Активность факторов периферической крови против Candida albicans

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Колонизация разных биотопов человека дрожжеподобными грибами рода Candida встречается достаточно часто. При этом клиническая картина воспалительного процесса развивается не в каждом случае, что предполагает формирование уникального симбиоза между микроскопическим грибами и клетками организма человека, поддержание которого во многом зависит от активности иммунной системы. Основная масса исследований противогрибковой активности иммунной системы человека сконцентрирована вокруг патологических состояний, и практически не уделяется внимания таковой у здоровых лиц. Показано, что факторы иммунитета человека могут, с одной стороны, способствовать формированию биоплёнок C. albicans, а с другой стороны — принимают самое активное участие в их разрушении.

Цель исследования — изучение кандидацидной, антибиоплёночной, фагоцитарной и радикалпродуцирующей активности периферической крови здоровых доноров при использовании в качестве объекта клеток C. albicans.

Материалы и методы. От 32 практически здоровых доноров получали пробы периферической крови, изучали микоцидную активность, поглотительную и радикалпродуцирующую способность лейкоцитов, а также эффект сыворотки крови на биомассу плёнки. Для опсонизации клеток C. albicans использовали иммуноглобулины класса G (IgG) согласно апробированной ранее методике.

Результаты. Показана слабая микоцидная активность периферической крови здоровых доноров. Опсонизация C. albicans IgG существенно повышает эту функцию крови. В ранней фазе контакта с C. albicans дрожжеподобные клетки поглощают главным образом нейтрофильные лейкоциты, а мононуклеарные лейкоциты практически не участвуют в процессе фагоцитоза. Вероятно, их активность проявляется в более поздний период. Опсонизация C. albicans стимулирует поглотительную активность лейкоцитов, что отражается в увеличении среднего числа поглощённых объектов на один лейкоцит. Показано, что опсонины могут участвовать в усилении радикалпродуцирующей активности лейкоцитов. Так, инактивация белков системы комплемента нивелирует стимулирующий эффект опсонизации C. albicans.

Заключение. Таким образом, IgG и белки системы комплемента вносят существенный вклад в подавление патогенной активности C. albicans.

Полный текст

Введение

У клинически здоровых лиц достаточно часто выявляется носительство Candida spp.: в орофарингеальной зоне — у 20–30% добровольцев, в тонком кишечнике — у 50–54%, в толстом кишечнике — у 55–70%, в фекалиях — у 65–70% [1]. Такая ситуация отчасти может быть обусловлена способностью грибов подавлять антагонистическую активность облигатной микробиоты слизистых оболочек человека. Показано, что C. albicans участвует в формировании сложноорганизованных микробных сообществ, в составе которых изменяются свойства этого микроорганизма. Известно, что частота встречаемости C. albicans в пристеночном муцине слепой кишки в 2 раза больше в присутствии Staphylococcus aureus, чем без него [1].

Среди факторов патогенности C. albicans следует выделить способность формировать биоплёнки [2]. Установлено, что применение антимикотических препаратов не приводит к полной гибели биоплёночных клеток C. albicans. Показано, что в случае использования нистатина в биоплёнке выживает около 30% клеток C. albicans [3].

Известно, что при разных клинических ситуациях C. albicans оказывает супрессивное влияние на иммунокомпетентные клетки. Это может быть обусловлено способностью некоторых представителей рода Candida активировать протеолиз компонентов иммунитета [4]. Метаболиты Candida spp. замедляют созревание фаголизосом и продукцию оксида азота макрофагами [5]. Активация TLR2, опосредованная Candida spp., индуцирует сигналы, поддерживающие толегогенный профиль дендритных клеток [6]. Однако при определённых условиях наблюдается состояние комменсализма, когда иммунные факторы сдерживают развитие инфекции. Так, J.C. Oliver и соавт. [7] установлено, что ведущая роль в сдерживании популяции Candida spp. отводится фагоцитирующим клеткам. В исследованиях S.G. Nanjappa и соавт. [8] показано, что CD8+-Тклетки памяти реализуют резистентность к Candida spp. даже при отсутствии влияния со стороны CD4+Т-клеток.

Моноциты являются ключевыми клетками врождённого иммунитета, формирующими ответ на инфицирование C. albicans [9]. Однако в исследованиях J. Chandra и соавт. [10] приводятся сведения, что в присутствии фракции моноцитов у грибов увеличивается биоплёнкообразующая активность, что не описано для нейтрофильных гранулоцитов, которые обладают более выраженным токсическим потенциалом в первую очередь за счёт более выраженной продукции активных форм кислорода [11]. С другой стороны, антителозависимая активация белков системы комплемента может оказать эффект по элиминации биоплёнок, сформированных грибами Candida spp. [12]. В то же время уровень специфических иммуноглобулинов класса М к маннану в крови инфицированных C. albicans пациентов не отличается от такового у здоровых лиц, а уровень специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) к маннану существенно выше, чем у лиц группы сравнения [13]. Более того, при инфицировании C. albicans концентрация специфических IgG в моче и бронхоальвеолярной жидкости существенно повышается [13]. В доступной литературе отсутствуют комплексные сведения о противогрибковой активности факторов периферической крови здоровых лиц.

Цель исследования — изучение кандидацидной, антибиоплёночной, фагоцитарной и радикалпродуцирующей активности периферической крови здоровых доноров при использовании в качестве объекта клеток C. albicans.

Материалы и методы

Исследования проведены с использованием проб периферической крови 32 практически здоровых доноров, которые дали добровольное согласие на использование образцов крови. Для оценки микоцидной активности крови пробы делили на 3 порции. В первую порцию вносили тест-штамм C. albicans ATCC 10231 и сразу же осуществляли посев на среду Сабуро. Во вторую порцию инокулировали опсонизированные, а в третью — неопсонизированные грибы. Опсонизацию осуществляли согласно ранее апробированной методике [14] с использованием коммерческого препарата «Октогам», содержащего IgG с широким спектром специфических иммуноглобулинов против разных микроорганизмов. Рабочая концентрация препарата по IgG составила 20 мг/мл [15]. В отдельной серии исследований для опсонизации применяли свежеполученную и прогретую при 56ºС пулированную сыворотку, что позволяет оценить вклад компонентов системы комплемента. Опсонизацию микроорганизмов осуществляли в течение 1 ч при 37ºС. Пробы с опсонизированными и неопсонизированными C. albicans инкубировали 3 ч при 37ºС. Посев образцов для подсчёта выросших колоний выполняли на среду Сабуро. В качестве дополнительного контроля использовали пробы, куда вместо крови вносили питательную среду и неопсонизированные или опсонизированные клетки C. albicans.

Биоплёнки C. albicans выращивали в плоскодонных полистироловых планшетах в течение 24 ч при 37ºC в бульоне Сабуро. После этого удаляли питательный бульон и промывали планшеты забуференным физиологическим раствором. На плёнки наносили цельную кровь или свежеполученную сыворотку на 1 ч, инкубацию осуществляли в термостате при 37ºC. В контрольные пробы вносили равный объём питательного бульона. Толщину массы биоплёнок оценивали по методу O’Toole [16] после их окраски генцианвиолетом с последующей экстракцией красителя спиртом и учётом оптической плотности на планшетном фотометре «PowerWave X».

При изучении поглотительной активности лейкоцитов все пробы периферической крови делили на две порции. В 1-ю порцию вносили опсонизированные клетки C. albicans, во 2-ю — неопсонизированные микроорганизмы. Сущность метода аналогична таковому, как описано в работе [17], за исключением того, что в качестве объекта фагоцитоза выбраны клетки C. albicans. Оценку числа фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов проводили на микропрепаратах, окрашенных по методу Романовского–Гимзе. В каждом препарате учитывали не менее 200 фагоцитирующих клеток. Рассчитывали долю фагоцитирующих клеток каждого типа, фагоцитарное число (среднее число C. albicans, приходящееся на 1 фагоцитирующую клетку), а также абсолютные показатели фагоцитарной активности клеток.

Для определения радикалпродуцирующей активности лейкоцитов при постановке реакции люминолзависимой хемилюминесценции в стимулированном варианте в лунках планшета («Corning Inc. Costar») смешивали лейкоциты (25 × 106/мл) и взвесь тест-штамма C. albicans. В контрольные пробы вместо тест-штамма вносили равный объём раствора Хенкса. Измерение проводили на люминометре («Thermo Labsystems»). Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминесценции за весь период измерения (integral, RLU) [18].

Статистический анализ осуществляли с помощью программного пакета «Statistica 6.0». Данные представлены в виде средней арифметической величины (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Для проверки нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка. В случае распределения, приближенного к нормальному, использовали критерий Стьюдента, в остальных — критерий Манна–Уитни. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Опсонизация C. albicans комплексным препаратом IgG статистически значимо не меняла число жизнеспособных клеток. Выявлена тенденция снижения числа жизнеспособных неопсонизированных C. albicans после контакта с кровью c 237 ± 141 КОЕ в начальный момент контакта, до 65 ± 28 КОЕ через 180 минут (p > 0,05). Опсонизация C. albicans IgG увеличивала микоцидную активность крови (число живых клеток снижалось до 22 ± 12 КОЕ; p < 0,05).

C. albicans формировали достаточно выраженную биоплёнку — 0,411 ± 0,064 усл. ед. Обработка такой плёнки цельной кровью существенно уменьшала её толщину (0,270 ± 0,028 усл. ед.; p < 0,05). При использовании свежеполученной сыворотки крови биоплёнка C. albicans разрушалась практически полностью (0,117 ± 0,006 усл. ед.; p < 0,05).

При оценке поглотительной активности лейкоцитов установлено её существенное усиление при опсонизации объектов фагоцитоза с помощью IgG (рисунок). При этом количество активно поглощающих лейкоцитов было в 15 раз больше, чем в пробах с неопсонизированными C. albicans. Изменения поглотительной активности лейкоцитов затрагивают преимущественно таковую среди нейтрофилов. Опсонизация C. albicans IgG существенно не меняет число фагоцитирующих моноцитов.

Относительное число фагоцитирующих C. albicans лейкоцитов (а) и фагоцитарное число лейкоцитов (б). Светлые столбики — неопсонизированные C. albicans, тёмные — опсонизированные C. albicans

Relative number of leukocytes phagocytosing C. albicans (a) and number of phagocytic leukocytes (b). White bars — non-opsonized C. albicans; dark bars — opsonized C. albicans.

 

При оценке радикалпродуцирующей активности лейкоцитов установлено, что клетки C. albicans стимулируют «респираторный взрыв» лейкоцитов (1374,4 ± 327,0 RLU; в нестимулированных пробах — 213,6 ± 19,3 RLU; p < 0,05). В случае опсонизации C. albicans свежеполученной сывороткой крови этот эффект существенно усиливался (2758,1 ± 646,9 RLU; p < 0,05 по сравнению с показателями проб с неопсонизированными клетками). Предварительное прогревание сыворотки при 56ºС нивелировало стимулирующий эффект до уровня, аналогичного таковому в пробах с неопсонизированными C. albicans (1716,7 ± 444,8 RLU; p > 0,05 по сравнению с показателями проб с неопсонизированными грибами).

Известно, что развитие кандидозной инфекции во многом определяется состоянием баланса между факторами патогенности C. albicans и реактивностью макроорганизма. Как показано в настоящем исследовании, гуморальные факторы иммунитета играют существенную роль в подавлении жизнедеятельности C. albicans. Например, IgG, повышая специфичность распознавания дрожжеподобных грибов фагоцитирующими лейкоцитами, увеличивают их поглотительную активность. Компоненты системы комплемента оказывают деструктивное действие на биоплёнки C. albicans и участвуют в инициации генерации гидроксильных радикалов лейкоцитами. Кроме того, сыворотка крови содержит ряд пептидов, оказывающих негативное влияние на стенку дрожжевых клеток, трансляцию белка и т.д. [19]. В целом повсеместное распространение Candida spp., широкая представленность сходных внутриродовых антигенов придают иммунному ответу ряд отличительных черт, среди которых отдельно следует выделить накопление естественных антител. Такая ситуация обеспечивает при очередном контакте с грибами более быстрые их распознавание и элиминацию [20]. С другой стороны, согласно данным литературы, активность системы комплемента и количество иммуноглобулинов зависят от многих факторов, среди которых не последнее место занимают адекватный белковый рацион [21], заболевания печени и некоторые другие [22].

Выявленное в настоящем исследовании изменение поглотительной активности преимущественно нейтрофильных лейкоцитов может быть обусловлено тем, что мононуклеарные клетки зависят от опсонизации в меньшей степени [23]. Мононуклеарные лейкоциты активно фагоцитируют нейтрофилы, вступившие в апоптоз [24], что позволяет предположить отсроченное развитие изменений их фагоцитарной активности.

Заключение

Таким образом, вероятно, что преимущественную роль в сдерживании C. albicans, снижении их колонизационной активности играют гуморальные факторы иммунной системы хозяина, способные диффундировать через слизистые оболочки. Кроме этого, фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов, усиленная иммуноглобулинами, вносит не менее существенный вклад в подавление патогенной активности C. albicans.

×

Об авторах

А. П. Годовалов

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Автор, ответственный за переписку.
Email: agodovalov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5112-2003

Годовалов Анатолий Петрович — к.м.н., в.н.с. Центральной
научно-исследовательской лаборатории, доцент кафедры микробиологии с курсом вирусологии

Пермь

Россия

И. А. Боев

Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9682-7680

Боев Иосиф Александрович — стоматолог-хирург Клинической
стоматологической больницы

Россия

Список литературы

  1. Несвижский Ю.В., Волчкова Е.В., Филина Ю.С., Богданова Е.А., Умбетова К.Т., Пак С.Г. Разработка комплексного подхода к терапии инфекции, вызванной грибами рода Candida. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 20(1): 27–31.
  2. Gulati M., Nobile C.J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 2016; 18(5): 310–21. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2016.01.002
  3. Чеботарь И.В., Паршиков В.В. Исследование действия антимикотических препаратов на биопленки, сформированные грибами рода Candida. Акушерство и гинекология. 2013; (5): 98–102.
  4. Valand N., Girija U.V. Candida pathogenicity and interplay with the immune system. Adv. Exp. Med. Biol. 2021; 1313: 241–72. https://doi.org/10.1007/978-3-030-67452-6_11
  5. Slesiona S., Gressler M., Mihlan M., Zaehle C., Schaller M., Barz D., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 2012; 7(2): e31223. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0031223
  6. Dillon S., Agrawal S., Banerjee K., Letterio J., Denning T.L., Oswald-Richter K., et al. Yeast zymosan, a stimulus for TLR2 and dectin-1, induces regulatory antigen-presenting cells and immunological tolerance. J. Clin. Invest. 2006; 116(4): 916–28. https://doi.org/10.1172/JCI27203
  7. Oliver J.C., Ferreira C.B.R.J., Silva N.C., Dias A.L.T. Candida spp. and phagocytosis: multiple evasion mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 2019; 112(10): 1409–23. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01271-x
  8. Nanjappa S.G., McDermott A.J., Fites J.S., Galles K., Wüthrich M., Deepe G.S. Jr., et al. Antifungal Tc17 cells are durable and stable, persisting as long-lasting vaccine memory without plasticity towards IFNγ cells. PLoS Pathog. 2017; 13(5): e1006356. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006356
  9. Lionakis M.S. New insights into innate immune control of systemic candidiasis. Med. Mycol. 2014; 52(6): 555–64. https://doi.org/10.1093/mmy/myu029
  10. Chandra J., McCormick T.S., Imamura Y., Mukherjee P.K., Ghannoum M.A. Interaction of Candida albicans with adherent human peripheral blood mononuclear cells increases C. albicans biofilm formation and results in differential expression of pro- and anti-inflammatory cytokines. Infect. Immun. 2007; 75(5): 2612–20. https://doi.org/10.1128/IAI.01841-06
  11. Arce Miranda J.E., Baronetti J.L., Sotomayor C.E., Paraje M.G. Oxidative and nitrosative stress responses during macrophage-Candida albicans biofilm interaction. Med. Mycol. 2019; 57(1): 101–13. https://doi.org/10.1093/mmy/myx143
  12. Chupácová J., Borghi E., Morace G., Los A., Bujdáková H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathog. Dis. 2018; 76(1). https://doi.org/10.1093/femspd/ftx127
  13. Wang K., Luo Y., Zhang W., Xie S., Yan P., Liu Y., et al. Diagnostic value of Candida mannan antigen and anti-mannan IgG and IgM antibodies for Candida infection. Mycoses. 2020; 63(2): 181–8. https://doi.org/10.1111/myc.13035
  14. Шестакова А.В., Кадыралиев Б.К., Годовалов А.П., Быкова Л.П. Опсонизация Candida albicans иммуноглобулином для внутривенного введения. Медицинская иммунология. 2015; (S): 434.
  15. Дерябин Д.Г., Каримов И.Ф. Особенности реагирования рекомбинантных люминесцирующих бактерий с различными Lux-оперонами в фагоцитарной системе. Вестник Оренбургского государственного университета. 2007; (12): 4–7.
  16. O’Toole G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J. Vis. Exp. 2011; 47(4): 2437. https://doi.org/10.3791/2437
  17. Shilov J.I., Orlova E.G. Role of adrenergic mechanisms in regulation of phagocytic cell functions in acute stress response. Immunol. Lett. 2003; 86(3): 229–33. https://doi.org/10.1016/S0165-2478(03)00027-0
  18. Шилов С.Ю., Шилов Ю.И., Барков С.Ю. Влияние дегидроэпианростерона на показатели люминолзависимой хемилюминисценции при зимозановом перитоните у старых крыс. Российский иммунологический журнал. 2017; 11(3): 570–2.
  19. Арзуманян В.Г., Артемьева Т.А., Иксанова А.М. Противогрибковая активность сыворотки крови человека и некоторых млекопитающих. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 96(1): 17-22. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-17-22
  20. Шаталова Е.В., Парахина О.В. Выраженность гуморального иммунного ответа у иммуносупрессированных животных в условиях кандида-бактериальной инфекции. Аллергология и иммунология. 2016; 17(1): 69.
  21. Amaral J.F., Foschetti D.A., Assis F.A., Menezes J.S., Vaz N.M., Faria A.M. Immunoglobulin production is impaired in protein-deprived mice and can be restored by dietary protein supplementation. Braz. J. Med. Biol. Res. 2006; 39(12): 1581–6. https://doi.org/10.1590/S0100-879X2006001200009
  22. Unsworth D.J. Complement deficiency and disease. J. Clin. Pathol. 2008; 61(9): 1013–7. https://doi.org/10.1136/jcp.2008.056317
  23. Czop J.K., Fearon D.T., Austen K.F. Opsonin-independent phagocytosis of activators of the alternative complement pathway by human monocytes. J. Immunol. 1978; 120(4): 1132–8.
  24. Liddiard K., Rosas M., Davies L.C., Jones S.A., Taylor P.R. Macrophage heterogeneity and acute inflammation. Eur. J. Immunol. 2011; 41(9): 2503–8. https://doi.org/10.1002/eji.201141743

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Относительное число фагоцитирующих C. albicans лейкоцитов (а) и фагоцитарное число лейкоцитов (б). Светлые столбики — неопсонизированные C. albicans, тёмные — опсонизированные C. albicans

Скачать (14KB)
Метаданные

© Годовалов А.П., Боев И.А., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах