NUTRIENT MEDIUM FOR ISOLATION AND CULTIVATION OF BIFIDOBACTERIA

Abstract

Full Text

Возникновение дисбактериоза кишечника способствует развитию заболеваний желудочно-кишечного тракта и патологических процессов в других органах и системах. Одно из проявлений дисбактериоза - снижение содержания бифидобактерий в составе кишечных микробиоценозов. Естественной средой для формирования бифидофлоры млекопитающих, в том числе и человека, служит молозиво. Целью настоящего исследования явилось изучение возможности использования питательной среды, приготовленной из моло-зивного творога (отхода производства лактоглобулина) для выделения и культивирования бифидобактерий. Сконструированная нами гидролизатно-творожная питательная среда (ГТ) (Питательная среда для культивирования бифидобактерий. Патент РФ № 2080376, 1997) имела следующий состав: натрия хлорида - 5 г, глюкозы - 10 г, пептона сухого ферментативного - 5 г, L-цистина солянокислого - 0,1 г, аскорбиновой кислоты - 1 г, железа сернокислого - 0,002 г, агар-агара микробиологического - 0,75 г, гидролизата молозивного творога - 1 л. Стерильность среды обеспечивается стерилизацией в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Средой сравнения в проводимых исследованиях была среда Блаурокка, которую готовили в лабораторных условиях по ФСП 42-00110-02-72-05 «Бифидумбактерин сухой». В работе были использованы тест-штаммы микроорганизмов, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича: бифидобактерии - B. bifidum-1, B. breve ATCC 15701, B. infantis ATCC 15702, B. adolescentis ATCC 15705, B. longum ATCC 15708, а также Escherichia coli 3912/41 и Pseudomonas aeruginosa 27/09. Специфическую активность (показатели чувствительности среды, скорости роста), а также дифференцирующие свойства среды определяли в соответствии с методическими рекомендациями. Стабильность основных биологических свойств бифидобактерий (морфологические, тинкториальные свойства, способность к кислотообразованию, антагонистическую активность) определяли по методикам, изложенным в ФСП 4200110-02-72-05 «Бифидумбактерин сухой». Основу питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий составляет ферментативный гидролизат молозивного творога, приготовленный по разработанному нами способу (Способ получения гидролизата творога для приготовления питательных сред. Патент РФ № 2987881, 1997). Готовая среда представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую жидкость от светло-коричневого до коричневого цвета, рН среды 6,8±0,2. Содержание аминного азота не менее 15%. Исследовано 19 серий среды. Анализ результатов исследования специфической активности среды показал, что на среде ГТ растут все взятые в исследование тест-штаммы бифидобактерий. Уже через 24 ч их выращивания при температуре 37±1°С жизнеспособные клетки выявлялись в количестве 108-109. Максимальную концентрацию жизнеспособных бифидобактерий (109 - 1010) регистрировали через 48 ч выращивания при температуре 37±1°С. Отмечены некоторые различия в скорости роста отдельных видов бифидобактерий. Так, B. breve к 24 ч выращивания насчитывали до 1010, несколько медленнее развивались B. bifidum-1. По сравнению со средой Блаурокка, особенно в отношении штамма B. bifidum-1, максимальная концентрация жизнеспособных клеток на среде ГТ через 24 и 48 ч выращивания была выше в 100 и 10 раз, соответственно. При выращивании в пробирках на среде ГТ все тест-штаммы образовывали колонии в виде «комет», «зерен», «тяжей». При интенсивном росте и росте во флаконах образовывали рыхлую массу, оставляя прозрачным верхний слой (зона аэробиоза). Морфологически выросшие на среде ГТ культуры тест-штаммов бифидобактерий представляли слегка изогнутые грамполо-жительные палочки средних размеров с характерной морфологией: один из концов палочек утолщен или чаще раздвоен, в мазке они располагаются в виде буквы V или скоплений, напоминающих китайские иероглифы. Выращенные на среде ГТ бифидобактерии имели типичную биохимическую активность. Для изучения возможности использования среды ГТ для выявления бифидобактерий в составе микробиоценоза толстой кишки людей были проведены посевы материала от людей с дисбактериозом кишечника параллельно на две среды: Блаурокка и ГТ из разведений фекалий 10 ,10-7, 10-8,10-9. Наличие роста учитывали через 24 и 48 ч выращивания посевов при температуре 37±1°С. В результате было установлено, что на среде ГТ бифидобактерии выявляются чаще, в большем количестве и в более высоких разведениях, чем на среде Блаурокка, что позволяет говорить о высокой чувствительности среды ГТ. Для определения пригодности питательных сред для культивирования бифидобактерий были получены 5 экспери-метальных серий бифидумбактерина из штамма B. bifidum-1, выращенного на среде ГТ. Культивирование B. bifidum-1 проводили в соответствии с регламентом производства «Бифидумбактерин сухой». Качество сухого экспериментального би-фидумбактерина проверяли в соответствии с требованиями ФСП 42-00110-02-72-05 «Бифидумбактерин сухой». Готовый лиофильно высушенный препарат, полученный путем культивирования B. bifidum-1 на среде ГТ, имел вид кристаллической или слегка пористой массы белого или слегка бежевого цвета с легкой мраморностью. Он легко растворялся в течение 1 - 2 мин при добавлении 0,9 мл раствора натрия хлорида (1 мл на 1 дозу), имел остаточную влажность не более 3,5%, не содержал посторонних микроорганизмов, был безвреден для белых мышей. Специфическая активность экспериментальных серий бифидумбактерина составляла 7±1х109 живых клеток в 1 дозе препарата, активность кислотообразования превышала 90°Т. Изучение антагонистической активности по отношению к некоторым патогенным (возбудители дизентерии Флекснера и Зонне) и условно патогенным микроорганизмам (кишечная палочка, протей, золотистый стафилококк) обнаруживало зоны подавления роста тестштаммов, превышающие 10 мм. Сухой бифидумбактерин, приготовленный на среде ГТ, сохранял специфическую активность в течение года, что полностью соответствовало требованиям ФСП 42-0011002-72-05 «Бифидумбактерин сухой». Таким образом, проведенные испытания среды ГТ позволяют считать, что данная среда обладает высокой специфической активностью, обеспечивает рост и развитие различных тест-штаммов бифидобактерий. По чувствительности и скорости роста бифидобактерий среда ГТ несколько превосходит применяемую в практическом здравоохранении питательную среду Блаурокка лабораторного изготовления и может быть использована как для выделения бифидобактерий при диагностике дисбактериоза кишечника, так и для культивирования бактериальной массы бифидобактерий при их производстве. Преимуществом данной среды перед другими средами, используемыми для выделения бифидобактерий, является то, что она готовится из естественного материала, не имеющего пищевой ценности (отходов производства), содержащих природные бифидостимулирующие субстанции (молозивные белки, олигосахариды, лактаминовые кислоты, ацетилглю-козамин). Использование отходов производства лактоглобулина создает предпосылки для получения среды с более низкой стоимостью по сравнению с другими коммерческими средами.