IMMUNE DIAGNOSTICS OF DISORDERS IN THE IFN-A/NK-CELL SYSTEM IN PATIENTS WITH FREQUENTLY RECURRENT HERPES SIMPLEX

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Согласно клиническим рекомендациям стандартом фармакотерапии пациентов с ЧРПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклео-зидами, высокая эффективность которых в терапии различных форм герпесвирусных инфекций (ГВИ) доказана многочисленными исследованиями. Однако монотерапия противовирусными препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Частые рецидивы ГВИ, вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа. На сегодняшний день имеется широкий спектр препаратов иммуномодулирующей направленности, список которых постоянно пополняется новыми препаратами. В последнее время широко применяются препараты рекомбинантного ИФН-а и индукторы ИФН-а как с лечебной, так и с профилактической целью. Огромное количество публикаций посвящено применению препаратов данной группы в комплексной терапии ЧРПГ [1, 2, 6, 7]. Однако именно назначение иммуномодулирующей терапии является наиболее сложным вопросом в терапии ЧРПГ. Этому способствует несовершенство современных подходов к методологии назначения иммунокорригирующей терапии, которая сегодня очень часто назначается эмпирически и провоцируется отсутствием иммунодиагностического комплекса, позволяющего оценивать вариабельность чувствительности пациента к этим препаратам в динамике клинического процесса, предусматривать индивидуальный подход к назначению иммуномодуляторов, оценивать индивидуальный характер выраженности вторичного иммунодефицита и его динамику на фоне назначенной иммунокорригирующей терапии. Интерфероны I типа являются ключевыми факторами естественной противовирусной резистентности, обладая как прямым противовирусным, так и иммуномодулирующим действием. В частности, ИФН-а является важнейшим активатором цитотоксичности NK-клеток. Одними из основных эффекторных клеток, противодействующих репликации вируса простого герпеса (ВПГ) в организме, являются NK-клетки. При ЧРПГ описано снижение продукции ИФН-а [3, 8 - 10]. Однако до сих пор трудно объяснить наблюдаемые в клинической практике расхождения между высокой продукцией ИФН-а и тяжелым течением ЧРПГ, остаются неясными причины неодинаковой эффективности применения препаратов рекомбинантного интерферона и индукторов ИФН у пациентов с ЧРПГ. На данный момент становится очевидным, что при выборе вектора иммунокоррекции необходим персонализированный подход с учетом чувствительности целевого показателя иммунной системы пациента к потенциальному лечебному воздействию. Целью данной работы стало изучении влияния рекомбинантного ИФН-а на функциональную активность NK-клеток в комплексе с оценкой способности к синтезу собственного ИФН-а у пациентов с ЧРПГ для выявления возможных вариантов иммунологических нарушений в системе ИФН-а/NK-клетка. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Под наблюдением находились 48 пациентов (9 мужчин, 39 женщин) в возрасте 29 - 63 лет с верифицированным диагнозом ЧРПГ. В исследование были включены пациенты с генитальной (n=31), лабиальной (n=10) и смешанной локализацией процесса (n=7). Длительность заболевания у 40 пациентов составляла более 5 лет, у 8 чел. - от 2 до 4 лет. Частота обострений на момент обследования была 6 и более раз в год. В стадию обострения (в пределах 48 ч с момента появления высыпаний) обследованы 35 человек; из них 18 обследованы также в стадию ремиссии (более 2 недель с момента появления высыпаний); 13 человек обследованы только в стадию ремиссии. Контрольную группу составил 31 здоровый донор в возрасте 22 - 57 лет (13 мужчин и 19 женщин). Критериями включения в группу контроля являлось отсутствие острых и хронических инфекционных и воспалительных заболеваний, в том числе ВПГ, в течение минимум 1 месяца до момента взятия крови. От всех исследуемых получали по 15 мл венозной гепаринизированной крови. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографина, отмывали средой 199 и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС): RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина (Панэко, Россия). МНК культивировали в полипропиленовых пробирках (2х106/мл/пробирку) в присутствии рекомбинантного человеческого ИФН^2Ь (Invitrogen, Великобритания) в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл в течение 24 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2, 37°С). Контрольные клетки культивировали без ИФН-а. Через 24 ч МНК отмывали и ресуспендировали в ПКС для исследования дегрануляции NK-клеток и NK-активности. Дегрануляцию NK-клеток, культивированных 24 ч с ИФН-а или без него, оценивали с помощью проточной цитометрии по экстернализации маркера CD107a. Использовали методику [4] c некоторыми изменениями: 1) вместо FITC-меченных моноклональных антител к CD107a использовали PC5-меченные (BD Pharmingen, США); 2) поскольку метка PC5 нечувствительна к pH, то моненсин, использованный ранее для ингибирования закисления эндосом [4, 5], не добавляли. В качестве индуктора дегрануляции использовали клетки K562 (соотношение МНК:K562=1:1). Результаты представляли как процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем CD3CD56+ NK-клеткам после инкубации без индукторов дегрануляции и с клетками K562. Рассчитывали следующие параметры: дегрануляция NK-клеток = (% CD107a+ NK-клеток в присутствии клеток K562) - (% CD107a+ NK-клеток в отсутствии индукторов дегрануляции) при данной концентрации ИФН-а. NK-активность МНК, культивированных 24 ч с различными концентрациями ИФН-а, исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловым эфиром) [4]. Использовали соотношение эффектор:мишень, равное 50:1. NK-активность х 100% была равна (% погибших мишеней в опыте - % спонтанной гибели) : (100% - % спонтанной гибели). Синтез ИФН-а оценивали по способности мононуклеарных клеток крови синтезировать ИФН-а in vitro в ответ на суточное культивирование в присутсвии таких индукторов ИФН, как ВПГ-1, ВПГ-2 и вирус болезни Ньюкасла (ВБН). Оценивали уровень ИФН-а в супернатантах стимулированных клеток (ИФА, «Цитокин», Санкт-Петербург). Данные представляли как медиану (10 - 90 процентиль), кроме случаев, отмеченных отдельно. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS 11.5 для Windows. Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали критерий Манна-Уитни (U-тест). РЕЗУЛ ЬТАТЫ По данным нашего исследования процент NK-клеток, дегранулирующих в присутствии клеток-мишеней К562 (% CD107a+CD3-CD56+ клеток), снижается с возрастом, причем снижение анализируемого показателя у здоровых людей начинается уже после 35 лет. Суточная стимуляция in vitro рекомбинантным ИФН-а в трех различных концентрациях приводила к дозозависимому увеличению процента дегранулирующих NK-клеток в среднем примерно на 20% (19,3+1,1%). Однако каждый из ИФН-стимулированных показателей, также как и исходный, снижался после 35 лет. Необходимо отметить, что данное снижение является скорее относительным, поскольку влияние ИФН-а в нашем исследовании выражалось в виде 20% увеличения процента дегранулирующих NK-клеток в независимости от исходного (снижен или нормален). Другими словами, ответ на цитокин в абсолютных цифрах с возрастом не меняется, с возрастом падает исходный показатель, а следовательно, и ИФН-стимулированный показатель в итоге оказывается низким. Учитывая выявленную у здоровых доноров зависимость исходного процента дегранулирующих NK-клеток от возраста и зависимость ИФН-стимулированных показателей от исходных нестимуированных показателей, для корректной оценки влияния суточной стимуляции рекомбинантным ИФН-а in vitro на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРПГ мы разделили группу пациентов по медиане возраста (44 года) на две возрастные группы: «молодые» (<44) и «пожилые» ( >45) (далее - молодые и пожилые). Самый высокий процент NK-клеток, дегранулирующих в присутствии К562 (% CD107a+CD3-CD56+ клеток) оказался в группе молодых доноров. Медиана данного показателя составили 22,2. В остальных анализируемых подгруппах данный показатель был достоверно вдвое снижен по сравнению с молодыми донорами. Так, медиана в группе молодых пациентов с ЧРПГ составила 11,1 и 11,4 в обострение и в ремиссию соответственно; в группе пожилых с ЧРПГ - 11,3 и 11,6 в обострение и в ремиссию соответственно; в группе пожилых доноров 11,2. Суточная стимуляция рекомбинантным ИФН-а in vitro в трех используемых концентрациях приводила к дозозависимому увеличению процента NK-клеток, дегранулирующих в присутствии клеток-мишеней К562 (% CD107a+CD3-CD56+ клеток). Как и в случае со здоровыми донорами, в группе пациентов с ЧРПГ показатель увеличивался в целом по группе также на 20% (в группе молодых доноров дегрануляция увеличилась с 22,2 до 43%; в группе пожилых доноров - с 11,2 до 31,4%; в группе молодых пациентов с ЧРПГ - с 11,1 - 11,4 до 33,3 - 28,4% в фазы обострения / ремиссии соответственно; в группе пожилых пациентов с 11,3 - 11,6 до 28,9 - 29,4% в фазы обострения/ремиссии соответственно). Оценивая кривые зависимости процента дегранулирующих NK-клеток от стимулирующей концентрации ИФН-а, мы обратили внимание, что у части пациентов форма данной кривой имеет тенденцию к раннему выходу на плато после концентрации в 10 Ед/мл. Другими словами, у части пациентов дальнейшее увеличение стимулирующей концентрации ИФН-а от 10 до 100 Ед/мл не вызывало дальнейшего увеличения процента дегранулирующих NK-клеток. В связи с вышесказанным, мы ввели понятие прирост 1000 - 10 как разницу показателей процента дегранулирующих NK-клеток под влиянием максимальной и минимальной из используемых концен- Показатели ИФН-а, Тип А Тип В Доноры Ед/мл обострение ремиссия обострение ремиссия Дегрануляция 0 11,3 11,5 6,4 11,4 13,8 (% CD107a+ (6-24,6) (6,3-24,6) (2,6-29,5) (3,1-26,7) (4,3-29,6) CD3-CD56+) 10 21,4 20,3 12,7 21,1 26,6 (12,8-38,1) (11,8-38,9) (7,7-40,8) (7,6-47,4) (7,9-46,4) 100 26,5 27,5 15,1* 23,1 31,8 (16,4-44,3) (16,9-44,4) (9,3-44,4) (7,8-50,6) (12,5-50,1) 1000 30,2 32,1 15,6* 23,9 33 (18,9-44,9) (19,8-49,9) (8,7-44,6) (10,7-51,2) (15,3-56,7) Итоговый прирост 8,2 9,8 2,6* 2,9* 8,5 от 10 до 1000, % (4,6-14,1) (5,3-13,4) ,9) 3, ,0 ,9) 3, ,3 (2, (3,5-12,9) Примечани е. * p<0 001 по сравнению с группой доноров и с группой А (тест Манна-Уитни); показаны медианы (10 - 90 процентиль). траций. Показатель прироста сильно варьировал. Пациентов, имеющих такие низкие цифры по данному показателю, которые не встречаются в группе доноров <44 лет, мы объединили в отдельную подгруппу, обозначив ее подгруппа В (тип ответа В). Остальных пациентов с ответом на цитокин как у доноров мы объединили в подгруппу А (тип ответа А). Подгруппы А и В имеют достоверные отличия по показателю прироста (табл. 1). В нашем исследовании при анализе исходных нестимулированных показателей NK-активности группа пациентов с ЧРПГ ни в фазу обострения, ни в фазу ремиссии не отличалась от здоровых доноров. Суточная стимуляции ИФН-а мононуклеарных клеток пациентов приводила к увеличению цитотоксичности NK-клеток, однако в фазу ремиссии каждый из ИФН-стимулированных показателей у пациентов с ЧРПГ был достоверно ниже, чем аналогичный показатель при соответствующей концентрации у здоровых доноров, причем данное явление отмечалось при всех трех используемых концентрациях(10, 100 и 1000 Ед). В фазе обострения статистически значимых различий по влиянию ИФН-а на цитотоксичность не выявлено (рис. 1). При проведении анализа влияния ИФН-а на цитотоксичность NK-клеток в двух выделенных подгруппах (А и В) мы обнаружили, что они имеют принципиальные отличия по параметрам цитотоксичности NK-клеток и их изменению под влиянием ИФН-а в различные фазы клинического процесса. Пациенты группы А в фазу ремиссии по показателям исходной NK-активности достоверно не отличались от здоровых Рис. 1. Влияние ИФН-а на цитотоксичность NK-клеток пациентов с ЧРПГ в фазу обострения и ремиссии и у здоровых доноров. Показаны медианы по группе. В каждой группе столбцов слева направо: обострение, ремиссия, доноры; *р<0,05; **р<0,01 по сравнению с донорами. Кюодолрэцда ИФН-а. Ць'иг доноров, в то время как ИФН-стимулированные показатели NK-активности были достоверно снижены по сравнению с группой здоровых доноров, причем данное явление наблюдалось при всех трех используемых концентрациях ИФН- а (табл. 2). Другими словами, в фазу ремиссии пациенты патогенетического типа А имеют дефицит ответа NK-клеток на ИФН-а. В фазу обострения ИФН-стимулированные показатели NK-активности пациентов данной группы повышались и не имели статистически значимых отличий от здоровых доноров. Напротив, пациенты патогенетического типа В в фазу ремиссии ни по исходным, ни по ИФН-стимулированным показателям NK-активности не имели статистически значимых отличий от доноров. В то время, как фаза обострения характеризовалась выраженным дефицитом функций NK-клеток, а именно, втрое сниженной по сравнению со здоровыми донорами исходной NK-активностью, а также почти в 2,5 раза сниженными ИФН-стимулированными показателями NK-активности при каждой из используемых концентраций. Более того, использование даже максимальной концентрации в 1000 Ед/мл едва позволяло добиться хотя бы уровня исходной NK-активности здоровых доноров. В нашем исследовании пациенты с ЧРПГ как в фазу обострения, так и в фазу ремиссии по способности мононуклеарных клеток к синтезу ИФН-а в ответ на суточную стимуляцию такими вирусными индукторами, ВПГ-1, ВПГ-2, а также стандартно используемый в качестве индуктора ВБН, не имели достоверных отличий по сравнению с контрольной донорской группой ни по одному из используемых индукторов. Мы проанализировали способность к синтезу собственного ИФН-а у пациентов с выделенными двумя типами ответов NK-клеток на рекомбинантный ИФН-а (А или В) (рис. 2). У пациентов с ответом на рекомбинантный ИФН-а типа А способность к синтезу собственного ИФН-а в ответ на вирусные индукторы была сопоставима с таковой у здоровых доноров как при ремиссии, так и при обострении. Напротив, пациенты с ответом на рекомбинантный ИФН-а типа В в фазу ремиссии не только не имели сниженной способности к интерфероногенезу, но имели тенденцию к повышению данной способности по сравнению с группой контроля, более чем в 2,5 раза в ответ на индукторы вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, ответ на стандартный индуктор ВБН был сопоставим с таковым у доноров. В фазу обострения тип В характеризовался достоверно высоким (по сравнению с группой контроля и с типом А) уровнем спонтанного синтеза ИФН-а и достоверно сниженным уровнем синтеза ИФН-а в ответ на стандартный индуктор ВБН. При анализе исследуемых показателей в динамике клинического процесса отмечалось отсутствие какой-либо тенденции к Таблица 2. Особенности влияние ИФН-а на цитотоксичность NK-клеток пациентов с ЧРПГ подгрупп А и В Показатели ИФН-а, Ед/мл Тип А Тип В Доноры обострение ремиссия обострение ремиссия NK-активность 0 24,2 20 8* 16,2 24,9 (5,8-7,5) (2,5-58,3) (3,3-50,6) (3,9-74,2) (10,8-68,2) 10 41,9 28* 17,3# 27,9 58 (8-77,2) (4,6-63,3) (8,4-73,5) (12,5-81,9) (22,1-74,1) 100 54,1 36,1* 19,7* 26,7 54,8 (31,7- (13,3-78,4) (7,2-70,9) (4,6-79,9) (12,5-79,2) 77,8) 1000 55,1 36,7* 24,7** 31,5 66,5 (14,6-82,5) (10,9-70,1) (8,7-81,3) (12-82,7) (37,2-81,0) Итоговое увеличение 6,9 6,5** 1,0* 5,1* 10,6 NK-активности (-1,8-27,4) (-3,6-17,5) (-15-14) (-0,5-16,9) (-3,4-27,1) под влиянием ИФН-а П римечание. * p<0,05, ** p<0,01 по сравнению с группой доноров (тест Манна-Уитни); # p=0,068. Рис. 2. Особенности синтеза ИФН-а в ответ на индукторы вирусной природы у пациентов с ЧРПГ подгрупп А и В в фазу обострения и ремиссии. Показаны медианы по группам. изменению показателей в зависимости от фазы клинического процесса при типе А. Пациенты группы В, напротив, достоверно отличались как от группы контроля, так и по показателям в зависимости от фазы клинического процесса. Фаза ремиссии характеризовалась повышенными показателями интерфероногенеза, достигающими статистически значимой разницы в ответ на индуктор ВПГ-2. В фазу обострения отмечался достоверно повышенный спонтанный синтез ИФН, но при этом отмечалось резкое падение способности к синтезу ИФН в ответ на индукторы по сравнению с фазой ремиссии на ВПГ-1 в 5 раз, на ВПГ-2 в 3 раза, на ВБН в 2,3 раза. ОБСУЖДЕНИЕ Вышеописанные выявленные иммунологические нарушения позволяют предположить различные варианты патогенеза рецидивирования у выделенных двух групп пациентов. Патогенез рецидивирования у пациентов с типом В возможно объяснить с позиции существующей «динамической гипотезы», которая предусматривает постоянную репликацию и выброс из ганглия вируса герпеса, который, достигнув кожи, вызывает микрофокусы инфекции, сдерживаемые механизмами защиты, что предупреждает рецидивы. Описанный механизм рецидивирования отражается в иммуно-диагностической картине в виде повышенного в ремиссию синтеза ИФН-а в ответ на индукторы ВПГ-1 и ВПГ-2 нормальными показателями NK-активности и нормальной чувствительностью NK-клеток к действию рекомбинантного ИФН-а. В фазу же обострения у пациентов с повышенным интерфероногенезом в ремиссию отмечалось резкое падение всех перечисленных выше показателей в 2 - 4 раза. Другими словами, причиной рецидивирования при данном типе является истощение иммунного ответа вследствие длительной стимуляции постоянно реплицирующимся вирусом. Исходя из вышеизложенного, у пациентов данной подгруппы для предупреждения рецидивов возможно предположить потенциальную эффективность противовирусной терапии в супрессивном режиме. Назначение иммуномодулирующей терапии дискутабельно, поскольку, с одной стороны, при постоянной вирусной нагрузке необходима иммуномодулирующая поддержка, однако не приведет ли это к еще более скорому истощению и не спровоцирует ли скорый рецидив при описанном варианте патогенеза? Патогенез рецидивирования у пациентов с типом А возможно объяснить с позиции существующей «статической гипотезы», при которой вирус герпеса находится в клетках паравертебрального сенсорного ганглия в интегрированном или свободном непродуктивном состоянии, что отражается в иммунодиагностической картине в виде спокойных показателей интерфероногенеза, нормальной NK-активности и снижении чувствительности NK-клеток к ИФН-а, что не проявляет себя клинически 33 3. ЖМЭИ 3 № 31 в виду отсутствия вирусной нагрузки. Под влиянием пускового фактора вирус активируется и перемещается из ганглия по аксону периферического нерва в эпителиальные клетки, где реплицируется, что требует увеличения цитотоксичности NK-клеток, но сниженная чувствительность NK-клеток к ИФН-а не позволяет достичь адекватного увеличения цитотоксичности. Клинически имеет место рецидив. Исходя из вышеизложенного, у пациентов данной подгруппы возможно предположить потенциальную эффективность противовирусной терапии в эпизодическом режиме и применение иммуномодулирующей терапии для скорейшего купирования рецидива (индукторы ИФН-а, препараты ИФН-а), поскольку чувствительность NK-клеток к ИФН в обострении восстанавливается. Таким образом, пациенты с ЧРПГ являются гетерогенной группой по показателям в системе цитотоксичность NK-клеток/ИФН-а. В нашем исследовании мы выделили два типа ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-а. При проведении иммунокорригирующей терапии необходим персонализированный подход с учетом особенностей ответа NK-клеток на ИФН-а, поскольку две выделенные группы пациентов с ЧРПГ (А и В) имеют принципиальные отличия по параметрам цитотоксичности NK-клеток и их изменению под влиянием ИФН-а в различные фазы клинического процесса, а также по показателям синтеза ИФН-а в ответ на вирусные индукторы.

About the authors

A. V Karsonova

Sechenov First Moscow Medical University, State Scientific Centre Institute of Immunology

Moscow, Russia

A. E Shulzhenko

Evdokimov Moscow State Medical Stomatological University, State Scientific Centre Institute of Immunology

Moscow, Russia

A. V Karaulov

Sechenov First Moscow Medical University

Moscow, Russia

References

Supplementary files