SORPTION PROPERTIES OF VARIOUS POLYSACCHARIDE MATRIXES TO LACTOBACILLUS PLANTARUM 8RA-3 BACTERIA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Ранее нами была предложена композиция, состоящая из глобул макропористой целлюлозы с иммобилизованными на поверхности жизнеспособными бактериальными клетками Lactobacillus plantarum 8РА-3, Bifidobacterium bifidum 1 и Escherichia coli M-17, используемыми для производства пробиотических препаратов: лактобактерина, бифидумбакте-рина и колибактерина соответственно [2, 3]. Сорбционный процесс обеспечивал эффективное сосуществование клеток и бактериальных метаболитов, взаимодействующих в условиях регулируемого сорбентом рН, способствуя пролонгированию жизнеспособности жидкой культуры пробиотических бактерий [2, 5]. Следует отметить, что адсорбционная иммобилизация бактериальных культур в настоящее время широко используется в различных направлениях исследований, а в отдельных случаях уже находит технологическое применение. Применение иммобилизации микроорганизмов предполагает достижение технологического и терапевтического эффекта [1, 6, 7]. Популярность этого подхода обусловлена тем, что получаемые таким образом композиционные препараты по своим позитивным свойствам существенно превосходят таковые с обычным наполнителем [4, 6]. Высокоэффективные сорбенты могут использоваться непо-ing for creation of immobilized probiotic preparations. средственно для коррекции бактериальной микрофлоры в местах ее локализации в организме. Примером такого подхода является применение лактофильтрума, содержащего гидролизный лигнин, энте-росгель (полиметилсилоксан) или коллоидный диоксид кремния, предложенные для лечения пищевых токсикоинфекций и неинфекционных воспалительных заболеваний [1, 4, 5]. Как правило, большинство пробиотиков включают жизнеспособные бактериальные клетки и различные композиционные добавки, необходимые при получении лиофилизированных препаратов и повышения сроков выживания культур. Известна одна коммерческая форма иммобилизованных на частицах активированного угля жизнеспособных клеток Bifidobacterium bifidum 1, являющаяся основой препаратов бифидумбак-терин-форте, пробифор и флорин-форте [1, 4, 6]. Следует отметить, что бактериальная суспензия состоит из полифункциональных жизнеспособных клеток, находящихся в различном физиологическом состоянии. В настоящее время достаточно хорошо изучены состав, структура и функциональные особенности клеток, однако до сих пор неясными остаются механизмы стабилизации и регуляции зарядов на поверхности клеточных стенок. Тем не менее, установлено, что наличие и величина зарядов играют главенствующую роль во взаимодействии клетка - сорбент, а природа адсорбционных сил таких взаимодействий определяется, в первую очередь, химическим составом клеточных стенок бактерий и ионообменными лигандами самих сорбентов. Известно, что бактерии, в том числе, грамположительные лактобациллы, несут на своей поверхности отрицательный заряд, который обусловлен анионными полимерами клеточных стенок. Это, в первую очередь, относится к пептидо-гликану, отрицательный заряд которого формируют карбоксильные группы у-глютаминовой и мезо-диаминопи-мелиновой кислот, а также терминальные остатки D-Ala пептидных субъединиц. Значительный вклад в формирование структуры полиэлектролитного геля клеточной стенки вносят тейхоевые и ли-потейхоевые кислоты, а также другие анионные соединения, содержащие углевод-фосфатные полимеры [8]. Цель работы - детальное исследование сорбционных свойств различных полисахаридных матриц в отношении пробиотических бактерий производственного штамма Lactobacillus plantarum 8PA-3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве объекта исследования выбран штамм L.plantarum 8РА-3, используемый для производства пробиотика лактобактерина [4]. Количество клеток определяли высевом на плотные питательные среды. Результаты количественного учета выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ/мл). Для иммобилизации бактериальных клеток использовали макропористые сорбенты в виде сферических гранул, которые в основе своей представляют полимерную матрицу из регенерированной целлюлозы [2, 5]. Большое количество ОН- групп, с одной стороны, придаёт материалу высокую гидрофильность, обеспечивая биосовместимость и низкий уровень неспецифической адсорбции, с другой, даёт возможность модификации матрицы функциональными группами с высокой плотностью, обеспечивая, тем самым, исключительно высокие емкостные показатели сорбентов. Сорбенты характеризовали величиной полной обменной ёмкости и величиной ёмкости в отношении микроорганизмов [2, 3, 5]. Морфофизиологическую характеристику клеток в образцах проводили с использованием модифицированных для препаратов с сорбентами Сфероцелл электронномикроскопических методов: (1) метода позитивного окрашивания уранилацета-том, позволяющего выявлять клетки лактобацилл и оценивать их физиологическое состояние; (2) метода ультратонких срезов, дающего возможность исследовать внутреннее содержимое клеток и выявлять признаки деструкции клеточных компонентов, а также анализировать характер взаимодействия бактериальных клеток с сорбентом; (3) метода сканирующей электронной микроскопии, необходимого для оценки количества прикрепленных бактериальных клеток к поверхности сорбента и структуры самого сорбента, описанных ранее [2]. Для иммобилизации лактобацилл были отобраны три типа сорбентов: (1) нейтральная, неполярная целлюлозная матрица Сфероцелл, (2) Сфероцелл DEAE (диэтиламиноэтил) - анионит и (3) Сфероцелл КМ (карбоксиметил)- катионит. Иммобилизацию бактериальных клеток проводили в пенициллиновых флаконах с культурой L.plantarum 8PA-3, добавляя бактерии таким образом, чтобы их концентрация составляла 1x109 КОЕ/ мл. Затем в полученную водную суспензию клеток добавляли по 1 мл влажного сорбента (сухой вес 0,05 г.): (1) Сфероцелл, (2) Сфероцелл КМ ПОЕ=0,1 мг-экв/мл и (3) Сфероцелл DEAE ПоЕ=0,1 мг-экв/ мл. Непосредственно после смешивания отбирали из каждой пробирки по 0,1 мл (контроль КОЕ/мл). Время иммобилизации составляло 1 час 30 мин. Каждые 15 мин проводили перемешивание при встряхивании. После завершения иммобилизации пипеткой отделяли надосадоч-ную жидкость от сорбента, определяли КОЕ/мл и фиксировали материал для проведения электронно-микроскопических исследований иммобилизатов. Оценку эффективности иммобилизации и морфофизиологических свойств клеток в иммобилизованном виде проводили также с использованием электронномикроскопических методов [2, 3]. В экспериментах установлено, что рост бактерий является автокаталитическим процессом, регуляция которого при нормальных условиях культивирования (температура, давление, способ аэрации) зависит от наличия питательных веществ и продуктов метаболизма. Накопление метаболитов в среде выращивания и убыль питательных веществ ингибируют рост бактериальных клеток. По-видимому, в результате уменьшения концентрации метаболитов должно увеличиваться время экспоненциальной и линейной фаз роста и как следствие скорость и конечный выход биомассы. В связи с этим при оценке влияния сорбентов Сфероцелл на рост пробиотической культуры клетки L.plantarum 8PA-3 выращивали на МРС бульоне как в присутствии сорбента Сфероцелл КМ или Сфероцелл DEAE, так и без сорбентов. Динамику роста культуры оценивали культуральным методом при высеве аликвот на плотную питательную среду МРС-5 [2]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ В результате проведенных экспериментов установлено что: (1) Наиболее эффективным носите- Рис. 1. Зависимость ёмкости сорбента Сфероцелл DEAE в отношении планктонных клеток L.plantarum 8РА-3 от его полной обменной ёмкости (ПОЕ=0,1 мг-экв/мл). Рис. 2. Динамика роста планктонных клеток L.plantarum 8РА-3 в контроле (1) и в присутствии целлюлозных сорбентов различной ионообменной природы с зарядом «+» (2) и «-» (3). лем для иммобилизации клеток L.plantarum 8РА-3 являлся анионит; ёмкость сорбента по культуре составляла ~0,99x109 КОЕ/мл сорбента при равновесной концентрация клеток в культуральной среде 1x107 КОЕ/мл, т.е. Кр ~100; (2) Между полной обменной ёмкостью (ПОЕ) и величиной логарифма ёмкости сорбента (анионита) в отношении планктонных клеток L.plantarum 8РА-3 (lg КОЕ/мл) существовала линейная зависимость (рис. 1); (3) Выход биомассы в случае культивирования с сорбентом Сфероцелл DEAE превышал контроль и составлял 4-109 КОЕ/мл, а при культивировании клеток в присутствие сорбента Сфероцелл КМ, напротив, конечный выход биомассы уменьшался на порядок 2x108 КОЕ/мл (рис.2). Полученные данные свидетельствуют о том, что природа адсорбционных сил в основном обусловлена кулоновским взаимодействием между компонентами системы. При этом, в случае анионита (« + » заряд на полимере) сорбируются как физиологически активные, несущие « - » заряд, так и покоящиеся клетки. В случае катионита (« - » заряд на сорбенте) живые клетки, несущие нативный отрицательный заряд, не сорбируют- Рис. 3. ТЭМ. Ультратонкий срез. Волокнистая структура гранулы Сфероцелл DEAE с адсорбированной на ее поверхности клеткой L.plantarum 8РА-3. Рис. 4. ТЭМ. Ультратонкий срез группы клеток L.plantarum 8РА-3 на сорбенте Сфероцелл DEAE. ся совсем, однако происходит адсорбция только покоящихся клеток, в результате их поляризации под действием электростатического поля сорбента. Данные электронно-микроскопического исследования позволили не только подтвердить факт адсорбции бактериальных клеток на поверхности анионита, но и установить, что клетки действительно находятся в физиологически активном состоянии, на что указывает: наличие делящихся клеток и особенности ультратонкой организации клеточных компонентов (гомогенная структура цитоплазмы, форма нитей ДНК, а также сохранность всех слоев клеточной стенки). На рис.3 видна волокнистая структура гранулы с адсорбированной на поверхности клеткой L.plantarum 8РА-3, на рис. 4 представлена группа лактобацилл, адсорбированных на гранулах Сфероцелл DEAE. ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что иммобилизованные клетки более устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов: они менее чувствительны к воздействию желудочного сока и желчи и лучше сохраняют жизнеспособность при лиофилизации и хранении препаратов [2, 3, 7] В системе суспензия бактериальных клеток - сорбент имеют место такие же взаимодействия, как в классических системах сорбат - сорбент, основным компонентом взаимодействия в которых является кулоновское [9]. Именно это взаимодействие обусловливает иммобилизацию клеток лактобацилл на гранулах сорбента и связывание (адсорбцию) метаболитов в объеме зерен сорбента [5]. Иммобилизация имеет следствием существенное концентрирование культуры. В отношении метаболитов сорбент выступает в качестве буферной ёмкости, это обстоятельство способствует как существенному увеличению выхода метаболитов, так и собственно биомассы клеток. Сорбция бактериальных клеток на сферических гранулах сорбента, характер распределения клеток по поверхности полисахаридного каркаса и данные электронно-микроскопической картины морфофизиологических свойств иммобилизованных клеток научно обосновывают перспективность использования разработанного сорбента для конструирования иммобилизованных пробиотиков.

About the authors

V. M Bondarenko

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

I. V Larionov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

St. Petersburg, Russia

O. V Rybalchenko

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. Petersburg State University

St. Petersburg, Russia

I. L Potokin

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

St. Petersburg, Russia

A. V Ryzhankova

St. Petersburg State University

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files