DEVELOPMENT OF VACCINE PREPARATION FOR UROGENITAL CHLAMYDIOSIS PROPHYLAXIS

Full Text

Заболеваемость ИППП в настоящее время в России остается на высоком уровне, подтверждением чему служат свыше 700 тысяч больных, зарегистрированных в 2004 . Ежегодно в мире регистрируют около 92 млн новых случаев хламидийной инфекции [1, 2]. Не менее 5 - 10% молодых сексуально активных людей поражены хламидийной инфекцией. Вследствие малочисленности симптомов и несвоевременности выявления заболевание нередко приобретает хроническое течение. Проявляющаяся патология распространяется от генитальных и абдоминальных поражений до конъюнктивитов, пневмоний и артритов. К тому же, хламидийная инфекция связана с повышенным риском приобретения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [32]. Кроме того, предполагается, что инфекция, вызванная C. trachomatis, может способствовать возникновению рака шейки матки [37]. Первичный хламидиоз достаточно эффективно лечится антибиотиками, однако при продолжительном течении инфекции и развитии патологических поражений в верхних отделах урогенитального тракта антибиотикотерапия не приводит к элиминации инфекции. Серьезной проблемой, осложняющей контроль за заболеванием, является высокий процент бессимптомного течения инфекции. У женщин бессимптомное течение урогенитального хламидиоза составляет 70 - 90%, а у мужчин - 30 - 50%. Именно поэтому большинство случаев остается не диагностированным, а пациенты без клинических признаков инфекции и не проходящие лечение являются основным источником распространения инфекции [5]. Одним из современных подходов к контролю за заболеванием может служить внедрение национальных систем скрининга, которые, однако, являются достаточно дорогостоящими. Вакцинация должна быть более экономически выгодной, позволяющей эффективно контролировать распространение урогенитального хламидиоза [34]. Несмотря на актуальность создания вакцины в настоящее время все еще не существует профилактического препарата, разрешенного к применению. Очевидно, что эффективная вакцина должна вызывать иммунный ответ такой же, как и естественная инфекция. При этом препарат не должен индуцировать острое воспаление, часто сопровождающее инфекционный процесс, и не должен запускать иммунопатологические реакции у вакцинированных субъектов в случае встречи с инфекцией. Исследования в области разработки вакцины против урогенитального хламидиоза осложняют несколько факторов. Во-первых, еще идентифицированы не все протективные антигены C. trachomatis. Во-вторых, дискуссионным остается вопрос, каков должен быть способ иммунизации. На экспериментальных животных была показана эффективность как местной, так и системной вакцинации, однако пока еще нет данных, полученных на людях. В-третьих, еще не известно, какие адъюванты могут быть использованы для урогенитальной вакцинации. Очевидно, что естественная инфекция позволяет, до некоторой степени, защитить от повторной инфекции, что в большей степени показано для лабораторных животных, однако у людей формирующаяся защита менее эффективна, особенно при реинфекции другими сероварами [23]. Инфекция урогенитального тракта индуцирует целый комплекс иммунных реакций, включающих как врожденный, так и приобретенный иммунный ответ. Клетки врожденного иммунного ответа распознают и ограничивают распространение инфекции, а также влияют на исход инфекции через модуляцию активности системы приобретенного иммунитета. Протективный иммунный ответ против C. trachomatis обеспечивается, в первую очередь, Th1 CD4+ Т-клетками и INF-y, а также предполагает участие антител и CD8+ Т-клеток [11]. Однако иммунный ответ на инфекцию достаточно сложен и те компоненты, которые обеспечивают протективный иммунитет, могут вызывать также иммунопатологию. Изучение иммунного ответа при урогенитальной хламидийной инфекции направлено во многом на разработку эффективных вакцин [10, 25, 36]. B исследованиях на животных было показано, что в защите от хламидийной инфекции и реинфекции одинаково важную роль играют как специфический CD4+ Т-клеточный ответ, продуцирующий IFN-y [21, 35], так и гуморальный иммунный ответ, при этом, по-видимому, роль CD8+ Т-клеток менее важна [26]. Иммуноэпидемиологические исследования на больных указывают на аналогичные механизмы формирования про-тективного иммунитета, однако они в меньшей степени изучены [6]. Данные, полученные как на людях, так и на животных, указывают на то, что введение живых или убитых хламидий вызывает различный иммунный ответ у хозяина. Например, после выздоровления от инфекции у больных обычно формируется видоспецифический, но кратковременный иммунный ответ, защищающий от реинфекции. Однако у пациентов, иммунизированных целыми инактивированными хламидиями, защита практически не развивается, но при этом последующая инфекция может вызывать симптомы обострения заболевания [17]. Аналогично у мышей, инфицированных Chlamydia muridarum, развивается эффективный протективный иммунный ответ [40], при этом иммунизация убитыми хламидиями или хлами-дийным основным белком наружной мембраны, МОМР (Major Outer Membrane Protein) дает либо слабую защиту, либо совсем не защищает от инфекции [38]. Более того, в определенных условиях живая хламидия может серьезно нарушать иммунное распознавание инфицированных клеток или подавлять антиген-презентирующие клетки (APC - Antigen Presenting Cells) вследствие инактивации главного комплекса гистосовместимости как I (MHC I), так и II классов (MHC II), тем самым, способствуя развитию персистентной инфекции [48, 49]. Эти данные указывают на то, что иммунизация убитыми хламидиями или отдельными их антигенами вызывает существенно отличный от инфекционного процесса иммунный ответ. Актуальными задачами при конструировании и разработке противохлами-дийных вакцин является выявление механизмов защитного иммунитета, выбор эффективных антигенов возбудителя, способных вызвать протективный иммунный ответ, а также создание эффективных систем доставки для повышения эффективности иммунного ответа против выбранных целевых антигенов. Обязательным требованием для перспективной вакцины является индукция TM-иммунного ответа, который контролирует хла-мидийную инфекцию. Что касается выбора протективных антигенов, то использование целых хламидийных клеток представляется бесперспективным из-за возможности индукции иммунопатологических реакций. Кроме того, прогресс в области молекулярной иммунологии и биотехнологии за последние два десятилетия привел к постепенному переходу от классических вакцин, состоящих из живых или инактивированных патогенов, к пептидным или субъединичным вакцинам. Таким образом, разработка вакцины на основе хламидийных протективных антигенов является главным направлением в конструировании противохламидий-ной вакцины [13]. Ранние исследования, проводимые с 1950 по 1960 гг., по созданию вакцин для животных и человека были сосредоточены на использовании живых или инактивированных целых бактерий. Эти вакцины оказались весьма эффективными в борьбе с инфекциями сельскохозяйственных животных. В настоящее время в ветеринарии успешно используются высокоэффективные живые аттенуированные (на основе химически индуцированных термочувствительных мутантных штаммов) и инактивированные вакцины на основе целой бактерии против OEA (Ovine enzootic abortion - энзоотический аборт овец), а также инактивированные вакцины против хламидиоза у кошек. Вакцины ограничивают распространение инфекции и снижают её контагиозность [8]. На людях вакцины на основе живых бактерий были испытаны для профилактики трахомы. При этом наблюдался протективный эффект, который, однако, был непродолжительным, а при повторном инфицировании болезнь у вакцинированных пациентов протекала с осложнениями, приводя к развитию хронической формы заболевания. После этих исследований отказались от использования целых бактериальных клеток для разработки человеческих противохлами-дийных вакцин. Однако как только будут разработаны стабильные генетические системы для трансформации хламидий, станет возможным создавать живые аттенуированные вакцины, которые не будут вызывать иммунопатологические нарушения [23]. В начале 90-х годов XX века основные усилия были направлены на создание субъединичных вакцин, которые должны быть безопасными и экономически более выгодными при сравнении с вакцинами на основе очищенных белков клеточной стенки хламидий. На сегодняшний день наиболее часто используемыми протективными антигенами для разработки эффективной про-тивохламидийной вакцины являются хламидийные белки наружной мембраны, среди которых высокоиммуногенный основной белок наружной мембраны - MOMP. MOMP был главной антигенной мишенью для разработки вакцин в течение последних 20 лет. Он имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа. МОМР найден во всех изученных хламидиях, содержит родо-, видо-, типо- и се-роварспецифические антигенные детерминанты. Функционально МОМР обеспечивает ригидность клеточной стенки через дисульфидные связи с белками наружной мембраны. К тому же, МОМР является как порином, так и адгезином. МОМР выполняет электростатическую роль в адгезии и содержит трипсин-чувствительные антигенные эпитопы. Свойства МОМР как порина состоят в формировании больших пор, позволяющих диффундировать таким промежуточным продуктам метаболизма, как аминокислоты и энергетически богатые нуклеотиды [16, 41]. Хламидийный основной белок наружной мембраны в большом количестве экспрессируется на бактериальной поверхности и считается наиболее перспективным протективным антигеном. Антитела против МОМР нейтрализуют инфекционную способность элементарных телец (ЭТ) in vivo. На его основе были разработаны и изучены различные вакцинные препараты. Рекомбинантный MOMP, синтетические пептиды в составе MOMP, ДНК-вакцины, кодирующие MOMP, и пассивная передача MOMP-специфических моноклональных антител были изучены в отношении их протек-тивных свойств. Было показано, что наилучший протективный ответ у животных развивался при использовании рекомбинантного белка, имеющего нативную конформационную структуру [18]. В целом, было установлено, что использование белка МОМР в качестве единственного протективного антигена в вакцинных препаратах не позволяет разработать эффективную вакцину, поэтому наиболее перспективным в настоящее время является разработка поливалентных субъединичных вакцин на основе комбинации двух и более белков C. trachomatis [13]. Кроме MOMP, одним из основных кандидатов для конструирования вакцин является белок наружной мембраны, OmcB или Omp2 с молекулярной массой около 60 кДа, который также считается высокоиммуногенным белком. Ген, кодирующий этот белок C. trachomatis, оmp2 состоит из 1641 пар нуклеотидных оснований, которые кодируют 547 аминокислот. Данный белок не только вызывает выраженный гуморальный ответ, но и играет важную роль в патогенезе, поскольку рассматривается как один из основных адгезинов на начальном этапе взаимодействия патогена с эукариотической клеткой. Установлено, что рецепторами для OmcB являются глюкозамино-гликаны, преимущественно гепаран-сульфат, молекулы которого связаны с некоторыми протеинами клеточной поверхности [14, 15, 24]. Было показано, что белок OmcB в сочетании с другими белками хламидий вызывает протективный ответ. Так, например, в исследованиях Eko F.O. et al. [13] была разработана субъединичная вакцина, где в качестве системы доставки использовали «пустую» клеточную оболочку холерного вибриона - Vibrio cholerae «ghost» (rVCG). Были созданы две вакцинные конструкции: субъединичная, несущая один единственный рекомбинантный белок MOMP, и мультисубъединичная, в состав которой входили наружные мембранные белки MOMP и OmcB на основе векторной системы rVCG. Авторы сравнивали клеточный и гуморальный иммунный ответ, а также способность обеих вакцин индуцировать протективный иммунный ответ против урогенитальной хламидийной инфекции у мышей. Результаты показали, что мультисубъединичная конструкция вызывала лучший специфический Th1 иммунный ответ и более выраженный уровень про-тективного иммунитета, чем при использовании субъединичной, несущей только один хламидийный белок. Эти результаты позволят в дальнейшем начать клинические исследования этой вакцины на людях. Будущие исследования будут сосредоточены на выборе дополнительных хламидийных белков, которые могут ко-экспрессироваться в rVCG, так как это средство доставки обладает показателями высокой емкости и может обеспечить экспрессию нескольких целевых белков. Другими перспективными целевыми генами C. trachomatis, изучаемыми в качестве их иммуногенных и протективных свойств, являются структурные белки клеточной стенки хламидий и белки, се-кретируемые с помощью системы секреции III типа (CCYr) и встраиваемые в мембрану хламидийной фагосомы. Среди первой группы наиболее иммуногенными являются полиморфные белки наружной мембраны, POMPs (Polymorphic Membrane Proteins) или Pmps. Полногеномный сиквенс C. trachomatis позволил выявить 9 генов, кодирующих семейство белков. POMPs, некоторые из которых являются поверхностно экспонированными, имеют много общего с аутотранспортерами V-типа и могут действовать как цитолизин [39, 43, 45]. Они играют важную роль в ускользании от иммунологического надзора в результате реализации механизмов антигенной изменчивости, включая рекомбинацию и дифференциальную изменчивость. Этот факт говорит о том, что полиморфные мембранные белки являются потенциальными кандидатами для разработки вакцины. Среди белков ССТТ наиболее изучены в отношении их протективных свойств эффекторный белок TARP и белки семейства Inc. К ранним секретируемым факторам ССТТ относится эффекторный белок TARP (Translocated Actin Recruiting Protein - CT456) с молекулярной массой 103 kDa. Основной функцией белка является индукция агрегации актина в местах прикрепления ЭТ к мембране эукариотической клетки и обеспечении условий для интернализации патогена [7, 21]. TARP был идентифицирован как новый высокоиммуногенный антиген при исследовании сывороток крови людей, переболевших хламидийной инфекцией. Иммуногенность TARP была подтверждена на животных моделях. Мышей ин-травагинально заражали возбудителем мышиной урогенитальной инфекции C. muridarum, при этом наблюдали развитие TARP-специфического гуморального и клеточного иммунного ответа. Более того, иммунизация мышей TARP вызывала Th1-преобладающий иммунный ответ, что значительно снижало распространение инфекции в нижних отделах генитального тракта и способствовало ослаблению патологических воспалительных реакций в тканях маточных труб [46]. На внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий ведущую роль играют секретируемые факторы ССТТ, относящиеся к семейству белков Inc (Inclusion Membrane Proteins) - поверхностным белкам, локализующимся на мембране хламидийных включений. Это достаточно большой класс белков, гены которых активируются на ранней (IncB-G) и средней (ЫсА) стадиях внутриклеточного цикла. Транслокация их в мембрану включения обеспечивает взаимодействие хламидий с сигнальными путями хозяйской клетки [12]. Различные иммуногенные свойства Inc и их участие, в частноcти, в патологическом течении заболевания могут быть связаны с нативной конформацией белков in vivo и их внутриклеточной локализацией. Более того, новые данные о трехмерной структуре белков IncB и IncC дают возможность разобраться в расположении эпитопов, необходимых для образования антител против этих белков внутри инфицированной клетки хозяина. Антитела к поверхностным элементам C. trachomatis, как стало известно, резко повышают опсонизацию дендритных клеток и развитие сильного Th1-иммунного ответа. В результате проведенных исследований были сделаны выводы, что белки IncB и IncC способны генерировать гуморальный и клеточный опосредованный иммунный ответ у инфицированных хламидийной инфекцией женщин с нарушенной фертильностью и без нарушений [19]. Белок CPAF (Chlamydial Protease/ Proteasome-like Activity Factor, CT858) - протеаза/фактор с протеасомо-подобной активностью широко используется как целевой ген при создании вакцинных препаратов. Он является основным белковым фактором хламидий, секреция которого происходит без участия ССТТ. Данный белок обладает широким спектром активности, в том числе, направленной на подавление иммунного ответа путем протеолитической деградации эукариотических транскрипционных факторов RFX5, являясь активатором промоторов генов MHC I класса и гена Р2-микроглобулина и USF-1 [47]. Интраназальная иммунизация с использованием рекомбинантного CPAF (rCPAF), а также интерлейкина-12 (IL-12) в качестве адъюванта была использована для оценки протективного иммунитета против генитальной инфекции, вызванной C. muridarum на модели лабораторных животных. Иммунизация rCPAF+IL-12 индуцировала выраженную продукцию интерферона гамма (IFN-y) и минимальную продукцию IL-4 сплено-цитами в условиях in vitro. Уровень общих иммуноглобулинов и иммуноглобулинов класса G2a к белку rCPAF в сыворотке крови, а также IgG2a и IgA в бронхоальвеолярном лаваже и вагинальном отделяемом у животных были значительно выше после вакцинации rCPAF+IL-12 по сравнению с иммунизацией только рекомбинантным белком. У мышей, вакцинированных rCPAF+ IL-12, было показано значительное снижение накопления возбудителя в генитальном тракте и более быстрая элиминация C. trachomatis по сравнению с контрольной группой животных. Более того, у животных, иммунизированных rCPAF+IL-12, наблюдали защиту от осложнений хламидийной инфекции, включающих развитие гидросальпинкса и расширение маточных труб. Эта схема вакцинации также снижала риск развития фиброзных образований и приток нейтрофилов в верхние половые пути у животных по сравнению с контрольной группой животных. Авторы предполагают, что протективный эффект созданного вакцинного препарата, способствующий быстрой элиминации патогена и защите от воспалительных заболеваний, в значительной степени зависит от индукции эндогенного IFN-y [29, 30]. В совокупности эти результаты показывают, что секретируемые хламидий-ные белки могут быть перспективными вакцинными кандидатами, способными индуцировать протективный иммунитет [23]. Помимо идентификации основных хламидийных целевых белков для конструирования противохламидийной вакцины, одной из важнейших задач является поиск эффективных систем доставки. Вакцинные системы доставки представляют собой такие системы, как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs - Immuno-Stimulating Complex), виросомы и лизосомы. Использование микробных систем доставки, таких как аттенуированная Salmonella typhimurium [20], гибридные полиовирусы (вирус полиомиелита) [28], новый картофельный вирус X растительной системы экспрессии, показали многообещающие результаты в разработке вакцин против хламидийной инфекции. Другие системы доставки, такие как неинфекционные аденовирусы и вирус коровьей оспы, также используют в исследованиях. Одним из наиболее современных и перспективных направлений в создании вакцин является генетическая иммунизация с использованием ДНК вакцин и рекомбинантных аденовирусных векторов. Первые попытки использования аденовирусных векторов для иммунизации лабораторных животных против хламидиоза были предприняты группой исследователей из Китая под руководством доктора Zhou J. et al. в 2006 г. На лабораторной модели заражения цыплят хламидиями ими было показано, что рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий MOMP-антиген C. psittaci, способен вызывать индукцию специфического гуморального иммунного ответа. Эти первые данные демонстрируют, что аденовирусные векторы, несущие гены основных протективных антигенов, имеют хорошие перспективы использования для генетической иммунизации против хламидиоза [50]. Эффективной на данный момент системой доставки вакцин является также VCG. Эта система доставки нетоксична, обладает свойствами эффективного адъюванта, способствует индукции как T-клеточного, так и гуморального ответа в мукозных тканях. VCG может служить эффективным средством доставки для одной или нескольких субъединичных вакцин, вызывая высокий уровень защиты против инфекции, вызванной C. trachomatis [13]. При использовании рекомбинантного полиовируса, экспрессирующего гибриды белка MOMP C. trachomatis, в качестве модели для разработки живых аттенуированных векторных хламидий-ных вакцин теоретически возможно индуцирование гуморального иммунного ответа на мукозных поверхностях. Полученная иммунная сыворотка при взаимодействии с гибридами способна нейтрализовать 8 - 12 сероваров C. trachomatis, чаще всего связанных с глазными и урогенитальными инфекциями [28]. Таким образом, дальнейшей разработке и поиску новых эффективных систем доставки способствует развитие таких фундаментальных наук, как молекулярная биология и генетика. Для формирования наилучшего защитного противохламидийного иммунитета необходим целый ряд вакцин-кан-дидатов с подходящими для них адъювантами. Адъюванты добавляются ко многим вакцинам для повышения их иммуноген-ности и эффективности. В последнее время адъюванты стали играть важную роль в разработке вакцинных препаратов, а также в индукции иммунного ответа. Разнообразные адъюванты стимулируют различные типы иммунного ответа, поэтому конструирование вакцин путем правильной комбинации адъюванта со специфическими антигенами имеет огромное значение для достижения желаемого эффекта. Существует два типа адъювантов: те, которые непосредственно стимулируют врожденную (естественную) иммунную систему, и те, что действуют на антигенпрезентирующие клетки с использованием вакцинной системы доставки [31, 33]. Для большинства вакцин используют следующие виды адъювантов: 1 группа адъювантов, которые наиболее часто используются - это соли алюминия (гидроксид алюминия, фосфат алюминия). Однако механизм, посредством которого алюминиевые соли усиливают иммунную систему, остается неясным. Было показано, что эти адъюванты могут усиливать гуморальный специфичежий иммунный ответ против антигена [3]; 2 группа адъювантов включает QS21 (очищенная нетоксичная фракция сапонина), полифосфазен, DC-Chol (холестерил-3(бета^-диметил аминоэтил) [9, 42]; 3 группа включает адъюванты, полученные из различных токсинов (Cholera toxin - холерный токсин; LT - термолабильный токсин E. coli [33, 44]; Иммуностимуляторы (адъюванты) включают в себя субстанции, такие как CpG-мотивы, цитокины и липополисахаридные дериваты. Синтетические олигодиоксинуклео-тиды, которые содержат CpG-мотивы, являются потенциальными стимуляторами врожденной иммунной системы. Они выступают в качестве иммунных адъювантов, ускоряющих и повышающих антиген-специфические антительные ответы в 500 раз. Взаимодействие CpG-ДНК с различными вакцинами улучшает протективный иммунитет у моделей зараженных животных. Текущие клинические исследования показывают, что CpG олигодиоксинуклеотиды (CpG-ODN) являются безопасными и хорошо переносимыми при приеме внутрь в качестве адъювантов для людей, а в некоторых случаях повышают поствакцинальные иммунные ответы [22]. CpG-ODN активно используют как адъюванты для разработки вакцин против хламидийной инфекции. CpG-ODN использовали в комбинации с холерным токсином. CpG является мощным адъювантом, а при введении его парентеральным, оральным или интраназальным путем он вызывает преимущественно Th1 иммунные ответы [4]. Исследования, проведенные до настоящего времени, показывают, что наиболее эффективным подходом является использование многокомпонентных субъединичных вакцин, позволяющих достигать формирования длительного протективного иммунного ответа. Работа продолжается в направлении идентификации новых значимых целевых антигенов и выявления тех компонентов, которые ответственны за иммунопатологию. Не менее важным в этих исследованиях является необходимость разработки безопасных систем доставки и адъювантов для оптимальной презентации антигена [27]. Для изучения воздействия вакцинации на распространение инфекции, вызванной C. trachomatis, была разработана математическая модель. На этой модели на основе эпидемиологических данных учитывались два параметра, скорость распространения и эффективность лечения, для того, чтобы вычислить процент инфицированных лиц среди населения. Было определено влияние вакцин с эффективностью от 50 до 100% и была проанализирована эффективность воздействия вакцины на население на срок 10, 20 и 40 лет. Результаты компьютерного моделирования показали, что даже не очень эффективные программы вакцинации быстро уменьшали распространенность хламидийной инфекции в популяции. С другой стороны, вакцина, которая была эффективна только в течение 1 года, имела минимальное воздействие на распространенность заболевания [11]. Наиболее перспективными на данный момент являются исследования компании Antex Biologics, разрабатывающей вакцину TRACVAX, которая уже успешно прошла испытания на животных. TRACVAX представляет собой субъединичную вакцину на основе эпитопов основного наружного белка, которые высоко консервативны среди различных хламидийных сероваров и/или штаммов. Применение такой вакцины показало защиту от хламидийной инфекции полового тракта и значительную защиту против восходящей инфекции, приводящей к заболеваниям верхних отделов репродуктивного тракта. Тем самым, с помощью вакцины TRACVAX была получена эффективная защита от различных форм проявления хламидийной инфекции. Кроме этого, было показано, что эта вакцина индуцировала протективный ответ против наиболее распространенных урогенитальных штаммов C. trachomatis. С 2003 г. начали проводиться клинические испытания вакцины TRACVAX на людях для оценки общей безопасности и иммуногенности вакцины, наряду с определением эффективных схем вакцинации [23].

About the authors

E. A Koroleva

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

N. A Zigangirova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files