PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN A AND NEW APPROACHES FOR PNEUMOCOCCAL VACCINE DEVELOPMENT

Full Text

Пневмококковые инфекции, представляя серьезную медико-социальную проблему для многих стран мира, остаются актуальными и для Российской Федерации. Частота пневмококковых пневмоний в РФ составляет более 1000 случаев на 100 000 детей в возрасте от 0 до 5 лет, пневмококковых менингитов - 8 случаев на 100 000 детей, а пневмококковых бактериемий - 137 случаев на 100 000 детей [1, 5]. В развитых странах пневмококк является причиной более 50 случаев инвазивных пневмококковых заболеваний (пневмония, бактериемия, менингит) на 100 000 взрослого населения, а у детей первых 2 лет жизни - более 150 случаев на 100 000 [30]. В развивающихся странах от заболеваний, вызванных пневмококком, ежегодно погибают более 1 млн детей в возрасте младше 5 лет [11, 29, 30, 40]. Успешное применение национальных программ вакцинации против пневмококковых инфекций привело к тому, что в США, Канаде, ряде европейских стран отмечено значительное снижение числа инвазивных форм пневмококковой инфекции, в том числе пневмококкового бактериального менингита [8, 13, 16]. В РФ иммунизация против пневмококковой инфекции как детей, так и взрослых не внесена ни в Национальный календарь прививок, ни в Календарь прививок по эпидпоказаниям [3]. В настоящее время для профилактики пневмококковой инфекции у взрослых применяют 23-валентную полисахаридную вакцину (Pneumo-23; Sano-fi-Pasteur, Франция), обеспечивающую эффективную защиту более 60% вакцинированных людей [4, 37]. Однако у детей первых 2 лет жизни и пожилых людей такая вакцина неэффективна [30, 37, 39]. Это связано, прежде всего, с недостаточным формированием (у лиц старше 65 лет) или отсутствием (у детей от 0 до 24 месяцев жизни) иммунного ответа на полисахариды, поскольку последние являются В-клеточными антигенами, а в указанных возрастных группах для формирования иммунного ответа необходимо участие Т-клеточного звена иммунитета [35]. На сегодняшний день известно более 90 серотипов пневмококка [10, 30, 35, 39]. В результате такого многообразия К-ти-пов пневмококка создать защиту ко всем серотипам практически невозможно. Это объясняется тем, что для разных регионов эпидемически актуальными являются различные серотипы пневмококка и в течение времени происходит смена актуальных серотипов [32]. В 2000 г. в США была разработана 7-валентная конъюгированная вакцина (Prevnar; Wyeth, США), включающая полисахариды 7 наиболее актуальных штаммов пневмококка для территории США и дифтерийный анатоксин [4, 39]. Накопленный опыт позволяет заключить, что иммунизация 7-валентной вакциной приводит к формированию Т-клеточного ответа, обеспечивающего защиту детей от пневмококковой инфекции [12, 20, 28, 30, 35, 39]. Однако, несмотря на свою эффективность, данная вакцина имеет ряд недостатков [2, 32], поэтому продолжаются поиски, направленные на улучшение настоящей вакцины с помощью включения в неё вместо дифтерийного анатоксина различных белков пневмококка. Одним из таких кандидатных белков является поверхностный пневмококковый белок А (ППБА) [10, 17, 37]. Поверхностный пневмококковый белок А - это белок с вариабельной молекулярной массой 67 - 99 кДа, основная функция которого заключается в ограничении действия системы комплемента хозяина посредством уменьшения ком-племент-опосредованного клиренса и фагоцитоза S. pneumoniae [15, 17, 41]. При выращивании пневмококка поверхностный пневмококковый белок А не обнаруживается в среде до тех пор, пока рост культуры не достигает стационарной фазы. Нативный поверхностный пневмококковый белок А выделяют с поверхности пневмококков посредством элюции в 2% растворе хлорида холина, или посредством выращивания в химической среде, содержащей 1,2% хлорида холина, или же выращивают в среде, в которой холин замещен этаноламином [6]. Однако в настоящее время исследователи, как правило, изучают свойства рекомбинантного ППБА. В первую очередь, это связано с развитием генноинженерных технологий, а также с трудоемкостью процесса выделения нативного белка А [6, 18, 27, 33]. Структурный анализ ППБА выявил в его составе 5 доменов: 1) сигнальный пептид; 2) N-терминальный домен; 3) регион, обогащенный пролином, связывающий N- и С-концы белка А; 4) холин-связывающий домен и 5) короткий гидрофобный фрагмент на С-конце молекулы белка А [9]. N-терминальная часть ППБА состоит из a-цепи и 7-валентного мотива и формирует двойную спираль [17]. Установлено, что протективные эпитопы ППБА локализуются в a-цепи и представляют аминокислотную последовательность со 192 по 260 аминокислотный остаток [21]. Центральная часть ППБА обогащена остатками пролина, которые предположительно могут находиться внутри клеточной стенки пневмококков [37, 41]. Пневмококковый поверхностный белок А не содержит LPXTGX сайт, участвующий в прикреплении большинства поверхностных белков грамположительных бактерий к клеткам-мишеням [15]. Несмотря на это, ППБА специфически связывается с остатками холина пневмококкового F-антигена или липотейхое-вой кислоты [42]. Связывающий сайт для остатков холина формируется при помощи 10 аминокислотных повторов, состоящих из 20 аминокислот [9, 17]. С-терминальная часть ППБА высококонсервативна и состоит из 17 аминокислотных остатков, не участвующих в поверхностном прикреплении пневмококка [6, 17]. В результате проведенного анализа аминокислотной последовательности гена ППБА, отвечающего за синтез a-цепи молекулы белка А, было выявлено несколько семейств ППБА: ППБА 1 семейство, ППБА 2 семейство, ППБА 3 семейство [14]. Семейство 1 ППБА включает clades 1 и 2; семейство 2 ППБА - clades 3, 4 и 5; семейство 3 ППБА - clade 6. ППБА семейство 1 (clade 2) и ППБА семейство 2 (clades 3 и 4) индуцируют защиту против основных широко распространенных штаммов пневмококка [9, 24, 26, 34]. Исследование свойств моноклональных антител, полученных к отдельным фрагментам рекомбинантного ППБА (штамм Rх1, clade 2), выявило их способность перекрестно реагировать с другими «гетерологичными» пневмококковыми поверхностными белками А S. pneumoniae [27]. В проведенных многоцентровых исследованиях (Австралия, Канада, Франция, Испания, Швеция, Великобритания, США) изучение сывороток больных с воспалительными заболеваниями легких выявило наличие IgG к ППБА семейств 1 и 2 у 2000 человек [14]. В натоящее время показано, что: 1) подкожная иммунизация N-терминальными фрагментами a-цепи рекомбинантного ППБА и непосредственно самим белком А увеличивает время выживаемости мышей до 21 сут при внутривенном заражении пневмококком [6]. Введение различных рекомбинантных фрагментов ППБА как с адъювантом, так и без адъюванта защищает 50% животных от последующего заражения пневмококком [9, 34]; 2) иммунизация мышей одним рекомбинантным ППБА вызывает перекрестную защиту от 3, 4, 5 и 6А капсульных штаммов пневмококка, для которых характерны отличные по структурным свойствам пневмококковые поверхностные белки А [22]; 3) рекомбинантный ППБА (полученный из 19F серотипа пневмококка) включен в состав экспериментальной 5-валентной конъюгированной вакцины (полисахариды 1,5, 6В, 19F и 23F серотипов пневмококка) [25]. По сравнению с дифтерийным анатоксином он играет важную роль не только как белковый носитель (переключение иммунного ответа с В-клеточного на Т-клеточный), но и как протективный антиген [23]; 4) иммунизация рекомбинантным ППБА (семейство 2, clade 5) защищает 60% животных от заражения пневмококком 3 серотипа при интраназальном введении, активируя Т-клеточный иммунный ответ через выработку IL-17 и IFN-y и гуморальный иммунный ответ через продукцию IgG2 [11, 43]; 5) рекомбинантный ППБА обладает высокой иммуногенностью, поскольку иммунизация здоровых взрослых людей этим белком повышает титр специфических антител к пневмококку. Сыворотка, полученная от иммунизированных людей, способна пассивно защищать мышей от последующего заражения пневмококком [26]. В настоящее время накапливаются данные, согласно которым иммунизация отдельными фрагментами рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка А индуцирует у мышей защиту от последующего их заражения пневмококком [9, 26]. В частности, иммунизация мышей очищенным фрагментом a-цепи рекомбинантного ППБА в дозе 5 мкг/ мышь вместе с адъювантом Фрейнда защищала животных от летального пневмококкового сепсиса, вызванного 3 капсульным серотипом пневмококка (штамм WU2) [38]. M. Jedrzejas полагает, что ППБА может индуцировать формирование межвидовой защиты, поскольку имеет гомологию с поверхностными белками других видов микроорганизмов [17]. Правда, последний факт нуждается в практической проверке. Таким образом, большинством авторов получены положительные данные о протективной активности ППБА. По данным D.E. Briles et al. и A. Ortqvist рекомбинантный ППБА как таковой способен защищать мышей не только от локальной пневмококковой инфекции (пневмония, острый отит), но и от сепсиса [6, 30]. Это свидетельствует о важной самостоятельной роли ППБА в формировании защиты от различных заболеваний, вызванных S. pneumoniae. Установлено, что ППБА входит в состав всех известных серотипов S. pneumoniae и, следовательно, может вызывать перекрестный иммунный ответ ко всем серотипам пневмококка [17, 41]. Однако на сегодняшний день нет зарегистрированных вакцин, разработанных на основе белков пневмококка, поэтому исследователи ищут новые способы повышения эффективности вакцинации. Существует несколько путей достижения этого результата: - смешивание или конъюгация рекомбинантного ППБА с другими белками пневмококка [28]; - конъюгация рекомбинантного ППБА с полисахаридами пневмококка [25]; - использование адъювантов, в том числе цитокинов [7, 18, 30]; - конъюгация рекомбинантного ППБА со столбнячным анатоксином [19]; - смешивание рекомбинантного ППБА с убитыми клетками Bordetella pertussis [29]. Последний подход имеет значение в плане создания комбинированного препарата против пневмококка и коклюша, что актуально для плановых прививок детей. Следует отметить, что ни один из описанных экспериментальных приемов не послужил основой для создания пневмококковой вакцины, отвечающей всем предъявляемым требованиям. В работе C. Meng et al. было выявлено, что экспериментальная вакцина, основанная на конъюгации капсульных полисахаридов S. pneumoniae (серотипы 1, 5, 6В, 19F, 23F) и рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка А (получен из 19F серотипа пневмококка) защищала мышей против заражения вышеперечисленными серотипами S. pneumoniae. Анализ зрелых поликлональных антител показал, что такая конъюгированная вакцина вызывает не только Т-независимый ответ к полисахаридам, но и Т-зависимый ответ к рекомбинантному белку А [25]. Перспективна, по-видимому, разработка конъюгированной вакцины на основе актуальных капсульных полисахаридов S. pneumoniae, пневмококкового поверхностного белка А и интерлейкина-12, поскольку последний способен эффективно индуцировать иммунный ответ через активацию Т-клеток и натуральных киллеров [30]. Не менее интересным представляется направление по комбинации рекомбинантного ППБА с цельноклеточной дифтерийной вакциной. По крайней мере, экспериментальные данные свидетельствуют, что такая комбинация защищает животных от последующего заражения пневмококком в отличие от одного рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка А [29]. Учитывая насыщенный календарь прививок у детей необходимо заметить, что разработка поликомпонентных вакцин является весьма актуальной. В более ранних исследованиях по изучению свойств нативного ППБА была выявлена способность белка А защищать экспериментальных животных от инфекций, вызванных различными капсульными типами пневмококков [22]. На модели сепсиса было продемонстрировано, что подкожная и внутрибрюшинная иммунизация полноразмерной молекулой ППБА значительно повышает выживаемость мышей при внутривенном заражении пневмококком. Кроме того, иммунизация бескапсульным прогретым штаммом пневмококка Rk1 индуцировала также защиту мышей от внутривенного заражения S. pneumoniae [6]. Приведенные данные позволяют заключить, что для создания пневмококковой вакцины можно использовать нативный ППБА. Не вызывает сомнений, что для разработки отечественной пневмококковой вакцины необходимо использовать полисахариды актуальных серотипов пневмококка, циркулирующих на территории РФ, а также протективные белковые антигены пневмококка. Поскольку, как уже было сказано выше, собственные белки пневмококка способны не только вызывать переключение иммунного ответа на Т-клеточный, но и создавать защиту от самого пневмококка, индуцируя образование специфичных к ним антител, блокирующих жизненно важные ферменты, или факторы патогенности S. pneumoniae. Будет ли такая вакцинная конструкция эффективной - покажет практика. Помимо приведенных выше данных о пневмококковом поверхностном белке А экспериментально доказана протектив-ная активность таких белков пневмококка, как пневмолизин и мурамиламидаза [17]. Исследователи предполагают, что комбинированное введение нескольких протективных белков пневмококка будет более эффективно, чем иммунизация каждым из них по отдельности. В частности, в работе J. Paton et al. было показано, что комбинация пневмолизина, пневмококковых поверхностных белков А и С индуцирует формирование более сильной защиты по сравнению с иммунизацией двумя белками или только одним [31]. В аналогичной работе R. Mallery et al. было продемонстрировано, что ковалентная конъюгация 3 специфических антигенов пневмококка - пневмолизина, пневмококкового поверхностного адге-зина А и полисахарида клеточной стенки - защищает мышей от последующего заражения пневмококком [19]. Однако одна из основных проблем использования ППБА в составе пневмококковых вакцин состоит в том, что данный белок отличается антигенным разнообразием среди различных штаммов пневмококка, хотя при этом он обладает перекрестной активностью [17, 26, 27]. Другая проблема (при получении нативного белка А) заключается в сильном взаимодействии ППБА с холином, который является важной молекулой в клеточном взаимодействии и проведении сигналов, что затрудняет выделение чистого ППБА традиционными методами [6]. До сих пор не известно, как это взаимодействие повлияет на формирование у человека защиты от заболеваний, вызванных пневмококком, при использовании полноразмерной молекулы ППБА в составе пневмококковой вакцины. По-видимому, решением этих проблем будет создание химерного рекомбинантного пневмококкового поверхностного белка А из семейств 1 и 2, соответственно. С одной стороны, известно, что иммунизация рекомбинантным ППБА с адъювантом, в том числе интраназальная, вызывает защиту животных от внутривенного, интратрахеального или внутрибрюшинного заражения пневмококком [9, 11, 34]. С другой - очевидно, что будущая вакцина от пневмококковой инфекции должна включать как комплекс протек-тивных белков пневмококка [36], так и полисахариды, прежде всего, актуальных серотипов пневмококка, наиболее часто вызывающих инвазивные пневмококковые заболевания. Кроме того, с практической точки зрения важным представляется направление по разработке комбинированных вакцин, которые будут эффективно защищать от двух и более патогенов.

About the authors

D. S Vorobyev

Mechnikov Research Institute ofVaccines and Sera

Moscow, Russia

I. B Semenova

Mechnikov Research Institute ofVaccines and Sera

Moscow, Russia

References

Supplementary files