CHARACTERISTICS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS CIRCULATING IN PSKOV REGION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Согласно официальным данным показатель заболеваемости туберкулезом в Псковской области на 100 000 населения в 2009 г. составил 86,7 против 94,9 в 2008 г. Несмотря на то, что эпидемическая ситуация по туберкулезу в целом несколько улучшилась, растет число случаев туберкулеза, вызванного лекарственно устойчивыми (ЛУ) штаммами Mycobacterium tuberculosis. Особую опасность представляет распространение микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), характеризуемой одновременным наличием резистентности к наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) - рифампицину и изониазиду. Так, частота МЛУ (первичной) штаммов возбудителя, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом органов дыхания в Псковской области, составила 21,9% в 2008 г. против 14,6% в 2007 г. Резистентность М. tuberculosis к ри-фампицину обусловлена возникновением хромосомных мутаций в гене троВ, к изониазиду - в генах katG, inhA, ahpC и др. [7]. Популяция M. tuberculosis неоднородна и представлена штаммами, различающимися не только по спектру мутаций, ассоциированных с резистентностью к ПТП, но и по ряду генетических маркеров (инсерционный элемент IS6110, полиморфизм DR локуса хромосомы и др.), что позволяет осуществлять глобальный и локальный мониторинг возбудителя туберкулеза. Цель исследования - характеристика лекарственной устойчивости и структуры популяции M. tuberculosis в Псковской области. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Изучено 90 штаммов M. tuberculosis от эпидемиологически не связанных больных, 59 (65,6%) мужчин и 31 (34,4%) женщина, в возрасте 20 - 73 лет, находившихся на лечении в Псковском областном противотуберкулезном диспансере в 2008 - 2009 гг., в основном, по поводу инфильтративного (71,1%) и диссеминированного (18,9%) туберкулеза легких. Заболевание было выявлено впервые у 65 (72,2%) больных; 25 (27,8%) ранее получали противотуберкулезное лечение. Все пациенты были ВИЧ-отрицательными. Культивирование M. tuberculosis и определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) изолятов к основным ПТП проводили стандартным непрямым методом абсолютных концентраций. При наличии устойчивости к одному из ПТП (стрептомицину, S) штаммы М. tuberculosis считали монорезистентными, двум препаратам (стрептомицину и изониазиду, S+I) - полирезистентными, одновременно устойчивые к рифампицину и изо-ниазиду - мультирезистентными (МЛУ). Образцы ДНК выделяли из чистых культур M. tuberculosis согласно [8]. Анализ мутаций в генах, ассоциированных с ЛУ M. tuberculosis к рифампицину и изониа-зиду, проводили с использованием тестсистемы «ТБ-БИОЧИП», ИМБ РАН. Генотипирование штаммов осуществляли с помощью инвертированной IS6110-ПЦР [6] и метода сполиготипирования [5]. Данный метод основан на выявлении вариабельности нуклеотидных последовательностей (спейсеров), разделяющих короткие прямые повторы нуклеотидов DR локуса хромосомы M. tuberculosis. Сполиготип и принадлежность штаммов к генетическому семейству определяли согласно постоянно обновляемой международной компьютерной базе профилей сполиготипирования SITVIT SpolDB4 (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/ SITVITDemo) и локальной базе данных лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН СПб НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора [4]. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы EpiCalc2000, вычисляя %2. Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р<0,05). РЕЗУЛ ЬТАТЫ Лекарственной устойчивостью обладали 55 (61,1%) из 90 штаммов M. tuberculosis; 34 из 35 ЛЧ штаммов были выделены от впервые выявленных больных (табл. 1). Как видно из табл. 1, МЛУ была выявлена у 40 (44,4%) штаммов. Первичной лекарственной устойчивостью обладал 31 (47,7%) из 65 штаммов M. tuberculosis, при этом 19 (29,2%) были мультирезистентны. Обращает на себя внимание преобладание МЛУ в структуре первичной (61,3%) и вторичной (87,5%) лУ возбудителя. Многообразие профилей гибридизации штаммов М. tuberculosis представлено в табл. 2. Анализ структуры DR-области хромосомы 90 штаммов M. tuberculosis позволил определить 19 вариантов профилей сполиготипирования (споли-готипов), 18 из них, принадлежащих к различным генетическим семействам, были представлены в SpolDB4. Большинство сполиготипов представлены кластерами штаммов, полученных не менее чем от двух больных (табл. 2). Наиболее распространенным оказался профиль сполиготипирования SIT1, выявленный у 40 (44,4%, р<0,001) из 90 штаммов M. tuberculosis, что согласуется с результатами инвертированной IS6110-ПЦР. Из табл. 1 и 2 видно, что ЛУ и МЛУ чаще встречались у штаммов Beijing, чем у всех штаммов (суммарно) прочих генотипов, составляя 82,5% (33 из 40) и 57,5% (23 из 40), х2=13,9; р<0,001 и х2=4,9; р=0,03, соответственно. Большинство (69,6%) МЛУ штаммов Beijing проявляли устойчивость к стрептомицину и этамбу-толу. Кроме штаммов Beijing в изученной популяции возбудителя туберкулеза выявлены штаммы других генетических семейств (табл. 1,2). Генетическое семейство LAM представлено 19 (21,1%) штаммами различных сполиготипов. Все 8 штаммов SIT252 (LAM) были мультирезистентны. Семейство Т представлено 13 (14,4%) штаммами, которые, кроме одного из восьми штаммов SIT53, были чувствительны к ПТП. Доля штаммов семейства Haarlem (H) составила 11,1%; самым малочисленным (5,6%) в изученной выборке штаммов было генетическое семейство Ural (табл. 1, 2). Таким образом, в нашем исследовании наиболее распространенными среди штаммов «не-Beijing» были МЛУ штаммы SIT252 (LAM) и ЛЧ штаммы SIT53 (Т), удельный вес каждого из которых в структуре сполиготипов составлял по 8,9%. Принадлежность к генетическому семейству не установлена у двух штаммов SIT3108 и штамма R167, не имеющего аналога в SpolDB4. Среди 65 штаммов, выделенных от впервые выявленных больных, доминировали штаммы Beijing (44,6%) (табл. 1). При этом почти половина (48,3%) из них были мультирезистентны. В равных долях (по 18,5%) были представлены штаммы Таблица 1. Характеристика штаммов М. tuberculosis Штаммы Генетическое семейство Отношение к ПТП: ЛЧ S S+I МЛУ Всего(%) Впервые выявленных Beijing 7 3 5 14 29 (44,6) больных LAM 5 0 2 2 9(13,8) Т 11 1 0 0 12(18,5) Н 6 1 0 1 8(12,3) Ural 2 0 0 2 4(6,2) не определено 3 0 0 0 3 (4,6) Всего 34 5 7 19 65 (100) Ранее леченных Beijing 0 1 1 9 11 (44,0) больных LAM 0 0 1 9 10(40,0) Т 1 0 0 0 1 (4,0) Н 0 0 0 2 2 (8,0) Ural 0 0 0 1 . 1 (4,0) Всего 1 1 2 21 25 (100) Сполиготип Генетическое Профиль сполиготипирования Число Россия R SpolDB4 SIT семейство штаммов 0 1 Beijing □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■ 40 14 252 LAM ■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■ 8 30 11 254 42 3 2 266 2 444 2 267 1 1 8 123 57 2 1288 Т ■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■■□□■■■■■■■■■ 55 5 3 102 3 71 52 1 1 6 2 Н 42 47 46 2 262 3 35 3108 Не определено 2 2 167 Новый ■■■■■■■■□□■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□■■■■□■■ 1 Примечание. ■ Наличие гибридизации; □ отсутствие гибридизации. семейств Т и суммарно Haarlem и Ural; штаммы LAM составили 13,8%. От 25 пациентов с хроническим течением заболевания в основном также выделяли штаммы M. tuberculosis генотипов Beijing и LAM (табл. 1). У 36 (90,0%) из 40 фенотипически мультирезистентных штаммов были выявлены мутации в одном (507, 511, 512, 513, 516, 526 или 531) из 27 кодонов гена фоВ. Среди упомянутых мутаций преобладала замена Ser531^Val, обнаруженная у всех восьми (19,5%) МЛУ штаммов M. низкой чувствительностью последнего. У 44 (89,8%) изученных из 49 фенотипически устойчивых к изониазиду штаммов (в т.ч., 40 МЛУ) М. tuberculosis обнаружена замена katG Ser315^Thr. Из них 26 штаммов принадлежали к генотипу Beijing, 13 - к LAM, остальные - Н и Ural. Мутации в гене ahpC обнаружены не были. У 10 штаммов LAM (SIT252 - 8, SIT266 - 2) выявлена дополнительная замена в гене inhA (inhA T15). ОБСУЖДЕНИЕ У штаммов M. tuberculosis, циркулиtuberculosis сполиготипа SIT252 (LAM). Мутации в кодонах 507, 511, 512, 513, 526 встречались у единичных штаммов. У двух из 40 штаммов мутации резистентности к рифампицину не изучали; у двух штаммов в 27 кодонах гена фоВ мутации не обнаружены, что может быть связано с наличием у них других механизмов устойчивости к препарату. Интересно, что шесть штаммов, фенотипически чувствительных к рифампицину, имели какую-либо мутацию в гене троВ. Расхождение результатов определения ЛЧ микобактерий молекулярно-генетическим и культуральным методами может быть обусловлено более рующих в Псковской области, наиболее распространен сполиготип SIT1. Штаммы данного сполиготипа характеризуются отсутствием с 1 по 34 из 43 сигналов в профиле сполиготипирования и представляют генетическое семейство Beijing M. tuberculosis - одно из наиболее распространенных в мире. Однако географическое распределение штаммов SIT1 неравномерно. Так, в структуре сполиго-типов в Китае доля SIT1 превышает 85%, в Западной Европе не достигает 10%, а в некоторых регионах России его выявляют примерно у половины циркулирующих штаммов M. tuberculosis [1 - 3, 6]. ЛУ и МЛУ у штаммов Beijing встречались чаще, чем у штаммов «не-Beijing» (р<0,001 и р=0,03, соответственно) и были обусловлены мутациями гроВ Ser531^Leu и katG Ser315^Thr. Данные мутации, обеспечивающие устойчивость к высоким концентрациям рифампицина и изониазида in vitro, доминируют у российских МЛУ штаммов M.tuberculosis, преимущественно, генотипа Beijing [1, 2, 7]. Ранее нами блыо установлено, что по частоте встречаемости второе место после SIT1 (Beijing) на cеверо-pападе России принадлежало сполиготипу SIT252 (LAM), большинство МЛУ штаммов которого имели мутации rpoB Asp516->Ser [1]. Интересно отметить, что в настоящем исследовании все восемь штаммов данного сполиготипа были мультирезистентны, причем их устойчивость к рифампицину также была обусловлена мутацией rpoB Asp51^Ser, а устойчивость к изониазиду - сочетанием замен katG Ser315^hr и inhA_T15. Полученные данные свидетельствуют об эпидемическом неблагополучии по туберкулезу и широкой циркуляции МЛУ штаммов M.tuberculosis в Псковской области.

About the authors

A. A. Vyazovaya

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

V. Yu Zhuravlev

Research Institute of Phthisio-pulmonology

I. V Mokrousov

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

T. F Otten

Research Institute of Phthisio-pulmonology

E. P Pavlova

Pskov Region Dispansery for Tuberculosis Control

V. V Krishevich

Pskov Region Dispansery for Tuberculosis Control

B. I. Vishnevsky

Research Institute of Phthisio-pulmonology

O. V Narvskaya

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

References

Supplementary files