Application of immunomagnetic separation for accelerated detection of  F. tularensis  cells in soil samples using an immunochromatographic test

Sergey S. Vetchinin; Ветчинин Сергей Сергеевич; Anton G. Sheviakov; Шевяков Антон Георгиевич; Vera A. Jakovleva; Яковлева Вера Александровна; Raisa I. Mironova; Миронова Раиса Ивановна; Sergey F. Biketov; Бикетов Сергей Федорович

doi:10.36233/0372-9311-348

Application of immunomagnetic separation for accelerated detection of F. tularensis cells in soil samples using an immunochromatographic test

Authors: Vetchinin S.S.¹, Sheviakov A.G.¹, Jakovleva V.A.¹, Mironova R.I.¹, Biketov S.F.¹
Affiliations:
1. State Research Center of Applied Microboilogy and Biotechnology
Issue: Vol 100, No 3 (2023)
Pages: 219-224
Section: SCIENCE AND PRACTICE
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1321
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-348
EDN: https://elibrary.ru/pisplo
ID: 1321

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Epizootological monitoring of the area contamination with the causative agent of tularemia implies the collection and analysis of a variety of field specimens. The analysis of such objects is time- and labour-consuming. In this context, simple and fast diagnostic techniques are needed to analyze specimens under resource-limited conditions.

Aim. To study the possibility of using immunomagnetic separation for accelerated detection of Francisella tularensis cells in soil samples using immunochromatography.

Materials and methods. Immunomagnetic particles (IMPs) were produced by using monoclonal antibodies to lipopolysaccharide (LPS) of the tularemia causative agent. Soil specimens weighing 1 g with preliminary introduced inactivated F. tularensis 15/10 cells were used in the study. The samples were suspended in an extraction buffer (EB) and filtered. Tularemia cells were separated by IMP suspension. The particles were washed, resuspended in EB and heated at 100ºC for 5 minutes. The supernatant was analyzed with test strips based on «F. tularensis IC-test kit».

Results. A combination of the immunomagnetic separation method and the IC test to detect F. tularensis cells identified up to 1 × 10⁶ cells of the tularemia pathogen in analyzed soil samples, while 1 × 10⁷ cells were detected in soil washouts in the absence of immunomagnetic separation.

Conclusion. The developed technique combining immunomagnetic separation and IC tests opens up prospects for express diagnostics of soil sample contamination in tularemia foci. The analysis takes about 3 hours, and its sensitivity is 1 × 10⁶ cells/g of soil. The technique is simple, not requiring sophisticated expensive equipment. It can be easily adapted for testing other specimen types (water, grain, etc.). In addition, separated bacterial cells can be used for F. tularensis detection by other methods.

Keywords

F. tularensis, lateral flow immunochromatographic analysis, immunomagnetic separation

Full Text

Введение

Туляремия — зоонозная природно-очаговая инфекция, вызываемая бактерией Francisella tularensis. Заболевание характеризуется симптомами общей интоксикации, лихорадкой, воспалительными изменениями в области ворот инфекции, регионарным лимфаденитом, склонностью к затяжному течению. Основными резервуарами и источниками возбудителя туляремии в естественных условиях являются дикие птицы и животные (около 50 видов), вода и гидробионты [1]. На территории природных очагов туляремии могут заражаться овцы, свиньи, крупный рогатый скот. Переносчиками инфекции являются клещи, комары, слепни, блохи. Согласно классификации, возбудитель F. tularensis входит во II группу патогенных бактерий (опасных для человека) и относится к наиболее опасным микроорганизмам категории А, способным вызывать массовые заболевания людей (эпидемические вспышки). В связи с этим требуется постоянный мониторинг природных очагов туляремии с применением различных методов контроля.

Детекцию туляремийного антигена согласно МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией» проводят для определения эпизоотии (текущей или прошлой) на исследуемой территории. Инфицирование туляремией происходит при вдыхании пылевого аэрозоля, содержащего живые туляремийные клетки. Пылевой аэрозоль образуется из частиц земли в ходе сельскохозяйственных работ и производства продуктов питания. Заражение почвы туляремийными клетками происходит через помёт хищных птиц, грызунов. Мониторинг объектов внешней среды — один из эффективных способов обнаружить возбудителя туляремии благодаря его устойчивости. Для исследования образцов окружающей среды отбирают погадки и помёт хищных птиц, кровососущих насекомых (после гомогенизации и экстрагирования), пробы воды и ила из водоёмов, гнёзда вместе с почвой и другие объекты, загрязнённые выделениями грызунов. Исследование образцов, представляющих собой сложные матрицы (например, почва), методами иммунодиагностики требует извлечения бактериальных клеток из смеси с другими микроорганизмами и компонентами субстрата, затрудняющими проведение анализа.

В состав перечня диагностических тест-систем для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней санитарной службы РФ утверждён набор реагентов для иммунохроматографического (ИХ) экспресс-теста для выявления и идентификации возбудителя туляремии «ИХ-тест F. tularensis» (ФСР 2009/05486, ТУ 9398-092-78095326-2000¹). ИХ-тест разработан на основе высокоспецифичных моноклональных антител (МКА) [2]. В частности, применение этой ИХ-тест-системы для экспресс-выявления туляремийного микроба при проведении мониторинга природных очагов Северного Кавказа показало её высокую специфичность. У всех 69 штаммов F. tularensis, выделенных из клещей, наблюдали формирование полосы в тестовой зоне. Чувствительность составила 1 × 10⁷ микробных клеток/мл [3].

В качестве одного из подходов для увеличения чувствительности диагностики инфекционных агентов и их маркеров в исследуемых образцах может использоваться этап концентрирования с применением иммуномагнитных частиц (ИМЧ), в частности, в таких методах диагностики, как иммуноферментный анализ [4–7], иммунохроматография [8], изотермическая амплификация [9], полимеразная цепная реакция [10].

Цель настоящей работы — изучить возможность применения иммуномагнитной сепарации для ускоренной детекции клеток F. tularensis в образцах почвы с использованием ИХ.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

Вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15/10 НИИЭГ (штамм В-4341) был получен из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Условия культивирования

Культивирование и инактивацию штамма F. tularensis subsp. holarctica 15/10 НИИЭГ проводили по описанной ранее методике [11] в соответствии с санитарными правилами².

Наработка моноклональных антител к возбудителю туляремии

Для наработки МКА к липополисахариду F. tularensis гибридому 3F5 [11] выращивали in vitro в культуральных флаконах Т-75 («TPP») на среде RPMI-1640 («Gibco») с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («HyClone») при 37^оС и 5% СО₂. После 4–6 сут роста культуральную жидкость с клетками гибридом центрифугировали при 500g в течение 5 мин, осевшие клетки ресуспендировали в стерильном 0,9% растворе NaCl до концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл и вводили по 1,0 мл внутрибрюшинно мышам линии BALB/c.

Мышам за 21 сут внутрибрюшинно вводили 0,5 мл пристана («Sigma-Aldrich»). Через 7–10 сут после инъекции суспензии гибридом у мышей собирали асцитную жидкость, содержащую МКА. Клетки из асцитной жидкости удаляли центрифугированием при 1000g в течение 15 мин. Супернатант смешивали в соотношении 1 : 4 с 0,1 М фосфатным буферным раствором pH 8,6, фильтровали через полиэфирсульфоновый фильтр с диаметром пор 0,22 мкм («TPP»).

МКА очищали с помощью аффинной хроматографии на хроматографической колонке с белок А-сефарозой «MabSelectA» («Cytiva»). Колонку предварительно уравновешивали фосфатным буферным раствором, затем пропускали разведение асцита со скоростью 0,5 мл/мин. Связавшиеся иммуноглобулины элюировали 0,1 М натрий-цитратным буферным раствором pH 3,0 и гель-фильтрационной хроматографией на колонке с сефадекс G-25 («Cytiva») переводили в фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) pH 7,4. Концентрацию полученных иммуноглобулинов определяли на спектрофотометре «DS-11» («DeNovix»).

Получение иммуномагнитных частиц

Для получения ИМЧ с МКА 3F5 использовали карбоксилированные магнитные частицы («MagSphere»). Карбоксильные группы активировали карбодиимидным методом с использованием 10 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 20 мМ N-гидроксисукцинимида («Sigma») в 0,1 М морфолиноэтансульфоновом буферном растворе pH 5,0 c 0,05% Tвин-20 (MEST). Активацию магнитных частиц проводили при комнатной температуре с постоянным перемешиванием в течение 40 мин. После промывки на магнитном штативе к частицам добавляли раствор МКА 3F5 в MEST. Конъюгирование проводили в течение 90 мин при постоянном перемешивании. Оставшиеся реакционно-способные группы частиц инактивировали добавлением 1% раствора альбумина. Готовую суспензию ИМЧ промывали и переводили в ФСБ с 0,1% Triton X-100 и 0,01% азида натрия (ФСБ-Т).

Подбор оптимальных условий иммуномагнитной сепарации

В ФСБ-Т готовили суспензии инактивированных клеток вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с концентрациями 1 × 10⁵–1 × 10⁸ микробных клеток в 10 мл. В суспензии микробных клеток вносили по 10 или 20 мкл 2,5% суспензии ИМЧ. Время инкубирования для каждой концентрации микробных клеток и ИМЧ составляло 30 и 60 мин. После инкубирования ИМЧ осаждали в магнитном штативе. Далее частицы ресуспендировали в 100 мкл 0,1 М цитратного буферного раствора pH 3,0 или ФСБ-Т и прогревали при 100°С в течение 5 мин. Затем частицы осаждали на магнитном штативе, полученный супернатант анализировали в ИХ-тесте, для цитратного буферного раствора предварительно доводили pH до 7,0. В качестве отрицательного контроля использовали образцы до инкубации с ИМЧ.

Пробоподготовка образца почвы

Для исследования использовали суглинистую почву, имитирующую образец гнезда грызунов, контаминированного туляремийными бактериями. В навески почвы массой 1 г добавляли по 100 мкл инактивированных мертиолятом натрия клеток вакцинного штамма F. tularensis 15/10 в количестве 1 × 10⁵–1 × 10⁸микробных клеток и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Экстрагирование микробных клеток проводили двумя буферными растворами: ЭБ1 — ФСБ с добавлением 0,05% Tвин-20, ЭБ2 — 50 мМ фосфатный буферный раствор pH 7,4 с 0,5 М хлорида натрия и 1% Triton Х-100. Образцы почвы перемешивали в течение 30 мин с 9 мл каждого экстрагирующего буфера, отстаивали в течение 10 мин, супернатант фильтровали последовательно через ватный тампон и фильтровальную бумагу, предварительно смоченные ЭБ1/ЭБ2. Конечный объём фильтратов доводили до 10 мл, промывая фильтры. К полученному фильтрату добавляли 20 мкл 0,25% суспензии ИМЧ и инкубировали с перемешиванием в течение 30 мин.

Постановка ИХ-теста

Для постановки ИХ-теста использовали тесты в формате дипстик на основе «ИХ-тест F. tularensis» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск). Тест-полоски помещали в лунки 96-луночного планшета, содержащие по 100 мкл исследуемых образцов. Тестирование проводили в 5 повторах для каждой концентрации микробных клеток. Результат оценивали через 15 мин визуально.

Результаты

Исследование перспектив использования ИХ-теста в полевых условиях на примере модельной тест-системы для анализа образцов почвы, контаминированных клетками F. tularensis, заключается в решении следующих задач: конъюгирование магнитных частиц с МКА и подбор оптимального количества ИМЧ для сепарации, условия экстракции клеток F. tularensis из образцов почвы, снятия бактериальных клеток с ИМЧ после сепарации.

Магнитные частицы со свободными карбоксильными группами конъюгировали с МКА к липополисахариду F. tularensis 3F5 карбодиимидным методом. Для полученных ИМЧ оптимальное их количество составило 20 мкл 0,25% суспензии при сепарации клеток из 10 мл фильтрата и оптимальном времени инкубации 30 мин. Увеличение времени инкубирования образцов с ИМЧ до 60 мин не влияло на результаты ИХ-теста. Уменьшение количества ИМЧ до 10 мкл 2,5% суспензии снижало чувствительность при визуальной регистрации результатов ИХ-теста.

Проверка клеток после сепарации из фильтрата с использованием для экстракции буферного раствора ЭБ1 продемонстрировала появление фоновой реакции в виде коричневатых полос в тестовой зоне как в опыте, так и в отрицательном контроле. Замена детергента Tвин-20 на Triton X-100 и увеличение ионной силы буферного раствора в ЭБ2 привели к устранению неспецифической реакции в тестовой зоне (рис. 1).

Рис. 1. Результаты ИХ-тестирования после иммуномагнитной сепарации клеток F. tularensis из образцов почвы в ЭБ1 (а) и ЭБ2 (б). 1 — 1 × 10⁷ клеток на 1 г почвы; 2 — отрицательный контроль; К — контрольная зона; Т — тестовая зона. / Fig. 1. The results of IC test after immunomagnetic separation of F. tularensis cells from soil samples in EB1 (а) and EB2 (b). 1 — 1 × 10⁷ microbial cells per 1 g of soil; 2 — negative control; С — control zone; T — test zone.

Элюцию бактериальных клеток с ИМЧ после сепарации проводили в цитратном буферном растворе pH 3,0 или в ЭБ2 при 100ºС. Оптимальное время полного снятия бактериальных клеток с магнитных частиц при кипячении в исследованных буферных растворах составляло 5 мин. Увеличение времени кипячения не влияло на чувствительность теста. Однако при элюции кислым буферным раствором необходимо доводить pH до нейтрального, что увеличивает время анализа. В связи с этим для дальнейшей работы выбрана методика прогрева в ЭБ2.

На рис. 2 представлены результаты ИХ-теста образцов почвы с различным содержанием клеток F. tularensis. Предел обнаружения при визуальном анализе для ИХ-теста после иммуномагнитной сепарации составил 1 × 10⁶ микробных клеток на 1 г образца почвы, в то время как в фильтрате до сепарации — 1 × 10⁷ микробных клеток.

Рис. 2. Результат ИХ-тестирования фильтрата образцов почвы до (а) и после (б) иммуномагнитной сепарации клеток F. tularensis. 1 — 1 × 10⁸м.к.; 2 — 1 × 10⁷ м.к.; 3 — 1 × 10⁶ м.к.; 4 — 1 × 10⁵ м.к. — количество микробных клеток в 1 г почвы; К — контрольная зона; Т — тестовая зона. / Fig. 2. The result of IC test of the filtrate of soil samples before (а) and after (b) immunomagnetic separation of F. tularensis cells. 1 — 1 × 10⁸ m.c.; 2 — 1 × 10⁷ m.c.; 3 — 1 × 10⁶ m.c.; 4 — 1 × 10⁵ m.c. — the number of microbial cells in 1 g of soil; С — control zone; T — test zone.

Обсуждение

На основе полученных результатов при исследовании образцов почвы, содержащей клетки F. tularensis, предложена методика комбинирования иммуномагнитной сепарации и ИХ-тестирования. Методика не требует сложного приборного обеспечения и позволяет проводить мониторинг возбудителя туляремии непосредственно в природном очаге. Время проведения анализа образцов не превышает 3 ч. Полученная при исследовании чувствительность определения возбудителя составляет 1 × 10⁶микробных клеток в 1 г образца почвы, что коррелирует с чувствительностью коммерческих [12] и модельных [13] ИХ-тест-систем, полученных на клетках возбудителя туляремии. Кроме того, полученные после сепарации ИМЧ с бактериальными клетками могут быть переданы для детекции F. tularensis другими методами, в частности иммуноферментным анализом и методом петлевой изотермической амплификации.

Заключение

Подобраны оптимальные условия использования иммуномагнитной сепарации для ускоренной диагностики F. tularensis в контаминированных образцах почвы с помощью ИХ-теста. Предлагаемая методика проста, не требует сложного дорогостоящего оборудования, может быть легко адаптирована для тестирования образцов различного происхождения (вода, зерно и т.д.) и, несомненно, окажется полезной при проведении эпизоотологического обследования природных очагов. Кроме того, методика может быть использована для определения липополисахарида в клинических образцах при диагностике заболевания туляремией [14].

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

¹ Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: Методические указания МУК 4.2.2939–11. М.; 2012. 59 с.

² Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 № 4 (ред. от 25.05.2022) «Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней"».