Identification of Vibrio cholerae O1 strains of the El Tor biovar sensitive to polymyxin B and their molecular genetic analysis

Full Text

Введение

Возбудителями холеры, острой инфекционной болезни с диарейным синдромом, распространяющейся в виде эпидемий и пандемий, являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы (классического и El Tor биоваров) и О139 серогруппы. Штаммы V. cholerae О1 классического биовара предположительно были причиной первых 6 опустошительных пандемий. В 1961 г. началась 7-я пандемия, обусловленная типичными токсигенными штаммами V. cholerae О1 El Tor биовара [1]. Вибрионы О139 серогруппы, явившиеся производными El Tor вибрионов и вызвавшие ряд тяжёлых эпидемий в 1992–1994 гг., в настоящее время не имеют эпидемиологической значимости. Классические вибрионы, продуцируя повышенное количество холерного токсина, ответственного за развитие диареи, вызывают более тяжёлую форму холеры, в отличие от El Tor вибрионов, но последние лучше выживают во внешней среде. В 1990-х гг. было зафиксировано появление генетически изменённых штаммов (геновариантов) V. cholerae О1 El Tor биовара с повышенной вирулентностью, которые в результате горизонтального переноса приобрели гены классических вибрионов. Данные штаммы содержали в опероне ctxAB, кодирующем биосинтез холерного токсина, ген ctxB холерных вибрионов классического биовара (аллель ctxB1). Дальнейшие эволюционные преобразования геновариантов привели к появлению штаммов с новой аллелью гена ctxB — ctxB7, а также изменённой структурой других генов патогенности и пандемичности. Геноварианты очень быстро вытеснили типичные штаммы на эндемичной территории и вызвали ряд крупных эпидемий в разных странах мира [2][3]. Начиная с 1993 г. все вспышки и единичные случаи холеры на территории России также были вызваны генетически изменёнными штаммами V. cholerae О1 El Tor биовара. Молекулярно-генетические свойства завезённых в Россию геновариантов изучены достаточно подробно. Многие штаммы секвенированы и депонированы в базе данных NCBI GenBank [4–9].

Холерные вибрионы классического и El Tor биоваров, несмотря на принадлежность к одной О1 серогруппе, отличаются по фенотипическим свойствам, которые используются для дифференциации биоваров. При определении биовара исследуют чувствительность к холерным диагностическим фагам (классическому и El Tor), способность расти на средах с добавлением 50 мкг/мл полимиксина В, агглютинировать куриные эритроциты, образовывать ацетилметилкарбинол в реакции Фогес–Проскауэра. Штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара, в отличие от классических вибрионов, чувствительны к диагностическому холерному фагу El Tor, агглютинируют куриные эритроциты, устойчивы к полимиксину В (PolB^R) и образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес–Проскауэра [1]. При этом признак устойчивости El Tor вибрионов к полимиксину В долгое время оставался одним из стабильных диагностически значимых тестов. Однако в Индии в 2012 г. впервые за всю историю 7-й пандемии холеры были выделены чувствительные к полимиксину В (PolB^S) штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара. Начиная с 2014 г. практически все циркулирующие на данной территории штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара были PolB^S [10][11]. Чувствительные к полимиксину В штаммы V. cholerae не только быстро распространились в Индии, но и были занесены в другие страны Азии и в Африку. Так, крупнейшая эпидемия холеры в Йемене (более 1 млн заболевших) в 2016–2018 гг., охватившая все области страны, была вызвана PolB^S штаммами V. cholerae О1 El Tor. Данные штаммы также явились причиной вспышки холеры в Кении в 2015–2017 гг. [11–14].

Устойчивость штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара к полимиксину В обеспечивается участием продуктов 12 генов: almGFE (VC1577-VC1579), vexB (VC0164), msbB/lpxN (VC0212), gspIFE (VC2728, 2731, 2732), VC0224, lpxL (VC0213), carR^S/vprAB (VC1320, VC1319) [15–19]. При этом важный механизм резистентности к данному антибиотику связан с уменьшением отрицательного заряда липополисахарида внешней мембраны в результате его модификации (аминоацелирование и глицилирование). Глицилирование липополисахарида (присоединение глицина или диглицина) происходит при участии продуктов генов almEFG оперона. В результате данного процесса катионный антибиотик полимиксин В теряет способность связываться с липополисахаридным слоем клеток штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара. В свою очередь транскрипция генов almEFG оперона положительно регулируется белками двухкомпонентной carR^S (или vprAB) системы, включающей сенсорный белок Car^S (VprA) и ДНК-связывающийся регуляторный белок CarR (VprB) [18][19]. Необходимо отметить, что система carR^S не только контролирует транскрипцию генов almEFG оперона, но и является негативным регулятором процесса формирования биоплёнки. Белок CarR репрессирует экспрессию генов vps, ответственных за продукцию важного компонента биопленки — экзополисахарида [20].

При проведении молекулярно-генетического исследования PolB^S штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара было установлено, что они, в отличие от штаммов классического биовара, имеют иной механизм появления чувствительности к полимиксину В. В штаммах V. cholerae О1 классического биовара изменена структура гена almF, в то же время отличительной особенностью PolB^S штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара является наличие единичной замены гуанина на аденин в позиции 265 в гене carR (аллель carR^S). PolB^S штаммы El Tor биовара, содержащие аллель carR^S, синтезируют белок CarR со сниженной транскрипционной активностью, что приводит к уменьшению экспрессии almEFG оперона и снижению процесса модификации липополисахарида клеточной стенки [10][21].

Таким образом, в современный период 7-й пандемии холеры на эндемичной территории появились и распространяются высоковирулентные штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара с изменённым диагностически значимым признаком — чувствительные к полимиксину В, что диктует необходимость детального изучения их патогенных и адаптивных свойств.

Учитывая нестабильную эпидемиологическую ситуацию по холере в мире и возможность завоза высоковирулентных штаммов возбудителя холеры в нашу страну, цель работы состояла в выявлении и молекулярно-генетической характеристике чувствительных к полимиксину В штаммов V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара, выделенных на территории России.

Материалы и методы

В работе было использовано 56 штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара, изолированных от людей или из открытых водоёмов на территории России, из которых 10 являются типичными токсигенными изолятами (1970–1990 гг.), 21 — токсигенными генетически изменёнными (1993–2014 гг.) и 25 — нетоксигенными (2012–2020 гг.) штаммами. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Чувствительность штаммов к полимиксину В («Sigma») определяли в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.2218-07 (2007), культивируя их при 37^оС на пластинках питательного LB агара (рН 7,2) с добавлением антибиотика из расчёта 50 мкг на 1 мл среды. В качестве отрицательного контроля использовали штамм V. cholerae 569В О1 серогруппы классического биовара (Индия, 1950).

Способность штаммов к формированию биоплёнки определяли, выращивая культуру в полистироловых плашках (объём 200 мкл) в LB бульоне («Difco») при 37^оС в течение 18–24 ч. Образовавшуюся биоплёнку фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида и окрашивали 0,4% раствором кристаллвиолета. Окрашенную биоплёнку растворяли в диметилсульфоксиде и измеряли оптическую плотность раствора на приборе «Stat Fax 2100» («Awareness Technology Inc.») при длине волны 570 нм [22]. Эксперимент проводили трехкратно, результаты представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего арифметического.

Для анализа нуклеотидных последовательностей генов, участвующих в обеспечении устойчивости штаммов V. cholerae к полимиксину В, использовали последовательности полных геномов штаммов V. cholerae, секвенированные ранее и депонированные в международной базе данных NCBI GenBank [4]. Структура гена carR была изучена нами у 71 штамма с применением программ «UGENE v.1.32» (Россия) и «MEGA X» (США). Сравнение проводили относительно генома референс-штамма V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара N16961 (AE003852.1). Для филогенетического анализа и построения дерева применяли программу «MEGA X», используя метод «максимальной бережливости». В работу были взяты полные геномы 1246 штаммов V. cholerae, представленные на момент проведения филогенетического анализа в NCBI GenBank. Для оценки достоверности филогенетической реконструкции проводили Bootstrap анализ с числом повторных выборок, равным 100.

Результаты

Изучение устойчивости штаммов V. cholerae биовара El Tor к полимиксину В

На первом этапе работы было проведено изучение устойчивости взятых в исследование токсигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара к полимиксину В. В результате установлено, что все типичные штаммы были устойчивы к данному антибиотику и хорошо росли на среде LB с добавлением 50 мкг/мл полимиксина В (рис. 1, таблица).

 

Полученные нами сведения об устойчивости типичных штаммов El Tor биовара к полимиксину В были ожидаемыми и соответствовали данным литературы [1].

В отличие от типичных штаммов, при анализе геновариантов были выявлены две группы. Изоляты первой, наиболее многочисленной группы (90,5%),
сохраняли данный диагностически значимый признак и были PolB^R. Штаммы второй группы, включающей всего два изолята — V. cholerae М1509 и 3265/80, были чувствительны к полимиксину В (таблица, рис. 1). Эти штаммы были завезены в Россию из Индии в 2012 и 2014 гг. соответственно. Стоит обратить внимание, что штаммы V. cholerae L3226 и L4150, также завезённые из Индии, но в 2010 г., являются PolB^R и относятся к первой группе (таблица). Полученные нами данные согласуются со сведениями литературы о появлении PolB^S изолятов на территории Индии начиная с 2012 г. [10].

Учитывая, что каждый год на территории нашей страны при мониторинговых исследованиях открытых водоёмов выделяется значительное количество нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара, мы расширили список исследуемых штаммов, взяв в работу изоляты, выделенные в 2012–2020 гг. (таблица). При проведении анализа указанных штаммов установлено, что все они были PolВ^R.

Таким образом, при изучении устойчивости взятых в анализ штаммов V. cholerae к полимиксину В обнаружены два PolВ^S изолята, которые завезены в Россию в последние годы и относятся к клиническим токсигенным генетически изменённым штаммам V. cholerae О1 El Tor биовара.

Молекулярно-генетический и филогенетический анализ PolB^S штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара

Учитывая данные литературы о влиянии на устойчивость к полимиксину В продуктов 12 генов, мы изучили нуклеотидную последовательность данных генов у взятых в анализ токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae, полные геномы которых представлены в базе данных GenBank (таблица). В результате установлено, что, действительно, только у PolВ^S штаммов V. cholerae М1509 и 3265/80 присутствует несинонимичная SNP (замена G на А в позиции 265) в гене carR (аллель carR^S). В результате замены гуанина на аденин в нуклеотидной последовательности гена carR происходят смена кодона GAC на AAC и замещение отрицательно заряженной аспарагиновой кислоты в позиции 89 на нейтрально заряженный аспарагин в белке CarR (рис. 2). Именно данная замена приводит к конформационным изменениям белковой молекулы, снижению транскрипционной активности белка CarR и появлению чувствительности к полимиксину В [21].

 

Ранее установлено, что штаммы V. cholerae М1509 и 3256/80 имеют структуру генома, характерную для современных высоковирулентных штаммов возбудителя холеры [5][9][23]. При филогенетическом анализе они вошли в один кластер со штаммами, выделенными в Непале в 2010 г. (VC-25, VC-26, VC-14) и на острове Гаити (HC-19A1^AGUJ01, НС-80А1^AGVB01, HC-22A1^AGUL01, HC-23A1^AGUM01, HC-28A1^AGUN01, HC-43A1^AGUQ01, HC-06A1^AGUI01, 2010El-1786^SANM10863496) [9][24]. Мы изучили нуклеотидную последовательность гена carR у всех штаммов данной группы и определили, что они имеют аллель carR^R (данные не показаны).

Учитывая, что в настоящее время в GenBank депонированы штаммы V. cholerae El Tor биовара, изолированные на эндемичной территории в последние годы, в том числе PolВ^S изоляты [21], нами также был проведён сравнительный филогенетический SNPs анализ и построено филогенетическое дерево (рис. 3).

В результате показано, что наиболее близкими к штаммам V. cholerae М1509 и 3256/80 были изоляты, выделенные в Бангладеш (провинция Дакка) в 2018 г., и штамм V. cholerae IDH 08148SiSQ01, изолированный в Индии (Калькутта) в 2015 г. При анализе нуклеотидной последовательности гена carR у данных штаммов было установлено, что все они содержат аллель carR^S.

Необходимо отметить, что клинические штаммы, выделенные в Бангладеш (провинция Дакка) в 2018 г., а также ранее (2015, 2016 гг.), образовывали ещё один кластер (рис. 3). Изучение последовательности гена carR штаммов этого кластера показало наличие аллеля carR^R. Отличия от группы carR^S штаммов составили 78–110 SNPs.

Устойчивый к полимиксину В штамм V. cholerae L3226 (Москва, 2010) вошёл в одну группу со штаммами, выделенными на Гаити в 2010–2012 гг., что соответствует ранее полученным данным [9]. При анализе нуклеотидной последовательности гена carR штаммов данной группы выявлено, как и ожидалось, что они имеют аллель carR^R.

Таким образом, штаммы V. cholerae М1509 и 3256/80 филогенетически родственны штаммам V. cholerae El Tor биовара, выделенным в Индии (2015 г.) и Бангладеш (2018 г.) и имеющим аллель carR^S.

Способность к формированию биоплёнки у Pol^S штаммов V. cholerae

V. cholerae может существовать в двух разных экологических нишах (вода открытых водоёмов и человек). Одной из важных стратегий, обеспечивающих адаптацию патогена при смене среды обитания, является способность к формированию биоплёнки. Биоплёнка защищает возбудителя холеры от действия стрессовых факторов и повышает его выживаемость как в воде открытых водоёмов, так и в кишечнике человека [25]. Учитывая важную роль биоплёнки в жизненном цикле патогена и отсутствие сведений о способности PolВ^S штаммов V. cholerae образовывать биоплёнку, нами была изучена данная способность у взятых в анализ штаммов V. cholerae. Кроме того, было высказано предположение, что изменение функциональной активности белка CarR у PolВ^S штаммов могло снизить его негативное влияние на процесс формирования биоплёнки. В результате установлено, что все геноварианты формировали хорошо выраженную биоплёнку. При этом PolВ^S штаммы V. cholerae М1509 и 3256/8 не отличались по биоплёнкообразованию от других взятых в анализ генетически изменённых штаммов V. cholerae (таблица). Вероятно, присутствие аллеля carR^S не оказывает влияния на процесс формирования биоплёнки. Однако для окончательного решения данного вопроса необходимо проведение исследований на большем количестве PolВ^S штаммов V. cholerae.

Обсуждение

Эволюционные преобразования генома геновариантов V. cholerae El Tor биовара продолжаются. Появляются мутации в генах вирулентности, пандемичности, адаптации, жизнеобеспечения, антибиотикорезистентности [4][5][11][23][26]. Происходят изменения и в генах, ответственных за проявление диагностически значимых признаков, вариабельность которых уже показана многими исследователями. Так, среди 54 изученных клинических штаммов V. cholerae О1 и О139 серогрупп, выделенных в Индии в 1975–2015 гг., у 22% изолятов отсутствовала способность к агглютинации куриных эритроцитов, а у 24% — гемолитическая активность [14]. Показано, что у геновариантов изменена (снижена или отсутствует) способность к образованию ацетилметилкарбинола в реакции Фогес–Проскауэра. Одна из причин данного явления — изменение структуры гена alsD (делеция нуклеотида Т в позиции 315), что приводит к сдвигу рамки считывания, образованию преждевременного стоп-кодона и биосинтезу дефектного фермента ацетолактат декарбоксилазы [27][28]. Появление устойчивых к диагностическому холерному фагу El Tor нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара способствовало активизации работ по поиску новых рас диагностических фагов [29]. Изменился и такой стабильный диагностический признак, как устойчивость к полимиксину В. Генетический механизм появления PolВ^S штаммов V. cholerae El Tor биовара связан с изменением структуры гена carR и появлением аллеля carR^S [10][21]. Вполне возможно, что в связи с вариабельностью диагностически значимых признаков у современных штаммов возбудителя холеры постановка фенотипических тестов определения биовара становится излишней, и ведущая роль принадлежит выявлению биоварспецифических аллелей генов генетическими методами.

Штаммы V. cholerae, чувствительные к полимиксину В, заносятся и в Россию. Выявлено, что штаммы V. cholerae М1509 и 3256/80, завезённые из Индии в 2012 и 2014 гг. соответственно, являются PolВ^S и имеют аллель carR^S(замена G на А в позиции 265), что характерно для всех чувствительных к полимиксину В штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара, выделяемых в последние годы [10][11]. Возможно, указанная SNP может стать ещё одной генетической меткой современных штаммов возбудителя холеры и использоваться при создании генодиагностических препаратов.

При филогенетическом SNPs анализе установлено, что штаммы V. cholerae М1509 и 3256/80 родственны carR^S штаммам, выделенным в Индии (2015 г.) и Бангладеш (2018 г.). Из-за отсутствия в литературе сведений об их чувствительности к полимиксину В можно лишь высказать предположение, что данные штаммы также являются PolВS.

Чувствительные к полимиксину В высоковирулентные штаммы V. cholerae El Tor биовара, видимо, имеют более высокий адаптационный потенциал, т.к. не только вытеснили PolВ^R изоляты V. cholerae El Tor биовара на территории Индии, но и явились причиной эпидемий и вспышек холеры в других странах Юго-Восточной Азии, а также на Африканском континенте [10][11][13][21]. При этом повышение их адаптационных способностей, возможно, не связано со способностью формировать биоплёнку, а обусловлено изменением каких-то других свойств, исследование которых будет целью дальнейшей работы.

Таким образом, в Россию завозятся высоковирулентные штаммы возбудителя холеры с изменёнными диагностически значимыми свойствами, что необходимо учитывать при идентификации клинических и выделенных при мониторинговых исследованиях внешней среды штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара.

About the authors

S. P. Zadnova

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4366-0562

Svetlana P. Zadnova — D. Sci. (Biol), leading researcher, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe".
Saratov.

Россия

Ya. M. Krasnov

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4909-2394

Yaroslav M. Krasnov — Cand. Sci. (Chem.), Head, Laboratory of genomic and proteomic analysis, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe".
Saratov.

Россия

N. A. Plekhanov

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»

Author for correspondence.
Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-2355-7018

Nikita A. Plekhanov — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe".
Saratov.

Россия

A. A. Kritskiy

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5506-4285

Andrey A. Kritskiy — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of pathogenic vibrios, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe".
Saratov.

Россия

V. V. Kutyrev

Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3788-3452

Vladimir V. Kutyrev — D. Sci. (Med), Prof., Academician of the Russian Academy of Sciences, Director, Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe".
Saratov.

Россия

References

Supplementary files