LACTOBACILLUS PLANTARUM AND PHOSPRENYL COMPETITIVELY DISTINGUISH OVALBUMIN OLIGOMANNOSIDE N-GLYCAN

Full Text

ВВЕДЕНИЕ N-гликаны, содержащие маннозу в составе простетической части гликопротеинов, часто выполняют роль специфических акцепторов различных биологически важных объектов. Особое место среди последних занимают представители индигенной микрофлоры - бактерии рода Lactobacillus, заселяющие ЖКТ и способные оптимизировать его функции [3, 5]. Полагают, что отдельные виды или штаммы этих бактерий различают и оккупируют маннозосодержащие сайты на клетках эпителия кишечника и таким образом реализуют свои защитные (пробиотические) свойства, препятствуя связи с энтероцитами транзиторных видов патогенных и условно патогенных микроорганизмов [2]. Очевидно, что пробиотическое дей- ствие лактобактерий, коррегирующее микробный пейзаж ЖКТ и иных открытых полостей организма, многофакторно и оно может включать не только упомянутые молекулярные, но и бактерицидные и иммунологические механизмы. В настоящей работе с помощью анти-генспецифичной реакции ГЗТ in vivo была продемонстрирована способность нативных препаратов L. plantarum конкурировать с иммуномодулятором фоспре-нилом за взаимодействие с маннозосо-держищим N-гликаном овальбумина. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Постановку реакции ГЗТ на беспородных мышах Центрального питомника лабораторных животных РАМН проводили по стандартной схеме [4]. Примирующую дозу антигена (инактивированная парами хлороформа агаровая культура L. monocytogenes) - 5х105 КОЕ/0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида - вводили подкожно. Разрешающую дозу - 5х107 КОЕ/0,02 мл - в стопу задней лапы. Интервал между первым и вторым введениями антигена составил 6 сут. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена. По разнице в массе опытной и контрольной стоп сдвиг индекса реакции (ИР) между опытными и контрольными (несенсибилизированными) группами животных оценивали как достоверный при разнице в показателях >5%. Lactobacillus plantarum (штамм 30) [1] выращивали на селективном агаре Манна, Рогоза, Шарпа (MRS-агар) при 37°С в течение 48 ч. Ультразвуковые лизаты бактерий готовили из суспензии живых микробных клеток 5х109КОЕ путем их обработки в ультразвуковом дезинтеграторе MSE «Англия» 100 Вт в течение 1 мин при частоте 20 Кц и амплитуде 9 - 10 мкм. Для инактивации бактерий использовали метод последовательного 7 - 8-кратного замораживания бактериальной суспензии. Отсутствие живых микробных клеток контролировали высевом суспензии на селективную среду, MRS-агар. Доза из расчета 9х106 КОЕ/0,2 мл, вводили подкожно. Фоспренил (ЗАО «Микро-плюс», Рис. 1. Овальбумин (ОВА) ингибирует гиперчувствительность замедленного типа, блокируя ИЛ-2. По оси ординат - индекс реакции ГЗТ, %. 1. Контроль (листериозный антиген-Лаг 0-сутки); 2. ОВА (за 1 сут до введения Лаг); 3. Одновременное введение Лаг+ОВА; 4. Одновременное введение Лаг+ОВА+ ИЛ-2 (на следующие сутки после сенсибилизации). №, S Н-1 1 Е 3 4 Рис. 2. Фоспренил (ФП) ингибирует ГЗТ, блокируя рецептор ИЛ-2 и восстанавливает состояние ГЗТ, образуя нейтральные комплексы с ОВА. По оси ординат - индекс реакции ГЗТ, %. 1. ФП (за 1 сут до введения Лаг)+Лаг; 2. Одновременное введение Лаг+ФП; 3. Одновременное введение Лаг+ФП+ИЛ-2 (на следующие сутки после сенсибилизации); 4. Одновременное введение Лаг+ФП+ОВА. Россия): полипренилфосфат натрия - иммуномодулятор растительного происхождения, образует нейтральные комплексы с содержащими маннозу N-гли-канами в составе некоторых гликопротеинов (CD25, гаммаглобулин, овальбумин) и тормозит реакцию ГЗТ in vivo. Доза 60 мкг/0,2 мл; вводили подкожно [7, 9]. Овальбумин («Sigma», США) является акцептором ИЛ-2, аналогично CD25 и у-глобулину. Доза 40 мкг/0,2 мл; вводили подкожно [3]. Ронколейкин (ООО «Биотех», Россия) рекомбинантный ИЛ-2 человека. Доза 1 - 3 МЕ/0,2 мл; вводили подкожно. РЕЗУЛЬТАТЫ Реакция ГЗТ на листериозный антиген как показатель состояния клеточной иммунореактивности удобна потому, что в ней отчетливо разделены во времени фазы индукции (примирования) и индикации (разрешения), в течение которых формируется и в дальнейшем функционально проявляется зависимая от ИЛ-2 клонально специфическая популяция клеток-эффекторов ГЗТ - Т хелперов 1 типа (ТЫ). Именно поэтому, любое нарушение во взаимодействии этого цитокина со своими клеточными рецепторами в этот период негативно влияет на уровень ГЗТ. Рис. 3. Лактобактерии (ЛАБ) тормозят реакцию ГЗТ (А), образуют с ОВА нейтральные комплексы (B) и конкурируют с ФП в этом процессе (С). По оси ординат - индекс реакции ГЗТ, %. 1. Контроль (Лаг); 2. А. Лаг+ФП; 3. Лаг+ОВА; 4. Лаг+ЛАБ; 5. B. Лаг+ОВА/ФП; 6. Лаг+ОВА/ЛАБ ультразвуковой лизат; 7. Лаг+ОВА/ЛАБ зам.; 8. С. Лаг+ОВА/ФП+ЛАБ; 9. Лаг+ОВА/ЛАБ+ФП. Было установлено, что овальбумин и фоспренил (ФП) ингибировали ГЗТ в первые двое суток ее индуктивной фазы. При этом действие ФП в отличие от действия овальбумина не отменялось последующим введением рекомбинантного ИЛ-2 (рис. 1). В то же время, смесь обоих ингибиторов была нейтральна и не влияла на ГЗТ, что свидетельствовало о том, что сайт взаимодействия овальбумина с ИЛ-2 аналогичен сайту, распознаваемому как ИЛ-2, так и ФП (рис. 2). В связи с этим, представляло интерес исследование в реакции ГЗТ поведения лактобактерий, проявляющих заметную адгезивную активность по отношению к маннозосодержащим субстратам, которую отменяет метил-а^-маннопира-нозид [6]. При использовании двух видов нативных (нефиксированных) препаратов L. plantarum (штамм 30) было обнаружено, что они, подобно ФП, ингибировали реакцию ГЗТ и образовывали с овальбумином нейтральные комплексы, конкурируя в данном процессе с этим иммуномодулятором. Это указывало на то, что сохраняющиеся в препаратах лактобацилл маннозоспецифичные адгезины имеют в овальбумине те же сайты связывания, что и ФП, а следовательно, и ИЛ-2 (рис. 3). ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты указывают на то, что векторы действия обоих ингибиторов ИЛ-2 зависимой фазы ГЗТ - овальбумина и ФП - направлены на различные посттранскрипционные продукты активированных клеток: у овальбумина на эндогенный ИЛ-2, а у ФП на индуци-бельную а-цепь высокоаффинного три-мерного комплекса ИЛ-2. Влияние нативных продуктов лактобактерий на ГЗТ подчиняется описанной в работе феноменологии, которая объясняется присутствием структурно идентичных маннозосодержащих N-гликанов в составе внеклеточного домена а-цепи и в еще большем количестве представленных в составе овальбумина. Фоспренил, ИЛ-2 и адгезины лактобацилл различают эти N-гликаны с неэкранированными двухантенными терминалями из 5 или 6 остатков маннозы, подобно лектинам, соответственно растительного и животного происхождения [6]. Подтверждая существование такого молекулярного механизма в одном из производимых лактобактериями пробиотических эффектов, полученные результаты позволяют ставить вопрос о правомерности использования фоспренила в качестве фармакологического имитатора лактобацилл-симбионтов и возможности использования последних для индикации, а также градиентного выделения из смешанных клеточных популяций CD25 Т-лимфоцитов.

About the authors

S. M Sobolev

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

T. N Nikolaeva

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

E. A Grigoryeva

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. V Pronin

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files