THE ROLE OF PRO- AND ANTIOXIDANTS OF MICROORGANISMS IN REGULATION OF SYMBIOSIS HOMEOSTASIS MECHANISMS (ON THE MODEL OF HUMAN VAGINAL BIOTOPE)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Симбиозы в биотопах тела человека (ассоциации между бактериями, грибами и многоклеточным организмом) являются уникальными системами для изучения взаимоотношений между различными видами, обусловленными выработкой разнообразных химических соединений [3]. Одними из таких химических соединений являются активные формы кислорода, в частности пероксид водорода, продуцируемый представителями нормальной микрофлоры вагинального биотопа - лактобациллами [2, 13]. Активные формы кислорода способны разнонаправленно модулировать характеристики бактерий, что влечет за собой изменение характера их взаимодействия друг с другом, в том числе и с организмом хозяина. Известно, что продукция иммунными клетками хозяина активных форм кислорода блокирует передачу сигнала пептидного аутоиндуктора у Staphylococcus aureus [14], ускоряя элиминацию патогена. Также установлено, что продуцируемый лактобациллами пероксид водорода стимулирует синтез клетками хозяина антимикробных веществ и потенцирует их эффективность, усиливает рост и антагонистическую активность нормальной микрофлоры [1, 2]. Тем не менее, неясной остается роль продуцируемых микросимбионтами прооксидантов и их функциональных антагонистов - антиоксидантов в регуляции механизмов гомеостаза симбиоза на примере вагинального биотопа, что и определило цель настоящего исследования. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследовано 116 образцов отделяемого из заднего свода влагалища 63 женщин с эубиозом влагалища, 53 - с дисбиозом, взятых универсальным зондом и высеянных на селективные питательные среды не позднее 2 часов с момента взятия материала. Исследуемый материал засевали на плотные питательные среды: 5% кровяной агар, 20% сывороточный агар, среду Эндо, MRS-агар (Sifin, Германия) в соответствии с рекомендациями [11] и инкубировали в микроаэрофильных условиях при 37°C в течение 24 - 48 часов. Выделенные штаммы идентифицировали общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств [9]. Оценку микроэкологического состояния биотопа проводили согласно [3]. В качестве тест-штаммов использовали клинические изоляты S.aureus и Escherichia coli из коллекции ИКВС УрО РАН. Наличие метаболитов с прооксидантными (пероксид водорода и ингибиторы каталазы) и антиоксидантными свойствами (общая антиоксидантная активность и способность снижать бактерицидность гидроксильных радикалов) определяли в фильтратах культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов (0,22 ^м, Millipore). Способность лактобацилл продуцировать Н2О2 определяли ранее описанным способом [1], продукцию ингибиторов каталазы - по снижению уровня каталазной активности тест-штамма S.aureus ATCC 6538P [5]. Общую антиоксидантную активность бактериальных метаболитов определяли с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозила, в качестве положительного контроля использовали Тролокс™ [12] и выражали в условных единицах (у.е.). Способность к снижению бактерицидной активности гидроксильных радикалов определяли, как описано ранее [10]. Внеклеточные полисахариды лактобацилл и коринебактерий осаждали согласно [8]. Продукцию про- и антиоксидантов у микроорганизмов регулировали добавлением лактата, ацетата, пропионата, бутирата, аскорбата, триметиламина, этилендиами-на, спермина, пероксида водорода в среду культивирования до конечной концентрации 1мкМ/мл и выделенных из культуральных жидкостей экзополисахаридов в концентрациях с антиоксидантной активностью, эквивалентной 1 мкМ аскорбата. Бактерицидную активность гидроксильных радикалов, образующихся из пероксида водорода, продуцируемого лактобациллами, оценивали с использованием ранее описанного метода [4]. Информативность присутствия про- и антиоксидантов для оценки микроэколо-гического состояния биотопа определяли с использованием методики неоднородной последовательной процедуры [7], включающей в себя: подготовку перечня признаков; накопление наблюдений с достоверной верификацией диагноза осложнения; распределение частот признаков для дифференцируемых групп; определение отношения вычисленных из частот вероятностей, с которыми признак наблюдался у разделяемых групп; вычисление диагностических коэффициентов; вычисление информативности признаков; распределение признаков в порядке убывания их информативности; выбор пороговых значений суммы диагностических коэффициентов; проверку слепым методом полученной диагностической таблицы на случайной выборке и вынесение решения о принадлежности или непринадлежности биотопа к группе эубиоза или дисбиоза. Сумму диагностических коэффициентов (ДК), выраженную в условных единицах, использовали для оценки уровня продукции про- и антиоксидантов в биотопе. Для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни, для сравнения частот встречаемости использовали критерий согласия Пирсона (%2) [6]. В качестве минимально допустимого использовали уровень значимости р<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ В результате исследования установлено, что уровень продукции пероксида водорода лактобациллами, выделенными от женщин с эубиозом влагалища, находился в диапазоне 1,5±0,3 - 6,4±0,7 мМ и был существенно выше, чем при дисбиозе - 0,4±0,1 - 2,1±0,4 мМ (p<0,01). Способность ингибировать каталазу у микроорганизмов, выделенных при эубио-зе, встречалась в 36 - 94% случаев, тогда как при дисбиозе - в 8 - 43% (p<0,01). Снижение бактерицидного действия гидроксильных радикалов внеклеточными метаболитами у микроорганизмов, выделенных при эубиозе, встречалось в 59 - 96% случаев, при дисбиозе - в 14 - 46% (p<0,01). Уровень общей антиоксидантной активности (ОАА) у микроорганизмов, выделенных при эубиозе, составил 4,8±0,5 - 9,7±0,4 у.е., тогда как при дисбиозе - 1,8±0,2 - 3,9±0,8 у.е. (p<0,01). Таким образом, можно отметить, что микроорганизмы, выделенные от женщин с эубиозом влагалища, в большей мере обладали способностью продуцировать про- и антиоксиданты в сравнении с дисбиотическими изолятами. В итоге применения неоднородной последовательной процедуры распознавания образцов было выяснено, что исследуемые биотопы, дифференцированные на 2 группы по наличию или отсутствию в них микроэкологических нарушений (эубиоз - группа I и дисбиоз - группа II), можно также подразделять и по наличию или отсутствию в них представителей Информативность по мере убывания маркеров - признаков продукции нормалъной микрофлоры про- и антиоксидантов бактериями для оценки микроэкологического статуса биотопа способных продуцировать про- и антиоксиданты в определенном диапазоне концентрации. Наличие признака Диапазон Частота ДК Информа тивность II Продукция Н2О2 >1,8 мМ + 58 9 7,34 6,58 - 5 44 -10,2 Сумма 63 53 Ингибирование каталазы + 61 18 4,55 5,57 на 20% и более - 2 35 -13,2 Сумма 63 53 ОАА>5,2 у.е. + 52 7 7,96 5,17 - 11 46 -6,96 Сумма 63 53 Более 1 изолята, продуци + 48 22 2,64 1,13 рующего прооксиданты - 15 31 -3,90 Сумма 63 53 Более 1 изолята, продуци- + 39 28 0,69 1,07 рующего антиоксиданты - 24 25 -0,93 Сумма 63 53 Примечание. + Присутствие маркера в биотопе, - отсутствие. Наиболее значимыми признаками, определяющими состояние биотопа в порядке убывания, оказались: продукция лактобациллами пероксида водорода в концентрации более 1,8 мМ, синтез ингибиторов каталазы, образование веществ, снижающих бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременное присутствие в вагинальном биотопе двух и более штаммов, продуцирующих прооксиданты или антиоксиданты (табл.). Анализ полученных данных позволяет утверждать, что одновременное присутствие в биотопе микроорганизмов с высоким уровнем продукции про- и антиоксидантов является признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождаются смещением баланса про- и антиоксидантов (рис.1). Выяснено, что состоянию эубиоза и дисбиоза присущи свои соотношения уровня продукции про- и антиоксидантов. Так, для биотопов с эубиозом была характерна продукция антиоксидантов в диапазоне 3,65 - 9,8 у.е. при среднем значении 7,8±0,18 у.е., а для биотопов с дисбиозом диапазон был шире - 0,1 - 9,5 у.е., и средний уровень составил 2,2±0,31 у.е. (p<0,05). Среднее значение уровня продукции прооксидантов в биотопах с эубиозом было выше, чем при дисбиозе: 7,7±0,17 против 1,8±0,2 у.е. (p<0,01), а диапазон соответственно составлял 4,9 - 9,9 и 0,16 - 6,5 у.е. В целом следует отметить, что соотношение уровня продукции антиоксидантов к прооксидантам при эубиозе составляло в среднем 1,03±0,2 у.е., тогда как при дисбиозе - 4,2±0,9 у.е. (p<0,01). Следует отметить, что для биотопов с эубиозом характерно наличие микроорганизмов с высоким уровнем продукции и прооксидантов, и антиоксидантов, а их соотношение близко к единице, тогда как для дисбиоза характерно многократное превышение количества антиоксидантов над прооксидантами. Все это свидетельствует о том, что баланс про- и антиоксидантов обеспечивает регуляцию и поддержание стабильности биоценоза. Рис. 1. Связь между продукцией про- и антиоксидантов микроорганизмами и состоянием микробиоценоза. Ряд веществ оказывал стимулирующее влияние на продукцию пероксида водорода лактобациллами. Продукция пероксида в контроле составила 3,4±0,8 мМ, а после добавления лактата увеличивалась до 5,4±0,3 мМ (p<0,05), аскорбата - 4,1±0,7 мМ (p<0,05), экзополисахаридов L. plantarum и C. minutissimum - 4,8±0,4 (p<0,05) и 4,2±0,6 мМ (p<0,05), соответственно. Напротив, добавление к культу-ре-продуценту ацетата приводило к угнетению пероксидпродукции до 1,9±0,13 мМ (p<0,05), пропионата - до 1,62±0,11 мМ (p<0,01), этилендиамина - до 1,17±0,08 мМ (р<0,01), триметиламина - до 1,16±0,08 мМ (р<0,01), бутирата - до 1,13±0,08 мМ (р<0,01), пероксида водорода - до 0,98±0,07 (р<0,01) мМ и спермина - до 0,72±0,05 мМ (р<0,001). Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что продукция пероксида водорода лактобациллами стимулируется лактатом и антиоксидантами - аскорбатом и экзополисахаридами представителей нормальной микрофлоры L. plantarum и C. minutissimum. Напротив, вещества, присутствующие в биотопе при дисбиотических нарушениях - амины (триметиламин, этилендиамин, спермин) и летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная), значительно угнетали продукцию пероксида. Рис. 2. Выживаемость S. aureus и E.coli в системе генерации гидроксильных радикалов в зависимости от содержания пероксида водорода, продуцируемого лактобациллами. При изучении влияния этих же соединений на общую антиоксидантную активность лактобацилл было установлено, что по сравнению с контролем (12,8±0,9 у.е) пероксид водорода стимулировал ОАА до 22,4±1,5 у.е. (р<0,05), лактат - до 18,9±1,1 у.е. (р<0,05). Существенное снижение общей антиоксидантной активности отмечено после добавления к продуценту спермина - 6,4±0,7 у.е. (р<0,05), пропионата - 6,3±0,7 (р<0,05), этилендиамина - 6,0±0,8 (р<0,05), триметиламина - 5,9±0,6 (р<0,05), бутирата - 5,4±0,5 (р<0,05), аскорбата - 4,1±0,3 у.е. (р<0,05). Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что продукция антиоксидантов стимулируется факторами среды, наличие которых ассоциировано с состоянием эубиоза в женском репродуктивном тракте, такими как пероксид водорода и лактат, и угнетается летучими жирными кислотами и аминами, наличие которых характерно для дисбиоза. Для доказательства важной роли про- и антиоксидантов в поддержании нормального экологического состояния вагинального биотопа оценивали бактерицидность гидроксильных радикалов, образующихся из пероксида водорода лактобацилл. Установлено, что при добавлении ионов железа (II) к метаболитам пероксидпроду-цирующих лактобацилл, согласно определенным нами ранее принципам создания оптимальных условий для генерации гидроксильных радикалов [4], выживаемость клеток тест-штаммов S.aureus (Гр+) и E.coli (Гр-) значительно снижалась (рис. 2). Метаболиты лактобацилл, содержащие пероксид водорода в диапазоне концентрации 0 - 5,4 мМ сами по себе не оказывали бактерицидного эффекта на S. aureus и E.coli. Однако добавление к метаболитам лактобацилл 5 мкМ раствора сульфата железа (II) приводило к снижению выживаемости бактерий. Так, при совместном действии метаболитов лактобацилл и сульфата железа (II) численность выживших клеток E.coli уменьшалась с 4,4±0,15 до 1,6±0,1 lg КОЕ/мл при содержании пероксида водорода в диапазоне 1 - 5,4 мМ, тогда как в контроле этот показатель составил 5,5±0,21 lg КОЕ/ мл. Аналогичные результаты были получены и для S. aureus: численность клеток в контроле составила 5,2±0,2 lg КОЕ/мл, а при совместном влиянии сульфата железа (II) и метаболитов лактобацилл уменьшалась с 4,6±0,3 до 2,2±0,07 lg КОЕ/мл по мере возрастания концентрации пероксида водорода с 1 по 5,4 мМ. Таким образом, несмотря на низкую бактерицидность продуцируемого лактобациллами пероксида водорода, показанная нами высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов позволяет рассматривать пероксидпродуцирующие микроорганизмы как компонент системы, генерирующей высокоэффективный дезинфектант широкого спектра действия [4]. ОБСУЖДЕНИЕ Проведенные исследования позволили установить, что изучаемые биотопы, дифференцированные с использованием критериев оценки микроэкологических нарушений на 2 группы - эубиоз и дисбиоз, различаются и по наличию или отсутствию в них представителей нормофлоры, способных продуцировать про- и антиоксиданты в высоких концентрациях. Однако если для состояния эубиоза отмечен высокий уровень продукции и прооксидантов, и антиоксидантов, а их соотношение близко к единице, то для биотопов с микроэкологическими нарушениями характерно многократное преобладание уровня антиоксидантов над прооксидантами, что, по-видимому, имеет диагностическое значение в клинике. Учитывая, что пероксид водорода стимулирует выработку клетками хозяина антимикробных веществ и потенцирует их эффективность, усиливает рост и антагонистическую активность нормальной микрофлоры [1, 2], становится очевидной универсальная роль прооксидантов в гомеостазе симбиозов. Подтверждением тому служит выявленное нами существенное усиление биоцидного эффекта пероксида водорода, продуцируемого лактобациллами, ионами железа (II) - явление, которое, по-видимому, характерно и для других симбиозов, где присутствуют пероксидпродуци-рующие симбионты. С другой стороны, нами было показано, что вещества, ассоциированные с состоянием дисбиоза, угнетали продукцию пероксида водорода лактобациллами, обеспечивающими защиту биотопа [3, 13]. Это явление угнетения пероксидпродукции, по-видимому, определяет возникновение дисбиотических нарушений, однако остается открытым вопрос о первопричинах усиленного синтеза антиоксидантов симбионтами. Выявленная значительная стимуляция продукции пероксида водорода экзополисахаридами представителей нормофлоры L. plantarum и C. minutissimum служит доказательством того, что наличие про- и антиоксидантов в микробном сообществе в немалой степени определяется окружением. В целом, следует отметить, что полученные в настоящем исследовании результаты, расширяя понимание роли про- и антиоксидантов в регуляции механизмов гомеостаза симбиозов, открывают перспективы их практического использования для решения проблем антимикробной стратегии, в частности, при разработке технологий нормализации симбиотического сообщества путем искусственного изменения соотношения про- и антиоксидантов. Таким образом, следует заключить, что стабильное существование симбиотических систем может быть обеспечено за счет поддержания баланса продукции про- и антиоксидантов участниками симбиоза, а выявленные закономерности ответных реакций симбионтов на изменения баланса про- и антиоксидантов расширяют представления о механизмах формирования и причинах многообразия типов симбиозов. Вместе с тем, оценивая полученные результаты, следует отметить, что выявленная в условиях симбиотических взаимоотношений при инфекции высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов, образующихся из пероксида водорода нор-мофлоры за счет создания оптимальных условий для их генерации путем подбора соответствующих концентраций ионов железа (II) и Н2О2 [4], открывает перспективы разработки новых способов дезинфекции.

About the authors

O. V Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

A. V Sgibnev

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

S. V Cherkasov

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

References

Supplementary files