироста их индуцированной продукции спленоцитами животных опытной группы (IV) по отношению к контролю (III) и отрицательной группе сравнения (II) могло отражать эффект митогенной стимуляции, выравнивающий продуктивный потенциал клеток для данных цитокинов. Возрастание под влиянием милиацина спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10 можно расценивать как проявление ауторегуляторной функции иммунной системы в виде включения супрессорного фактора (ИЛ-10), лимитирующего избыточную цитотоксичность и соответственно выраженность иммунного воспаления через включение апоптотического механизма гибели активированных Т-клеток [13]. Понижающий эффект милиацина в отношении ИЛ-17 мог быть обусловлен стимулирующим действием тритерпеноида на продукцию ИЛ-12, лимитирующего продукцию другого представителя данного семейства цитокинов - ИЛ-23, имеющего с ИЛ-12 общую субъединицу (р40). Очевидно, что при такой конверсии на фоне активации под действием ИЛ-12 Th-1 хелперов - источников у-ИФН, дефицит ИЛ-23 ограничил бы индукцию Th-17 хелперов - источников ИЛ-17. Этот вопрос остается открытым. Однако в любом случае снижение продукции ИЛ-17 выступает существенным механизмом защитного действия милиацина через ограничение участия данного цитокина в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов, а также в мобилизации гранулоцитов, поддерживающих остроту воспалительной реакции и отражающих специфику Th-17 опосредованного воспаления [10, 11].

About the authors

B. A Frolov

Orenburg State Medical Academy, Russia

I. N Chainikova

Orenburg State Medical Academy, Russia

Yu. V Filippova

Orenburg State Medical Academy, Russia

A. I Smolyagin

Orenburg State Medical Academy, Russia

T. V Panfilova

Orenburg State Medical Academy, Russia

A. D Zheleznova

Orenburg State Medical Academy, Russia

References

Supplementary files