CHARACTERISTICS OF STRUCTURE AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF STAPHYLOCOCCI ISOLATED FROM CHILDREN WITH HIV-INFECTION

Full Text

Стафилококковые инфекции до настоящего времени остаются одной из важных проблем практического здравоохранения. Рост числа лиц с приобретенным иммунодефицитом, широкая распространенность метициллин-резистентных штаммов, длительная персистенция данных микроорганизмов в различных биотопах тела человека затрудняет разработку мер по снижению заболеваемости гнойно-воспалительными инфекциями стафилококковой этиологии. Особенно остро данная проблема стоит для ВИЧ-инфицированных пациентов, так как стафилококковые инфекции нередко являются причиной смертельных исходов наряду с туберкулезом, протозойными и грибковыми инфекциями [7, 8]. Исследования последних лет демонстрируют видовое разнообразие кокковой флоры при различных патологических процессах и широкую распространенность факторов патогенности у стафилококков [1, 2, 6]. Однако в большинстве случаев данные микроорганизмы изучаются как микросимбионты у ВИЧ-негативных пациентов, при этом структура стафилококков, распространенность и уровень экспрессии факторов вирулентности штаммов, выделенных у ВИЧ-инфицированных, до настоящего времени изучены недостаточно, что затрудняет разработку эффективных мер по предупреждению развития у них вторичных осложнений стафилококковой этиологии. Цель исследования - изучение видового состава и факторов патогенности стафилококков, выделенных из кишечного биотопа детей с ВИЧ-инфекцией. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования были 120 штаммов стафилококков, в том числе 75 культур, выделенных из содержимого толстой кишки ВИЧ-инфицированных детей (II - III иммунной категории) и 45 штаммов от ВИЧ-негативных детей. Исследование было построено по типу «случай-контроль». В опытную группу вошли 73 ребенка с ВИЧ-инфекцией, средний возраст детей составил 2,3±0,2 года. Диагноз ВИЧ-инфекция был поставлен на основании данных эпидемиологического анамнеза (перинатальный контакт) и подтвержден результатами ИФА, ПЦР, имму-ноблоттинга. Группа сравнения включала 58 ВИЧ-негативных относительно здоровых детей. Группы были сопоставимы по возрасту и полу Выделение стафилококков осуществляли общепринятыми методами. Идентификацию проводили на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств; биохимический профиль изучали с использованием коммерческих тест-систем ПБДС (Нижний Новгород). Адгезивные свойства микроорганизмов изучали согласно методике В.И. Брилиса. Оценку результатов опыта вели по индексу адгезивности микроорганизма, который характеризует среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ<1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными - от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными при ИАМ>4,0. Липолитическую и ДНКазную активность стафилококков исследовали методом посева на Tributhyrin Agar Base without Tributhyrin (HiMedia) и DNA Base Agar (HiMediа). Количественную характеристику липазной активности изучали спектрофотометрическим методом с использованием набора «LIPASA liquicolor» (HUMAN, Германия) на приборе СФ-2000. Кинетику выделения данного фермента наблюдали через 30, 60 и 90 мин от начала опыта. Штаммами с низкой липазной активностью считали штаммы при значениях 0 - 30 Е/л, со средней - 31 - 60 Е/л, с высокой - 61 и более Е/л. Определение гемолитической активности микроорганизмов проводили на МПА с добавлением 5% взвеси эритроцитов человека. Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1). Статистическая обработка информации строилась с учетом характера распределения данных, которое определяли с помощью построения гистограмм. Если закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, достоверность различий в парных независимых совокупностях определяли с помощью критерия Манна-Уитни. В случае совпадения распределения показателей с нормальным достоверность различий определяли с помощью критерия Стъюдента. Сравнение контрольных и опытных частот проводили с помощью критерия %2. Различия считали значимыми при p<0,05. Для анализа связей между ИАМ и липазной активностью применяли коэффициент корреляции Спирмена. РЕЗУЛ ЬТАТЫ У ВИЧ-инфицированных детей установлена высокая распространенность бактерий рода Staphylococcus (102,74 стафилококков на 100 детей), так как в 24,7% случаев у одного ребенка выделяли по 2 и более видов стафилококков. В группе сравнения распространенность была статистически ниже и составляла 77,59 штаммов на 100 детей (p<0,05), что было связано с выделением преимущественно одного вида стафилококков. В целом количественный уровень стафилококков у ВИЧ-позитивных детей был в 10 раз меньше, чем у ВИЧ-негативных детей и составил 2,9х105 КОЕ/г против 5,1х106 КОЕ/г соответственно (p<0,05). Более низкий уровень колонизации слизистой стафилококками при ВИЧ-инфекции, вероятно, связан с межвидовыми конкурентными взаимоотношениями стафилококков и отсутствием таковых у ВИЧ-негативных детей, так как в данной группе выделяли в основном один вид стафилококков. Видовая структура стафилококков у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных детей характеризовалась отсутствием статистически значимых различий (p>0,05). Среди стафилококков доминировал S. aureus, доля которого составила 33,3% и 40% соответственно. Второе ранговое место у ВИЧ-инфицированных занимал S.xylosus (25,6%), третье - S.epidermidis (10,7%). В группе сравнения на долю S.epidermidis приходилось 26,7%, а S.xylosus в общей структуре стафилококков занимал третье место (17,8%). У ВИЧ-негативных детей были также выделены S.intermedius (6,7%), S.lentus (6,7%), S.simulans (2,2%). При ВИЧ-инфекции видовая структура стафилококков была более разнообразна, и кроме вышеуказанных видов встречались еще S.cohnii (2,7%), S.haemolyticus (4%). Несмотря на то, что в сравниваемых группах доля S.aureus в общей структуре стафилококков была практически одинаковой, тем не менее, у детей с ВИЧ-инфекцией количественный уровень данных микроорганизмов был статистически выше и составил 1,8х107 КОЕ/г против 9,4х105 КОЕ/г у ВИЧ-негативных (p<0,01). При этом уровень колонизации слизистой S.epidermidis у ВИЧ-позитивных был на 2 lg меньше, чем у детей группы сравнения (2,6х105 КОЕ/г против 1,7х107 КОЕ/г соответственно, p<0,01), а содержание S.xylosus было одинаковым и составило 1,9х106 КОЕ/г. В настоящее время возникновение оппортунистических инфекций связывают с увеличением уровня экспрессии факторов патогенности условно патогенной микрофлоры при развитии иммунодефицита [4]. Поэтому была изучена вирулентность стафилококков, изолированных из кишечника ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных детей. Установлено отсутствие статистически значимых отличий по структуре адгезивной активности стафилококков (%2 =0,15, p>0,05). Так, у ВИЧ-инфицированных детей 34,7% штаммов были высокоадгезивными, индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ) в среднем составил 5,8±0,4. В группе сравнения высокой способностью к адгезии обладали 33,3% стафилококков (ИАМ 5,4±0,6). В большинстве случаев стафилококки в сравниваемых группах были среднеадгезивными (37,3% и 42,2% соответственно). При этом среднее значение ИАМ у детей с ВИЧ-инфекцией было выше и составило 3,98±0,3 против 2,97±0,4 (p>0,05). Доля штаммов с низкой способностью к адгезии у ВИЧ-позитивных детей не превышала 18,7% (ИАМ=2,36±0,3), в группе сравнения 17,8% (ИАМ=2,06±0,1). Неадгезивными были 9,3% стафилококков у детей основной группы (ИАМ=0,59±0,3) и 6,7% штаммов у детей группы сравнения (ИАМ=1,4±0,1). Также отсутствовали отличия по распространенности таких факторов вирулентности, как продукция гемолизина, липазы и ДНКазы (%2 =0,12, p>0,05). Гемолизин продуцировали 91% штаммов стафилококков, выделенных от ВИЧ-позитивных, детей и 89% штаммов - от здоровых детей. Липазной активностью обладали 76% стафилококков в основной группе и 56% штаммов в группе сравнения. ДНКазной активностью характеризовались 22,7% стафилококков от детей с ВИЧ-инфекцией и 24,4% штаммов от ВИЧ-негативных детей. Анализ интенсивности выделения гемолизина и ДНКазы, который проводили, сравнивая величины зон гемолиза и гидролиза ДНК вокруг колоний стафилококков, показал отсутствие статистически значимых различий по данным признакам (p>0,05). Так, величина зоны гемолиза стафилококков, выделенных от детей с ВИЧ-инфекцией, в среднем составила 9,17±0,8 мм, ДНКазной активности - 9,82±0,6 мм. Для стафилококков, выделенных от ВИЧ-негативных детей, данные показатели находились на уровне 6,02±1,4 мм и 5,18±0,6 мм соответственно. При этом количественная оценка липазной активности показала статистически значимые отличия по данному признаку (p<0,05). Среднее значение липазной активности у стафилококков, выделенных от детей с ВИЧ-инфекцией, составило 39,49 Е/л, тогда как в группе сравнения данный показатель не превышал 18,69 Е/л. При этом от детей с ВИЧ-инфекцией преимущественно выделяли штаммы с низкой (60%) и средней способностью продуцировать липазу (33,3%). На долю штаммов с высокой липазной активностью приходилось только 6,7% культур, 84,6% штаммов от ВИЧ-негативных детей обладали низкой липазной активностью, а средней - только 7,7% стафилококков. По некоторым данным липаза стафилококков выполняет роль не только фермента инвазии, но также используется как адгезин [5]. Корреляционный анализ между индексом адгезии и липазной активностью показал отсутствие связи между этими показателями (r=0,14; p=0,73), что согласуется с данными литературы, так как индекс адгезии является показателем лиганд-рецепторного взаимодействия стафилококков с клетками макроорганизма [9]. Сравнительный анализ синтеза фермента на 30 минуте опыта показал, что у высокоадгезивных штаммов среднее значение липазной активности было низким и составляло 9,75±1,8 Е/л, тогда как у средне- и низкоадгезивных стафилококков данный показатель достигал 25,63+2,3 и 23,55+5,3 Е/л соответственно (p<0,05). Установлено, что у высокоадгезивных штаммов на 60 минуте регистрировался прирост синтеза липазы на 31,45+5,5 Е/л, а затем на 90 минуте происходило снижение ее синтеза на 36,72+7,6 Е/л. У среднеадгезивных стафилококков через 1 час после начала опыта отмечалось снижение липазной активности по сравнению с 30 минутой (Дср=-7,29+0,9 Е/л) с последующим увеличением ее синтеза до уровня, регистрируемого на 30 минуте (Дср=+7,7+1,2 Е/л). Напротив, у стафилококков с низкой способностью к адгезии на 60 и 90 минуте происходил прирост липазной активности в среднем на 45,03+6,9 и 5,78+0,6 Е/л соответственно. Таким образом, стафилококки, имеющие изначально высокие показатели лиганд-рецепторной адгезии, максимальное количество липазы синтезируют на 60 минуте. У средне- и низкоадгезивных штаммов высокая липазная активность наблюдается уже на 30 минуте. ОБСУЖДЕНИЕ Гнойно-воспалительные заболевания стафилококковой этиологии при ВИЧ-инфекции занимают одно из ведущих мест среди осложнений бактериальной природы [7, 8]. Исследования кишечного микросимбиоценоза у ВИЧ-инфицированных детей показало высокую распространенность стафилококков, что было связано с одновременным вегетированием двух и более видов. Видовая структура стафилококков у ВИЧ-позитивных детей не отличалась от таковой у детей группы сравнения (p>0,05). Среди стафилококков доминировали S.aureus S.xylosus, S.epidermidis. Однако при ВИЧ-инфекции уровень колонизации S. aureus был достоверно выше и достигал 1,8х107 КОЕ/г (p<0,01). Большое значение в колонизации слизистых играют адгезивные характеристики штаммов. Однако у стафилококков от ВИЧ-инфицированных детей и от детей группы сравнения не обнаружены различия в распространенности и уровне экспрессии факторов адгезии (p>0,05). Вероятно, механизмы формирования более высокого колонизационного уровня необходимо рассматривать с точки зрения характера взаимоотношений стафилококков с доминантными и ассоциативными микросимбионтами и взаимодействия с факторами защиты макроорганизма. Подтверждают предположение наши более ранние исследования, где мы показали механизмы нарушения колонизационной резистентности при ВИЧ-инфекции, которые были обусловлены нарушением способности бифидобактерий к адгезии и антагонизму [3]. Было установлено, что стафилококки при ВИЧ-инфекции продуцируют липазу, ДНКазу и гемолизины с той же частотой, что и стафилококки от ВИЧ-негативных детей (p>0,05). Кроме того, сходным был также уровень продуцируемого гемолизина и ДНКазы, отличия касались только липазы. Количество продуцируемой стафилококками липазы от детей с ВИЧ-инфекцией было в 2,1 раз выше, чем у штаммов, выделенных от ВИЧ-негативных детей. С одной стороны, липаза является фактором инвазии и более высокий уровень продукции данного фермента стафилококками при ВИЧ-инфекции объясняет патогенез гнойно-воспалительных процессов. С другой стороны, липазу рассматривают как фактор адгезии. Установлено, что у стафилококков с высокой способностью к лиганд-рецепторной адгезии количество продуцируемой липазы невелико. У средне- и низкоадгезивных штаммов высокая липазная активность может рассматриваться как компенсаторный механизм в условиях недостатка структурных адгезинов. Возможно, это свойство стафилококков у ВИЧ-инфицированных позволяет S.aureus достигать более высокого количественного уровня и быть причиной развития гнойно-воспалительных осложнений у данной категории лиц.

About the authors

Yu. V Zakharova

References

Supplementary files