TOXICITY AND CYTOKINE-INDUCING ACTIVITY OF LIPOPOLYSACCHARIDE OF VIRULENT YERSINIA PESTIS 231 STRAIN

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Известно, что патогенез чумы в любой её форме представляет собой собственно стадии развития инфекционнотоксического шока, вызванного действием липополисахарида (ЛПС) возбудителя. По современным представлениям септический шок наступает в результате массовой активации тканевых макрофагов эндотоксином, что приводит к выбросу в кровь большого количества провоспалительных цитокинов, в том числе фактора некроза опухоли (TNFa). Последний вызывает острый патологический процесс, так называемый системный эффект TNFa, исполняя роль «индуктора апоптоза» на уровне организма в целом. Способность бактериальных ЛПС активировать клетки врожденного иммунитета макроорганизма обусловлена своеобразием химического строения липида А и конформацией полимера ЛПС [14]. Идентификация и селективный отбор ЛПС различной структуры осуществляются Toll-подобными рецепторами (TLR) миелоидных клеток макроорганизма. Центральная роль в передаче сигнала при этом принадлежит TLR4, обеспечивающему высокоаффинную связь с ЛПС различного строения через соответствующие акцессорные молекулы. В зависимости от химической структуры ЛПС активация TLR приводит к синтезу цитокинов различных классов, количественное и качественное соотношение которых определяет специфику развития инфекционного процесса, течение и исход заболевания [11]. При чуме стадия сепсиса также характеризуется резким увеличением синтеза провоспалительных цитокинов и накоплением их в количестве, летальном для организма. Синтез противовоспалительных цитокинов при этом угнетен [10]. В то же время, препараты ЛПС, выделенные из клеток Y. pestis, выращенных при температуре тела млекопитаю- щих (37°C), обладают слабой цито-кининдуцирующей способностью и, более того, при рестимуляции TLR4, TLR2, TLR9 подавляют воспалительный ответ, индуцируемый через эти рецепторы [7, 12]. Тем не менее, 3- и 5-ацильные формы липида А, свойственные высокотемпературному ЛПС37, необходимы для проявления вирулентных свойств возбудителя чумы in vivo [10]. Различия в иммунных ответах макроорганизма, вызываемых живыми Y. pestis и препаратами ЛПС37, позволили предположить, что при развитии инфекционного процесса в организме хозяина ЛПС Y. pestis модифицируется под влиянием факторов макро- или микроорганизмов, в результате чего реализуется его токсический потенциал. Принцип модификации ЛПС in vivo заключается в изменении его трёхмерной пространственной конфигурации под влиянием белков и липопротеидов макроорганизма, которые, соединяясь с ЛПС, усиливают или же блокируют его действие [9]. Ранее в серии специально выполненных экспериментов установлено, что in vitro модуляторами конформационных изменений ЛПС Y. pestis могут быть биологически активное вещество - гликолипид, присутствующий в эритроцитах крови и паренхиматозных органах млекопитающих, или же специфический белок Y. pestis - «мышиный» токсин (МТ), образующий комплекс ЛПС-МТ, специфичный и высокотоксичный для животных. В обоих случаях усиление токсичных свойств ЛПС связано с формированием токсически активной конформации его полимеров [2]. Кроме того, на модели клеток моноцитов человека было выяснено, что исходные и модифицированные вышеуказанными способами препараты ЛПС вакцинного штамма Y. pestis EV76 индуцируют различный уровень синтеза TNFa и IFNy. Прямой связи между токсичностью и продукцией TNFa обнаружено не было [3]. Следует отметить, что ЛПС штамма Y. pestis EV76, использованный в этих экспериментах, отличается по химической структуре липида А и углеводов коровой области от ЛПС природных штаммов Y. pestis [1]. Для выяснения роли конформационных изменений ЛПС в развитии токсического шока при чуме представлялось необходимым определить коррелятивную связь между токсичностью и цитокининдуцирующей активностью исходных и конформаци-онно модифицированных форм ЛПС вирулентного штамма Y. pestis, что и явилось целью настоящего исследования. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали ЛПС полноценного вирулентного штамма Y. pestis 231, LD50 которого равнялась 5А20 м.к./ мышь. ЛПС выделяли из клеток, выращенных при 37°С на агаре LB (Difco, США) в течение 48 ч по методу Westphal О. [13]. МТ из Y. pestis EV76 был выделен и очищен по оригинальной методике В.И. Марченкова [2], LD50 МТ равнялась 5,6 (4,0^7,9) мкг/мышь. Для активации токсических свойств ЛПС Y pestis соединяли с МТ и инкубировали 30 мин при 37°С с целью образования комплекса ЛПС-МТ. В работе использовали также коммерческие препараты S-ЛПС Escherichia coli О55:В5 (Fluka, Israel) и R-ЛПС E. coli J5, Rc мутант (Sigma, Germany). Токсическую активность исходных и модифицированных форм ЛПС проверяли на мышах, исследуемые препараты ЛПС вводили внутрибрюшинно, LD50 рассчитывали по общепринятой формуле Кербера. Клетки моноцитов человека линии U-937 (1x106 клеток в лунке) культивировали в 96-луночном планшете в среде PRMI 1640, содержащей 8% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 100 мкг/ мл гентамицина. Для экспрессии цитокинов TNFa и IFNy моноцитами добавляли ЛПС Y. pestis 231 и его модифицированную форму ЛПС37-МТ по 5 мкг на лунку. Количество синтезированных цитокинов определяли методом иммуноферментного анализа через 4 часа после стимуляции моноцитов, для чего использовали коммерческие тест-системы (Век-тор-Бест, Новосибирск). Рестимуляцию моноцитов проводили исходным вариантом ЛПС37 Y. pestis 231 и его модифицированной формой ЛПС37-МТ после первичной активации TLR4 специфичными для него лигандами - S-ЛПС и R-ЛПС E. coli. Время между первым возбуждением рецептора (активация TLR4 с помощью ЛПС E. coli) и повторным (ЛПС Y pestis 231) составляло 30 мин. Учет количества синтезированных цитокинов проводили также через 4 ч после рестимуляции моноцитов. Описанные условия постановки опытов были ранее подобраны нами экспериментально [3]. Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента-Фишера. РЕЗУЛЬТАТЫ На первом этапе работы была изучена токсичность исходного варианта ЛПС37 вирулентного штамма Y pestis 231 и его модифицированной формы ЛПС37-МТ. Как оказалось, ЛПС37 штамма Y. pestis 231 проявляет достаточно высокую степень токсичности и вызывает гибель животных в дозах LD50«330 (240^500) мкг на мышь. Модификация ЛПС37 «мышиным» токсином усиливает токсические свойства препаратов приблизительно в 2 раза, при этом значение LD50 ЛПС37-МТ снижается до «150 (125^250) мкг на мышь. Для сравнения цитокининдуцирую-щей активности препаратов ЛПС37 вирулентного штамма Y pestis 231 исходной и конформационно модифицированной форм использовали моноцитарную линию клеток человека U-937. Об активации моноцитов судили по образованию цитокинов двух типов - TNFa и IFNy. Результаты экспериментов по стимуляции моноцитов ЛПС37 и ЛПС37-МТ Y. pestis 231 представлены на рис. 1 и 2. Из приведённых на рисунке данных видно, что ЛПС37 обладает достаточно высокой цитокининдуцирующей активностью и вызывает одновременно синтез цитокинов обоих типов. При этом количество продуцируемого TNFa достоверно превышает продукцию IFNy (соответственно, 28±5,3 и 15±3,8 пкг/мл). Рис. 1 (вверху). TNFa-индуцирующая активность ЛПС37 Y. pestis 231 и его модифицированной формы ЛПС37-МТ в сравнении с активностью S- и R-ЛПС E. coli на клетках моноцитов человека линии U-937. По оси абсцисс - препараты ЛПС, по оси ординат - количество синтезированного TNFa (пкг/мл). TNFa-активность нестимулированных моноцитов равнялась нулю. МТ в количестве 50 нг на лунку не оказывает стимулирующего действия на моноциты. Рис. 2 (внизу). IFNy-индуцирующая активность ЛПС37 Y. pestis 231 и его модифицированной формы ЛПС37-МТ в сравнении с активностью S- и R-ЛПС E. coli на клетках моноцитов человека линии U-937. По оси абсцисс - препараты ЛПС, по оси ординат - количество синтезированного IFNy (пкг/мл). IFNy-активность нестимулированных моноцитов равнялась нулю. МТ в количестве 50 нг на лунку, стимулирующего действия на моноциты не оказывает. Модифицированная форма ЛПС37-МТ оказалась сильным индуктором синтеза провоспалительного цитокина TNFa. Количество продуцируемого TNFa составляло 43±6,5 пкг/мл, что в 1,5 раза больше по сравнению с уровнем активности исходного препарата ЛПС37. Образование IFNy при этом было незначительно (8±2,8 пкг/мл) или же полностью отсутствовало. Поскольку ЛПС Y pestis относится к R-хемотипу, мы сочли целесообразным использовать в наших опытах коммерческие препараты ЛПС E. coli как в S-, так и в R-форме. В условиях наших экспериментов количество синтезируемых TNFa и IFNy под воздействием S-ЛПС E. coli было равно 47±6,8 пкг/мл и 2,0±1,4 пкг/ мл, соответственно, а для R-ЛПС оно составляло 30±5,5 пкг/мл и 15±3,8 пкг/ мл. Сходство профилей цитокиновых ответов ЛПС37 с R-ЛПС E. coli, а ЛПС37-МТ с S-ЛПС E. coli позволило предположить, что передача сигнала TLR4 от ЛПС37 и ЛПС37-МТ идёт разными путями, подобно тому, как этот процесс происходит у S- и R-форм ЛПС E. coli [14]. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по рестимуляции TLR4 моноцитов человека исходными и модифицированными формами ЛПС37 Y pestis 231. В этих опытах первичную активацию моноцитов проводили специфическими для TLR4 лигандами - R- и S-ЛПС E. coli. На фоне S-ЛПС рестимуляция моноцитов ЛПС37 количество продуцируемого TNFa не изменяет (45±6,6 пкг/мл). Модифицированный вариант ЛПС37-МТ, напротив, оказывает выраженное супрессирующее действие и уменьшает количество синтезируемого TNFa приблизительно в 5 раз (10±3,2 пкг/мл). При этом обе формы ЛПС Y. pestis усиливают синтез IFNy-ЛПС37 до значений 45±6,6 пкг/мл (в 22,5 раза), а ЛПС37-МТ до 10±3,2 пкг/мл (в 5 раз). В опытах, когда моноциты были первично активированы R-ЛПС E. coli, наблюдались следующие количественные изменения синтеза TNFa и IFNy: ЛПС37 супрессирует синтез TNFa, уменьшая его количество в 2,5 раза (с 30±5,5 пкг/мл до 12±3,5 пкг/мл), синтез же IFNy при этом увеличивается до значений 75±8,6 пкг/мл, что в 5 раз превышает уровень первичного ответа моноцитов (15±3,8 пкг/мл). ЛПС37-МТ оказывает противоположное действие - повторная активация моноцитов этой формой ЛПС приводит к столь же резкому (в 2,4 раза) увеличению синтеза TNFa (до 73±8,5 пкг/мл) при одновременной супрессии синтеза IFNy (3±1,7 пкг/мл). ОБСУЖДЕНИЕ Определенная на первом этапе работы высокая токсичность ЛПС37 вирулентного штамма Y. pestis 231 и его модифицированной формы ЛПС37-МТ отличалась от результатов предыдущих экспериментов, выполненных на вакцинном штамме Y. pestis EV76, высокотемпературный ЛПС которого не токсичен для животных даже в дозе 3 - 4 мг. Модифицированные варианты (ЛПС-МТ) проявляли среднюю степень токсичности [LD5o«560 (400^800) мкг на мышь] [4]. Эти различия могут быть обусловлены неодинаковым химическим строением ЛПС37 Y pestis 231 и Y. pestis EV76, что установлено рядом авторов [1, 8]. Препараты ЛПС37 вирулентного штамма Y pestis 231 исходной и конфор-мационно модифицированной форм неодинаково индуцировали синтез TNFa и IFNy в моноцитарной линии клеток человека U-937. Синтез этих цитокинов контролируется различными молекулярными системами TLR, передача сигнала по MyD88-зависимому пути через NF-kB приводит к экспрессии генов провоспалительных цитокинов, в то время как транскрипция генов интерферонов I и II типов контролируется IFR3 фактором TRIF-зависимой сигнальной системы (MyD88-независимый путь). Из всех известных в настоящее время Toll-подобных рецепторов только TLR4 передает сигналы по двум этим путям и способен одновременно индуцировать синтез как провоспалительных цитокинов, так и интерферонов. MyD88-зависимый и MyD88-независимый сигнальные пути связаны между собой и взаиморегулируемы через TIR-домен рецептора, в связи с чем количественные соотношения синтезируемых TNFa и IFNy при активации TLR4 могут служить показателем их активности. ЛПС37 обладает достаточно высокой цитокининдуцирующей активностью и вызывает одновременно синтез цитокинов обоих типов, при этом количество продуцируемого TNFa достоверно превышает продукцию IFNy. Модифицированная форма ЛПС37-МТ, как выяснилось, еще больше усиливала образование TNFa, однако синтез IFNy при этом был незначительным или же полностью отсутствовал. Следовательно, конформаци-онно изменённая форма ЛПС37-МТ реализует сигнал преимущественно по одному из возможных путей - MyD88-зависимому. Данные о высокой TNFa-индуцирующей активности ЛПС Y. pestis, выращенных при 37° С, отличаются от результатов, полученных различными авторами. Обычно при постановке таких экспериментов в качестве контроля используется S-ЛПС энтеробактерий канонического строения. Однако ЛПС Y. pestis, как известно, относится к R-хемотипу. Именно поэтому целесообразно использовать в опытах ЛПС E. coli как в S-, так и в R-форме. Относительно недавно было выяснено, что сайты связывания апикальной части TLR4 с S- и R-формами ЛПС отличаются друг от друга и, соответственно, их воздействие на блок сигнальных проводящих молекул также различно [6]. Характер цитокинового ответа для этих форм ЛПС известен: для S-ЛПС типично доминирование MyD88-зависимого пути передачи сигнала над TRIF-зависимым. ЛПС R-хемотипа активирует одновременно оба пути при незначительном сдвиге в сторону MyD88-зависимого [14]. Среди результатов наших экспериментов по индукции синтеза TNFa и IFNy под действием различных форм ЛПС несомненный интерес, на наш взгляд, представляет тот факт, что количество синтезированных TNFa и IFNy под влиянием ЛПС37 и R-ЛПС E. coli одинаково, а ЛПС37-МТ, как и S-ЛПС E. coli, индуцируют преимущественно синтез только одного класса цитокинов - TNFa. Полученные результаты позволили предположить, что передача сигнала TLR4 от ЛПС37 и ЛПС37-МТ идёт разными путями, подобно тому, как этот процесс происходит у S- и R-форм ЛПС E. coli [14]. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты опытов по рестимуляции TLR4 моноцитов человека исходными и модифицированными формами ЛПС37 Y. pestis 231. Процесс рестимуляции заключается в повторном действии ЛПС на известный рецептор, предварительно активированный специфичным для него лигандом. В зависимости от степени идентичности химической структуры лигандов, используемых для первичной и повторной активации TLR, цитокиновый ответ клетки может быть супрессирован или, напротив, усилен. Рестимуляция TLR одним и тем же ЛПС приводит, как правило, к подавлению его функциональной активности. При частичной комплементарности ЛПС TLR возможны вариации уровня синтеза цитокинов и их качественного состава. В основе этих процессов лежат регуляторные изменения проводящих сигнальных путей TLR на различном уровне, начиная с формирования внешней структуры рецептора, связывающего лиганд, до цитоплазматических регуляторных молекул мРНК цитокиновых генов [5]. Полученные результаты показали, что характер цитокинового ответа моноцитов при действии ЛПС37 и ЛПС37-МТ различен и существенно зависит от того, какая из форм ЛПС E. coli (R или S) была использована для первичной активации TLR4. Чётко продемонстрированы два известных эффекта, наблюдаемых при рестимуляции TLR4 гомологичным или же гетерологичным лигандом - супрессия MyD88-зависимого пути гомологичным лигандом и downVup-регуляция сигнальных путей под влиянием ЛПС с иной химической структурой. При этом первичный сигнал MyD88-зависимого пути, индуцированный R-ЛПС E. coli, супрессируется ЛПС37 Y. pestis 231, а первичный ответ S-ЛПС E. coli подавляется ЛПС37-МТ Y. pestis 231. Регуляторная взаимосвязь MyD88-зависимого и MyD88-независимого сигналов - факт давно известный и описанный в литературе [14]. В отношении ЛПС Y. pestis 231 примечательно то, что регуляторные действия ЛПС37 и ЛПС37-МТ направлены противоположно: ЛПС37 переключает сигнал на TRIF-путь, в то время как для ЛПС37-МТ доминантным является MyD88-зависимое направление. Таким образом, ЛПС37 и ЛПС37-МТ Y. pestis 231 дифференцированно активируют сигнальные пути TLR4. Видимо, презентация исходных и модифицированных форм ЛПС внешней части рецепторного комплекса TLR4 различна и, следовательно, пути передачи сигнала, его сила, молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции также отличаются друг от друга. Трансмембранный сигнал, передаваемый ЛПС37-МТ, является сильным активатором фактора ядерной транскрипции провоспалительных цитокинов, что приводит к повышенному синтезу основного эндогенного медиатора токсического шока - TNFa. Следует отметить, что TNFa-индуцирующая активность ЛПС различных штаммов возбудителя чумы, тестируемая в опытах in vitro, лишь отчасти коррелирует с токсическими свойствами препаратов ЛПС [1]. Для ЛПС вирулентного штамма Y. pestis 231, согласно результатам наших опытов, характерна прямая зависимость между количеством TNFa, синтезируемого моноцитами человека, и токсичностью его для животных. Эта корреляция справедлива как для ЛПС37 исходного варианта, так и для модифицированной формы ЛПС37-МТ. Предположение об изменении конформации ЛПС в условиях макроорганизма как способе реализации его токсического потенциала не лишено оснований. По-видимому, подобные модификации эндотоксина могут возникать при развитии инфекционного процесса в организме хозяина. Вопросы о том, что собой представляет токсически активная конформация ЛПС37 Y pestis, какие связи её формируют и каким образом реализуется этот процесс в условиях in vivo, являются предметом дальнейших исследований.

About the authors

E. P Sokolova

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

G. V Demidova

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

V. P Zyuzina

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

T. N Borodina

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

I. A Bespalova

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

L. P Alekseeva

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

V. I Tinyanova

Research Institute for Plague Control

Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files