MICROBIAL «FRIEND-FOE» IDENTIFICATION IN HUMAN INTESTINE MICROSYMBIOCENOSIS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Рассматривая инфекцию в качестве модельной системы ассоциативного симбиоза с ее трехвекторными компонентами [2, 4], мы обратили внимание на недостаточную изученность микросимбио-ценоза (доминант - ассоциант), определяющего формирование гомеостаза инфицированного хозяина. При этом формирование микросимбиоценоза оказалось обусловленным совокупностью важнейших физиологических функций адаптации микроорганизмов к хозяину - размножение (антагонизм), персистентный потенциал и биопленкообразование, присущих как патогенам, так и представителям индигенной микрофлоры [6]. Эти универсальные физиологические функции микроорганизмов в условиях инфекции представляют основу функционирования микросимбиоценоза и составляют его системообразующий фактор. Изучение особенностей межмикробных взаимоотношений доминантов (ин-дигенов) и ассоциантов потребовало разработки нового методического подхода оценки этих взаимодействий и позволило осуществить микробное распознавание «свой-чужой» в условиях микросимбиоценоза человека, определив целевую установку работы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Алгоритм проведения исследований по взаимодействию доминантных и ассоциативных микроорганизмов в микросимбио-ценозе. На первом этапе штаммы облигатно-анаэробных бактерий и дрожжевых грибов изолировали от пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника. В исследованиях в качестве ассоциантов было использовано 18 культур условно патогенных микроорганизмов (лактозопозитивные негемолитические, лактозонегативные гемолитические E.coli, K.pneumoniaе, S.aureus, E.faecium, C.albi-cans). Выделение микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами в соответствии с методическими рекомендациями [7]. В качестве доминантного штамма/ов использовали музейные культуры Bifidobacterium spp., видов B.bifidum, B.longum и B.adolescentis (9 штаммов). На втором этапе условно патогенные микроорганизмы идентифицировали на основании морфологических, тинктори-альных, культуральных и биохимических свойств с использованием коммерческих тест-систем «Lachema» (Чехия) и «bioMe-rieux» (Франция). На третьем этапе получали супернатанты ассоциантов и осуществляли их соинкубирование с культурой Bifidobacterium spp. Для получения супернатантов ассоциантов 0,1 мл взвеси микроорганизмов на физиологическом растворе хлорида натрия вносили в 2,9 мл питательного бульона и культивировали при 37°С в течение 24 - 48 ч в условиях шейкер-инкубатора «BioSan» (Латвия), после чего суточную бульонную культуру центрифугировали при 3000 об/мин и пропускали через мембранный фильтр «Millipore» с диаметром пор 0, 12 мкм. Далее супернатант ассоциантов смешивали с питательным бульоном в соотношении 1:9, вносили культуру доминантов (бифидобактерий) и культивировали при 37°С в течение 24 - 48 часов в условиях шейкер-инкубатора. В контроле культуры доминантов вносили в питательный бульон без добавления супернатантов ассо-циантов. На четвертом этапе полученную бульонную культуру доминантов центрифугировали при 3000 об/мин и пропускали через мембранный фильтр «Millipore» с диаметром пор 0, 12 мкм. Полученный супернатант доминантов смешивали с питательным бульоном в соотношении 1:9, вносили культуру ассоциантов и вновь культивировали при 37°С в течение 24 - 48 часов в условиях шейкер-инкубатора. В контроле культуры ассоциан-тов вносили в питательный бульон без добавления супернатантов доминантов. На пятом этапе у микроорганизмов ассоциантов определяли ростовые свойства (РС), способность к образованию биопленок (БПО) и антилизоцимную активность (АЛА) - фотометрическим методом [1, 3, 11] на фотометре ELx808 (BioTek, США). Полученные данные оценивали по изменению РС, АЛА и способности к БПО ассоциантов под влиянием супернатантов доминантов, предварительно обработанных супернатантами ассоциантов. В результате по снижению РС, АЛА и БПО микроорганизмов-ассоциантов под влиянием супернатантов бифидобактерий ассоцианты относили к «чужим» видам; а по увеличению (или отсутствию изменений) этих показателей штаммы относили к «своим» видам (VI этап). Полученные данные статистически обработаны в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel и программы «Biostat» с использованием критерия Фишера-Стьюдента [5]. РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ полученных данных позволил выявить избирательность реакции бифи-дофлоры в отношении ассоциативных микросимбионтов, которая зависела от функциональной принадлежности микроорганизмов к представителям инди-генной микрофлоры, составляющей основу микросимбиоценоза при эубиозе, или к транзиторным микроорганизмам, чаще выявляемым при дисбиозе кишечника человека. Внесение в среду культивирования субингибиторных концентраций экзометаболитов ассоциативных микросимбионтов не влияло на ростовые свойства бифидобактерий, что позволило предположить, что последующее влияние метаболитов доминантов на индигенные и транзиторные микросимбионты не было связано с изменением численности Bifidobacterium spp., а являлось следствием изменения их функциональной активности. В экспериментах in vitro установлено, что предварительное соинкубирование супернатантов E.coli с различными свойствами (лактозопозитивные негемолитические и лактозопозитивные гемолитические) с культурами B.bifidum, B.longum и B.adolescentis способствовало стимуляции антилизоцимной активности и биопленкообразования лактозопозитивных негемолитических кишечных палочек и не влияло на их ростовые свойства при взаимодействии с супернатантами Bifidobacterium spp. Напротив, под действием экзометаболитов бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантами эшерихий, отмечено снижение РС, АЛА и БПО транзиторных лактозонегативных гемолитических E.coli. Угнетение исследуемых биологических свойств (РС, АЛА, БПО) также было отмечено у другого представителя грамнегативных транзиторных бактерий - K.pneumoniae, часто обнаруживаемого при дисбиотиче-ских изменениях в микросимбиоценозе кишечника человека (табл.). Выявленные закономерности на основе оппозитных взаимоотношений микросимбионтов в паре «доминант-ассо-циант» были получены и при изучении бифидофлоры с представителями грам-позитивных бактерий (S.aureus и E.fae-cium). В данном случае, B.bifidum, B. longum и B.adolescentis, предварительно соинкубированные с супернатантом грампозитивных кокков, ингибировали рост, антилизоцимную активность и биопленкообразование S.aureus, типичного представителя транзиторной микрофлоры, но при этом не влияли на РС и даже стимулировали АЛА и БПО индигенного штамма E.faecium. На основании выявленного оппозит-ного (усиление/подавление) феномена пары «доминант-ассоциант», по результату взаимоотношений бифидобактерий с ассоциативными микросимбионтами все исследуемые микроорганизмы были условно разделены на «свои» и «чужие» виды микросимбионтов. Анализ фактического материала показал, что к «своим» видам относились представители инди-генной микрофлоры (лактозопозитивные негемолитические E.coli и E.faecium), составляющие наряду с бифидобактериями основу микросимбиоценоза при эубиозе биотопа дистального отдела толстого кишечника человека. Супернатанты бифидобактерий не изменяли ростовых свойств лактозопозитивных негемолитических эшерихий, а увеличение их анти-лизоцимной активности и биопленкообразования варьировало в пределах 23,4 Изменение физиологических функций ассоциантов под влиянием супернатантов доминантов, предварительно обработанных супернатантами этих же ассоциантов Супернатанты доминантов Физиологи- Изменение физиологических функций ассоциантов под влиянием супернатантов доминантов, предварительно обработанных супернатантами этих же ассоциантов (%) ческие функции ассоциантов E.coli lac «+» hem «-» n=3 E.coli lac «-» hem «+» n=3 K.pneumoniae n=3 E.faecium n=3 S.aureus n=3 C.albicans n=3 B.longum (n=3) рост нет измене - 56,5+5,3 - 68+3,5 нет измене- - 63,5+2,9 - 61,2+3,2 ний ний АЛА + 27+2,5 - 35,8+2,7 - 48+4,4 + 17,5+0,5 - 45+3,9 - 34,1+2,5 БПО + 39+2,5 -26,3+3,3 - 32+1,8 + 32+2,5 - 39+1,8 - 31+1,9 «свой» «чужой» «чужой» «свой» «чужой» «чужой» B.adolescentis рост нет измене- - 56+5,3 - 27,4+2,2 нет измене- - 26,9+2,1 - 32,6+2,9 (n=3) ний ний АЛА + 32+2,5 - 24,5+2,1 - 30+2,2 + 23,8+2,1 - 23+1,4 - 22,7+1,3 БПО + 25±1,7 - 25+2,2 - 25+2,1 + 25+1,7 - 33+2,0 - 22,5+1,5 «свой» «чужой» «чужой» «свой» «чужой» «чужой» B.bifidum (n=3) рост нет измене- - 56,2+5,2 - 28+2,5 нет измене- - 27,3+2,1 - 20,7+1,6 ний ний АЛА + 23,4+2,4 - 54+3,0 - 41+3,0 + 27,2+2,1 - 38+2,9 - 30,4+2,7 БПО + 28+3,3 - 27+2,5 - 31 + 1,7 + 34+3,6 - 37+2,2 - 24+1,7 «свой» «чужой» «чужой» «свой» «чужой» «чужой» П римечание. + Усиление экспрессии, - снижение. - 32 и 25 - 39% соответственно. Это позволило отнести данный вид микросимбионтов к «своим» видам. Также к «своим» симбионтным микроорганизмам были отнесены энтерококки, у которых Bifidobacterium spp. не изменяли РС и увеличивали АЛА и БПО в диапазоне 17,5 - 27,2 и 25 - 34% соответственно. Таким образом, «своими» микросимбионтами, считали виды бактерий, не изменяющие свои РС под влиянием супернатантов бифидобактерий или же увеличивающие значения АЛА и БПО в пределах 17,5 - 32 и 25 - 39% соответственно. По результату влияния супернатантов исследуемых культур бифидобактерий на РС, АЛА и БПО лактозонегативных гемолитических E.coli, K.pneumoniaе, S.aureus и C.albicans данные представители тран-зиторных условно патогенных бактерий и грибов были отнесены к «чужим» видам микроорганизмов. Ингибирование РС, АЛА и БПО лактозонегативных гемолитических E.coli под действием супернатантов бифидофлоры наблюдали в диапазоне 56 - 56,5%, 24,5 - 54% и 25 - 27% соответственно. Для исследуемых штаммов K.pneumoniaе данный коридор составлял: при определении изменений РС 27,4 - 68%, АЛА 30 - 48%, БПО 25 - 31%. При воздействии экзометаболитов бифидобактерий угнетение роста, АЛА и БПО S.aureus варьировали в пределах 26,9 - 63,5%, 23 - 45% и 33 - 39% соответственно. Изменение свойств C.albicans находилось в диапазоне: РС - 20,7 - 61,2%, АЛА - 22,7 - 34,1% и БПО - 22,5 - 31%. Обобщая полученные данные, экспериментально были определены коридоры ингибирования биологических свойств «чужих» видов микросимбионтов: для РС - 20,7 - 68%, для АЛА - 22,7 - 54% и для БПО - 22,5 - 39%. ОБСУЖДЕНИЕ Традиционно распознавание «своего» и «чужого» является неотъемлемым свойством иммунной системы, которая реализует защиту хозяина посредством различных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, обеспечивая гомеостаз внутренней среды организма [8]. Эволюционно сложившийся ассоциативный симбиоз макроорганизма и его индигенной микрофлоры, важнейшими представителями которой являются бифидобактерии, способствовал развитию тесной взаимосвязи (метаболической, генетической, регуляторной и др.) организма хозяина с его микробиотой, которая выполняет существенную роль в обеспечении состояния физиологической нормы и поддержания гомеостаза организма человека [9, 12]. Бифидобактерии, составляя физиологическую основу нормального микросимбиоценоза человека, принимают участие в реализации колонизационной резистентности биотопа, вероятно, и в том числе за счет продукции специфических антимикробных метаболитов, подавляющих размножение ассоциативных микросимбионтов [10]. Проведенные исследования показали, что при ассоциативном симбиозе не только организм хозяина способен участвовать в распознавании «свой - чужой» в отношении микрофлоры посредством различных механизмов иммунитета, но и доминантная индигенная микрофлора (бифидобактерии) способна определять «свои» и «чужие» виды бактерий и грибов при формировании микросимбиоценоза. Экспериментально выявленный феномен оппозитного (усиление/подавление) влияния микросимбионтов на их биологические свойства (РС, АЛА, БПО) позволил реализовать распознавание «свой - чужой» в условиях микросимбиоцено-за как в межвидовых условиях, так и внутри вида. Подтверждением тому - взаимоотношения доминантов как с разными видами ассоциативных микросимбионтов (E.coli, K.pneumoniaе, S.aureus, E.faecium, C.albicans), так и внутри одного вида (E.coli), где экзометаболиты лактозопозитивных (индигенных) и лактозонегативных гемолитических (транзи-торных) эшерихий по разному «распознаются» доминантами (бифидобактериями). Очевидно, что индигенные бактерии, стремясь сохранить гомеостаз внутренней среды макроорганизма, необходимый для осуществления их жизнедеятельности, способны дифференцировать представителей нормофлоры от условно патогенных симбионтов. Основу данного «распознавания» определяют экзометаболиты микросимбионтов, в том числе, присутствие в них, по-видимому, сигнальных молекул (феромонов, гомо-серинлактонов и др.), влияющих на сенсорные белки регуляторных систем бактерий, играющих важную роль в адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям среды [13, 14]. Инициация функции ранее молчащих генов в ответ на специфический химический сигнал, содержащийся в среде, приводит, вероятно, к изменению метаболической активности клеток бактерий индигенной микрофлоры, в частности к их способности влиять на рост и персистентные характеристики индигенных и транзиторных микросимбионтов. Вот почему внедрение микроорганизмов в организм хозяина, их выживание будет зависеть не только от результата распознавания патогена иммунной системой организма, но и от взаимоотношений с уже существующей индигенной микрофлорой данного био-топа.Это объясняет, почему включение в ассоциативный симбиоз бактерий-ассо-циантов приводит к различным исходам инфекции [2, 4]. Практическая значимость полученных данных раскрывает новые механизмы межмикробных взаимоотношений симбионтов в условиях микросимбиоценоза как составной части колонизационной резистентности хозяина при инфекции, что может способствовать решению как диагностических задач, так и отбору эффективных «кандидатов» при создании новых биопрепаратов (пробиотиков и синбиотиков). Работа выполнена по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» в рамках проекта № 09-П-4-1007 «Механизмы формирования и регуляции ассоциативного симбиоза человека».

About the authors

O. V Bukharin

Orenburg, Russia

N. B Perunova

Orenburg, Russia

References

Supplementary files