COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF HLA SYSTEM GENE DISTRIBUTION IN PATIENTS WITH LUNG TUBERCULOSIS OF THE RUSSIAN POPULATION OF CHELYABINSK REGION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Туберкулез (ТБ) является одной из постоянных проблем здоровья населения планеты. Несмотря на широкомасштабную вакцинацию, использование современных лекарственных препаратов и осуществление национальных и межнациональных программ контроля за туберкулезом ежегодно в мире регистрируется 10 млн новых случаев первичного туберкулеза и около 1,7 млн смертей [23]. Более того, по данным статистических исследований, 1/3 населения Земли инфицирована Mycobacterium tuberculosis (Mtb) и только 10% от всех инфицированных демонстрируют прогрессию к активным формам туберкулеза [20, 22, 23]. Представленные статистические данные порождают вопросы - каковы причины и механизмы таких разнообразных взаимоотношений между хозяином и патогеном: 1) протективный иммунный ответ против Mtb и элиминация возбудителя; 2) перси-стенция возбудителя на фоне клинического здоровья в течение нескольких лет (и даже в течение жизни); 3) прогрессия к активным формам заболевания инфицированных Mtb индивидуумов [23]. Результаты исследований, проведенных в последние 30 - 40 лет, привели к заключению, что в основе развития инфекционных заболеваний лежит динамическое состояние баланса отношений между партнерами - хозяином и патогеном, которые устанавливаются и поддерживаются широкой сетью взаимодействий, осуществляемых на разном уровне - молекулярном и клеточном, на уровне целого организма и популяций [2, 6]. Поддержание и эволюция таких взаимоотношений на протяжении длительного периода времени (времени ко-эволюции двух систем) способно сформировать особое состояние - персистентная инфекция[2, 24], которое, как можно предполагать, выгодно для двух партнеров - возбудителей, высоко адаптированных к человеку, в частности Mtb, и хозяев. Персистирующие микобактерии находятся в состоянии транзиторного равновесия между клеточным делением и смертью [13], а для хозяина состояние персистенции характеризуется особым профилем экспрессии генов, отличным от транскрипционных кластеров, вовлеченных в защитный иммунный ответ при активных формах ТБ: при персистенции повышена активность сабсе-та генов, вовлеченных в регуляцию апоптоза и активность ЕК, но снижен уровень экспрессии группы генов, участвующих в дифференцировке и эффекторных функциях макрофагов и гранулоцитов, по сравнению с клиническими формами ТБ [16]. И хотя на сегодня не совсем понятны механизмы протективного иммунитета к ТБ, но очевидно, что чувствительность к клиническим фенотипам определяется комплексностью партнерства, включающего генетические вариации хозяина, популяции, этноса, их географическое проживание и генетический профиль возбудителя. Этот вариативный комплекс рассмотрен рядом исследователей и сделано заключение - хотя филогенетические линии Mtb, демонстрирующие геоэтническое ограничение, могут ассоциироваться со специфическими клиническими фенотипами, этнос хозяина (его генетический профиль) является более важной детерминантой клинических паттернов заболевания туберкулезом [11, 17]. Успехи, достигнутые в последние годы при расшифровке генома человека (млекопитающих), подчеркивают особую значимость иммунной системы в защите от патогенов. Благодаря широкомасштабным геномным исследованиям были идентифицированы многие общие варианты генов, ассоциированные с чувствительностью к ряду инфекционных заболеваний, входящих и не входящих в ГКГС (главный комплекс гистосовместимости). Речь идет о таких инфекциях, как ВИЧ, гепатиты В и С, лепра, малярия [22] и др. Можно предположить, что дальнейшие геномные исследования по определению вариантов генов и гаплотипов, в т.ч. регионов HLA-I и HLA-II классов, а также других ГКГС-родственных генов позволят выделить факторы риска и протекции против активных форм заболевания туберкулезом, повысить диагностику, лечение и профилактику туберкулеза, а также улучшить наше понимание эволюции и эпидемиологии ТБ. Целью исследования являлось проведение сравнительного анализа распределения генов и гаплотипов системы HLA A, B, DRB1, DQA1, DQB1 у здоровых лиц и больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области для выделения маркеров риска развития различных клинических форм туберкулеза. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследуемую группу составили 86 больных туберкулезом легких русской национальности (29 женщин и 57 мужчин), находящихся на стационарном лечении в Противотуберкулезном диспансере №3 г. Челябинск. Согласно российской клинической классификации выделены следующие группы больных: больные с фибрознокавернозным туберкулезом - 11, инфильтративным - 53, очаговым - 13, цирроти-ческим - 1, туберкулемой - 3, экссудативным плевритом - 2, диссеминированным - 3 (Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 № 109). Бактериовыделение зарегистрировано у 73% больных. Группу сравнения составили 239 здоровых донора Челябинской областной станции переливания крови (109 женщин, 130 мужчин) русской национальности. Группы сравнения имели одинаковый социоэкономический статус. Для исследования были использованы образцы ДНК, выделенные стандартным методом из образцов периферической крови, взятой с ЭДТА, с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500 (Protrans, Germany). HLA-типирование проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции - PCR SSP. Генотипирование HLA DRB1, DQB1 и DQA1 проводили наборами НПФ «ДНК-технология» («ДНК-технология», Россия). Генотипирование HLA I класса (локусы A, B) проводили по методикам, описанным в статье Downing J.M.G. et al. [9]. Последовательности праймеров для определения полиморфизма HLA (34 HLA*A и 55 HLA*B) синтезированы в ООО «Синтол», Москва. Детекцию результатов проводили методом электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем 2,5 мкг/мл бромида этидия, в 0,5xTBE буфере (Хеликон, Москва). Для статистической обработки использовали стандартные генетические методы. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Нами был предпринят поиск генов HLA I и HLA II классов, которые могли бы быть маркерами риска развития клинически активных форм туберкулеза. Ранее нами была проведена оценка частотных распределений аллельных групп генов HLA A, B, DRB1 у больных туберкулезом и условно здоровых лиц. Было установлено наличие достоверно высокой частоты встречаемости у больных гена HLA A*24 по сравнению с контролем. Достоверно реже у больных встречался ген HLA А*02 [4]. Анализ распределения аллелей генов HLA DRB1 показал достоверно более высокую частоту встречаемости гена HLA DRB1*16 у больных с активным туберкулезом по сравнению с контрольной группой[5]. В настоящем исследовании мы провели сравнительный анализ частоты встречаемости генов HLA DQB1* и DQA1*, трехлокусных HLA A*-B*-DRB1* и DRB1*-DQA1*-DQB1* и пятилокусных HLA A*-B*-DRB1*-DQA1*-DQB1* гаплотипов в группе больных туберкулезом легких и контрольной группе. Достоверные различия были получены только в частоте встречаемости гаплотипов HLA DRB1*-DQA1*-DQB1*: у больных по сравнению с контрольной группой чаще встречался гаплотип DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/4 (0,069 против 0,031, х2=4,89, p=0,027, OR=2,42 95% CI 1,08-5,39), и на уровне тенденции у больных была повышена частота встречаемости гаплотипа DRB1*11-DQA1*05:01-DQB1*03:01 (0,150 против 0,100, х2=3,70, p=0,054, OR=1,72 95% CI 0,99-3,01). На следующем этапе проведено сравнение распределения генов системы HLA A, B, DRB1, DQA1, DQB1 у больных с разными клиническими фенотипами заболевания. При анализе распределения аллелей гена HLA В среди групп больных с различными фенотипами заболевания обнару- Таблица 1. Частота аллелей HLA А,В-генов в жена достоверно повышенная частота ipynnra с p;uiii,ivin клиническими фе- П1:По , нотипами туберкулеза легких, n(%) аллеля В*08 у больных с фибрознокавернозой формой туберкулеза по сравнению с группой больных с инфильтра-тивной формой (45,5% против 13,2%, p критерий Фишера=0,025, OR=5,48 95% HLA Фиброзно кавернозный Инфильтративный Очаговый А*01 4(36,4) 12 (22,6) 2 (15,4) А*02 2(18,2) 20 (37,7) 7 (53,9) А*24 4 (36,4) 14 (26,4) 5 (38,5) А*25 0 5 (9,4) 1 (7,7) А*29 0 (0) 1 (1,9) 0 А*30 0 (0) 4(7,55) 1 (7,7) B*07 4 (36,4) 14 (26,4) 2 (15,4) B*08 5(45,5A) 7 (13,2A) 0 B*13 0 (0) 7 (13,2) 2 (15,4) B*15 2(18,2) 2 (3,8C) 3 (23,1C) B*44 2(18,2) 14 (26,4) 0 (0) Примечание. Здесь и в табл. 2: А - P-value с поправкой Бонферрони <0,05 для групп с фиброзно-кавернозным и инфильтративным туберкулезом; С - P-value с поправкой Бонферрони <0,05 для групп с инфильтративным и очаговым туберкулезом; В - P-value с поправкой Бонферрони <0,05 для групп с фиброзно-кавернозным и очаговым туберкулезом. CI 1,31^22,74). В группе больных с очаговым туберкулезом данный аллель не встречался. Для больных с очаговой формой характерна более высокая частота гена HLA В*15 по сравнению с группой с инфильтративным туберкулезом (23,1% против 3,8%, p критерий Фишера=0,049, OR=7,65 95% CI 1,13^51,53). Результаты представлены в табл. 1. При сравнении групп с разными клиническими фенотипами заболевания по частоте встречаемости генов HLA II класса выявлено достоверное увеличение частоты встречаемости гена DRB1*03 в группе больных фиброзно-кавернозной формой туберкулеза по сравнению с группами с инфильтративной формой (54,5% и 20,8%, соответственно, %2 с поправкой Йетса=3,8, р=0,005, OR=4,58 95% CI Таблица 2. Частота аллелей HLA DRB1, DQA1, DQB1-генов в группах с разными клиническими фенотипами туберкулеза легких, n(%) HLA Фиброзно кавернозный Инфильтративный Очаговый DRB1*01 2 (18,2) 15 (28,3) 4 (30,8) DRB1*03 6(54,5АВ) 11 (20,8А) 1 (7,7В) DRB1*11 1 (9,1) 19 (35,8) 2 (15,4) DRB1*07 0 (0) 15 (28,3) 5 (38,5) DRB1*08 0 (0) 4 (7,5) 0 (0) DRB1*10 - (-) - (-) - (-) DRB1*15 2 (18,2) 7(13,2C) 5 (38,5C) DRB1*16 2 (18,2) 7(13,2) 1 (7,7) DQA1*02:01 0 (0) 15 (28,3) 5 (38,5) DQB1*02:01 6 (54,6) 24 (45,3) 5 (38,5) DQB1*06:02-8 4 (36,4) 11 (20,8С) 7 (53,9С) DQB1*05:02/4 2 (18,2) 8 (15,1) 1 (7,7) 1,18^17,77) и очаговой (54,5% против 7,7%, р критерий Фишера=0,023, OR=14,4 95% CI 1,36^151,39). Аллели DRB1*07 и DQA1*02:01 не встречались у больных с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза. У больных с очаговой формой достоверно чаще по сравнению с группой с инфильтративным туберкулезом встречаются аллели DRB1*15 (38,5% против 13,2%, p критерий Фишера = 0,049, OR=4,10 и 95% CI 1,04^16,12) и DQB1*06:02 - ^8 (53,9 против 20,8, %2 с поправкой Йетса=4,22, р=0,040, OR=4,45 и 95% CI 1,24^15,90). Результаты представлены в табл. 2. Сравнение распределения пятило-кусных гаплотипов между группами больных туберкулезом в зависимости от фенотипа заболевания показало, что гаплотип HLA A*01-B*08-DRB1*03-DQA1 *05:01-DQB 1*02:01 встречается только в группах больных с более тяжелыми формами туберкулеза - фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, ин-фильтративным туберкулезом легких и экссудативным плевритом. ОБСУЖДЕНИЕ В соответствии с новыми данными туберкулез намного старше чумы, тифозной лихорадки и малярии и мог уже поражать ранних гоминид [12]. Анцестральные микобактерии, прародители M.tuberculosis, вместе с предками других высоко адаптированных к человеку патогенов Salmonella typhi, Helicobacter pylori, а также иных бактерий, вирусов и гельминтов, сопровождали человека и коэволюционировали с ним еще до эпохи Палеолита [6, 10, 19]. Эти микроорганизмы прошли через эволюцию человека (гоминиды - Homo sapiens) как комменсалы (истинные комменсалы кишечника), «псевдокомменсалы» окружения, причинные агенты субклинических инфекций или асимптоматического носительства (персистенции). По меньшей мере, они были нашими «компаньонами» долгий период времени [10, 19] и все участвовали в становлении микробиоты человека, его корового микробиома (генов микробного сообщества), метагенома (сообщества генов человека и микробиоты), метаболома (комплекса метаболических свойств человека и микробиоты) и, в конечном итоге, суперорганизма [21]. Можно предположить, что длительное существование и тесный контакт возбудителя туберкулеза и хозяина (более 3 млн лет), его генетическая карта сопровождения анатомически современного человека в ходе миграции из Восточной Африки (50-70 тысяч лет назад) и расселения по всему миру (о чем свидетельствует наличие ассоциаций каждой из 6 филогенетических линий Mtb со специфической симпатрией человеческих популяций) [11] могли привести в результате эволюционной селекции к особым взаимоотношениям, в которых длительная персистенция Mtb отражает баланс интересов хозяина и патогена. Такие отношения способны длиться годы и даже человеческую жизнь, но не являться постоянными [2, 6, 10]. Как свидетельствуют исследования многих авторов, резистентность/чувствительность к патогенам организма человека, вероятнее всего, является полигенным свойством [8, 22, 24]. Если говорить о туберкулезе, то, вероятно, корректно рассматривать только гены, определяющие устойчивость/ чувствительность к реализации активных клинических форм туберкулеза и их фенотипа. Нами показано, что в геноме больных ТБ русской популяции, проживающих в Челябинской области (Южный Урал), достоверно чаще по сравнению со здоровыми людьми присутствуют аллели HLA A*24[4], DRB1*16[5], а также гаплотип DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02/4. Высокую частоту встречаемости указанных генов и га-плотипа, вероятно, можно рассматривать как этногеографические маркеры группы риска по развитию клинических форм ТБ легких. И в то же время, у представителей многих национальностей выявлено повышение частоты HLA-DR2 - серологической специфичности у больных туберкулезом, в которую входят гены HLA-DRB1*15 и 16 [14]. В настоящей работе, рассматривая возможность выделения генов и гаплотипов локусов HLA I и II класса в качестве идентификаторов различных клинических фенотипов туберкулеза, мы установили: для больных тяжелой фиброзно-кавернозной формы туберкулеза характерна высокая частота встречаемости генов В*08 и DRB1*03 по сравнению с инфильтративной и очаговой формами. Более того, у больных с этой клинической формой не встречаются аллели DRB1*07 и DQA1*02:01. У всех носителей этих аллелей наблюдалось закрытие полости и абациллирование, что может свидетельствовать об их ассоциации с благоприятным исходом. Согласно исследованиям Кондаковой М.Н. и др., наличие в генотипе DRB1*07 является прогностически благоприятным фактором течения туберкулеза органов дыхания [3]. В настоящее время известно, что некоторые индивидуумы высокочувствительны к диссеминированным формам туберкулеза, а другие, наоборот, способны локализовать инфекцию и предотвратить экстрапульмонарное распространение [8]. При очаговой форме у больных определена достоверно высокая частота аллелей HLA В*15, HLA DRB1*15, DQB1*06:02-8 по сравнению с инфильтративной формой. Возможно, их наличие обеспечивает иммунный ответ на патоген в рамках эволюционной дозволенности/ умеренности с целью сохранения вида, и эта форма иммунного ответа обеспечивает ограниченные локусы поражения без агрессивного развития деструкции ткани и экс-трапульмонарного распространения. Наиболее интересными, как нам кажется, являются результаты, свидетельствующие, что только в группах больных с более тяжелыми формами туберкулеза - фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, инфильтративным туберкулезом легких и экссудативным плевритом встречается га-плотип HLA A*01-B*08-DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01. Данный гаплотип входит в состав расширенного анцестрального гаплотипа 8.1 (HLA-A*01, B*08, TNFA-308, BfS, C4AQ0, C4B1, DRB1*03 ,DQA1*501, DQB1*201), который относится к аутоиммунным и связан с высокой продукцией TNFа - основного цитокина противотуберкулезного иммунного ответа [15]. Ранее нами было установлено неравновесное сцепление между генами HLA DRB1*03 и TNF-308*A: гаплотип HLA DRB1*03-TNF-308*A у больных туберкулезом легких встречался достоверно чаще по сравнению с контрольной группой [5]. Вероятным механизмом ассоциации гаплотипа 8.1 с туберкулезом может считаться развитие TNFa-управляемого дисбаланса («нейроэндокринная петля») вследствие увеличения выработки TNFa, что ведет к преобладанию второго типа цитокинового ответа, в частности, к увеличению уровня противовоспалительного цитокина IL10 [15], поляризующего иммунный ответ в сторону гуморального. В 2012, 2013 гг. представлены экспериментальные данные, свидетельствующие, что высокоактивный аллель TNFa может обусловить тяжелое течение туберкулеза у человека [18]. В основе такого процесса лежит бимодальный механизм работы высокого уровня TNFa, способный выступать промотором ранней резистентности макрофагов к Mtb (повышенная микробицидная активность), которая сменяется быстрым лизисом макрофагов вследствие активации программированного некроза (некропто-за) через индукцию продукции митохондриальных реактивных кислородных радикалов. Итогом этих событий является освобождение микобактерий в экстраклеточное окружение, их репликация и создание общей бактериальной нагрузки на организм. Таким образом, гаплотип HLA A*01-B*08-DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 у больных туберкулезом легких русской популяции, проживающих в Челябинской области (Южный Урал), может выступать в качестве маркера предрасположенности к развитию более тяжелых, прогрессирующих форм туберкулеза. Как свидетельствуют современные данные многочисленных исследований, эволюционный ответ на патоген отработан навсегда и его не могут исключить окружающие вариации, но могут модифицировать [7]. Можно предположить, что не малую роль в прогрессии от инфицирования Mtb к клинической презентации способны играть вариации структурной и функциональной композиции кишечной микробиоты, которые не только участвуют в формировании физиологического гомеостаза организма хозяина, но оказывают влияние на чувствительность к инфекционным заболеваниям за счет изменений иммунных ответов [1, 2, 20]. Техногенная революция, начавшаяся в XIX веке и получившая развитие в XX - XXI веках, привела к серьезным флюктуациям в отношениях хозяин-микробиота - патоген-окружающая среда. Это связано с двумя важными аспектами: 1. Изменение эпидемиологических процессов - рост населения планеты и урбанизация, что увеличивает трансмиссию возбудителя; широкая географическая миграция населения, приводящая к клинической презентации различных штаммов или линий Mtb различным популяциям людей [8, 11], высокая санитарно-гигиеническая культура населения развитых стран, рост иммуно-компрометированных лиц и т.д. 2. Дестабилизация микробиоты человека - нарастание процента детей, рожденных нефизиологическим путем - кесарево сечение, снижение количества новорожденных детей, вскармливаемых грудным молоком, широкомасштабное использование антибиотиков даже в первые недели, месяцы жизни человека [7]. Итогом таких воздействий является снижение вертикальной передачи от матери к потомству эволюционных анцестеров микробиоты с заданным репертуаром функциональных свойств при отсутствии восполнения их за счет горизонтальной трансмиссии [7] и при высокой вероятности включения из окружающей среды в микробиоту новорожденного «заменителей низкого качества». В результате, несмотря на то, что сохраняется «азбука микробиоты» - ее коровые эволюционноконсервативные структуры и функции, высока вероятность нарушения «построения слов, фраз» и, в конечном итоге - «грамматики информационной системы микро-биомов» [1]. Следствием такого сценария является дестабилизация физиологического гомеостаза, в том числе иммуно-нейро-эндокринной оси, нарастание биологических трансформаций - здоровье/патологический процесс и возрастание риска индукции перехода от персистентной формы сосуществования микобактерий с хозяином к их активной агрессии.

About the authors

A. L Burmistrova

Chelyabinsk State University

Chelyabinsk, Russia

S. V Belyaeva

Chelyabinsk State University

Chelyabinsk, Russia

T. A Suslova

Chelyabinsk Hemotransfusion Station

Chelyabinsk, Russia

O. V Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

References

Supplementary files