Microbiota of the lower respiratory tract in community-acquired pneumonia, including cases associated with SARS-CoV-2

Full Text

Введение

Микробиота лёгких функционирует в здоровой лёгочной ткани и оказывает влияние на иммунный ответ при физиологических и патологических состояниях. Незначительная численность микрофлоры лёгких затрудняет выделение, культивирование и идентификацию функциональных микробов. Тем не менее низкая биомасса не подрывает её потенциальную роль в формировании местного иммунитета лёгких [1].

Постоянство лёгочного микробиома определяется балансом 3 факторов: поступлением микробов в респираторные пути в процессе вдыхания; удалением микробов из дыхательных путей с кашлем; коэффициентом колонизации микробов. Местные условия в лёгких во время болезни резко меняются, запуская механизм избирательного размножения бактерий. Признанный феномен бактериальной колонизации на поздних стадиях заболеваний лёгких объясняет преимущественный рост видов бактерий, адаптированных к конкретным условиям. Установлена и экспериментально подтверждена распространённость субклинических микроаспираций фарингеальных секретов у здоровых людей. Показано, что структура микробиома лёгких более сходна с микробиомом ротоглоточной слизи, чем носоглоточной. Имеются доказательства того, что бактериальные сообщества нижних дыхательных путей (НДП) могут играть определённую роль в патогенезе и прогрессировании интерстициальных болезней лёгких.

Установлено, что микробиом здоровых лёгких представлен бактериями Bacteroidetes и Firmicutes. Наиболее часто бронхиальное дерево колонизируют бактерии рода Pseudomonаs, Streptococcus, Prevotella, Fusobacterium, Veillonella, Megasphaera и Sphingomonas. Изучение взаимодействия вирусов и бактерий в лёгких на уровне сообщества ещё находится в начале пути [2].

Внебольничные пневмонии (ВБП) являются серьёзной проблемой инфекционной патологии человека и одной из ведущих причин смерти [3]. По данным литературы, этиология ВБП установлена в 88,5% случаев методом ПЦР. Ведущими возбудителями указаны S. pneumoniae и Haemophilus influenzae, которые были выявлены в 86,3 и 41,2% случаев соответственно. В число актуальных патогенов ВБП вошли Mycoplasma pneumoniae (23,6%), Adenovirus (14,9%). Chlamydophila pneumoniae обнаруживается значительно реже (6,7%) [4]. Несмотря на то что в популяции 1–6% населения являются носителями Klebsiella pneumoniae, локализованной в носоглотке, и 5–38% — в кишечнике, у госпитализированных пациентов носительство K. pneumoniae составляет 23% [5]. Указывается, что представители группы Enterobacteriaceae (K. pneumoniae) являются маркёром прогностически неблагоприятного течения процесса в лёгких [6]. Информация по возбудителям бактериальных пневмоний свидетельствует о полимикробной этиологии и сочетании большого числа ассоциаций микроорганизмов и вирусов [4, 7].

На сегодняшний день пандемия COVID-19 по праву считается главной чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения за столетие. У значительной части пациентов развивается пневмония, требующая госпитализации или прогрессирующая до манифестации респираторных осложнений [8]. SARS-CoV-2 становится исключительно опасным, если вторичная бактериальная пневмония поражает пациента с COVID-19 в качестве осложнения. Существенную часть тяжёлых течений инфекции и смертности, связанных с коронавирусом в России в марте–мае 2020 г., можно отнести на счёт вторичной бактериальной пневмонии и, в гораздо меньшей степени, сопутствующих вирусных инфекций [9].

Анализ результатов лабораторных исследований пациентов с ВБП, ассоциированными с COVID-19, представленных в научных изданиях указывает на различную частоту присоединения вторичных инфекций (0–54%) [3][10–13]. В зарегистрированных осложнениях, обусловленных сопутствующими коинфекциями, этиологические агенты включали M. pneumoniae, Legionella pneumophila, S. pneumoniae и K. pneumoniae. По данным М.В. Стуловой и соавт., к наиболее часто встречающимся бактериальным возбудителям относятся S. pneumoniae (70%), S. agalactiae (10%), S. pneumoniae в ассоциации с Staphylococcus aureus (6,6%) и Pseudomonas aeruginosa (13,3%) [8]. В исследованиях Е. Sharifipour и соавт. у пациентов с COVID-19 в 90% случаев идентифицированы бактерии Acinetobacter baumannii и в 10% — S. aureus, все штаммы A. baumannii оказались устойчивыми к антибиотикам [14]. По результатам изучения микробиоты пациентов в Ростовской области наиболее частым этиологическим агентом ВБП бактериальной природы явились бактерии рода Streptococcus. В исследовании N. Chen и соавт. только 4% госпитализируемых имели сопутствующие грибковые инфекции, представленные Candida albicans и C. glabrata [15]. Следует отметить, что идентификация патогенов является сложной задачей в странах с низким и средним уровнем доходов, поскольку отсутствуют легкодоступные и рентабельные клинические или биологические маркёры, которые могли бы эффективно различать бактериальные и вирусные инфекции [10].

Остаются нерешёнными вопросы о синергических взаимодействиях между вирусом SARS-CoV-2 и некоторыми сопутствующими бактериями, о влиянии на тяжесть заболевания коинфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями [16]. В числе механизмов взаимодействия коинфицирующих агентов особое внимание уделяется влиянию вирусов на токсинообразование бактерий, а бактерий — на инфекционность вирусов. Коинфицирующие микроорганизмы способствуют сочетанному преодолению ими эпителиального барьера, могут взаимовыгодно модифицировать функции клеток иммунной системы и способствовать ускользанию этих патогенов от иммунного ответа. Показано, что разнообразие бактериально-вирусных взаимодействий при коинфицировании не только вызывает необходимость новых подходов к их своевременному распознаванию и контролю, но и порождает новые биотехнологии и стратегии борьбы с коинфицированием, развитию которых во всём мире уделяется огромное внимание [17].

В настоящее время распространение антибиотикорезистентности приняло глобальный характер [16][18]. Известно, что большинству госпитализированных пациентов с COVID-19 назначение антибактериальных препаратов проводится эмпирически [11][12]. Это обеспечивает формирование и распространение антибиотикорезистентных штаммов [18–21]. Необходимо помнить, что основой рациональной антибиотикотерапии является региональная или локальная особенность резистентности бактериальных агентов [16][18]. Инфекции, вызванные устойчивыми штаммами, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациента по сравнению с заболеваниями, обусловленными чувствительными микроорганизмами, результатом чего является более высокий показатель летальности [22][23]. Рациональная антибактериальная терапия невозможна без современных знаний этиологической структуры заболевания, антибиотико- и фагочувствительности возбудителя.

Целью исследования явилось изучение микробного консорциума НДП при ВБП, ассоциированных c SARS-CoV-2, оценка антибиотико- и фагорезистентности циркулирующих штаммов микроорганизмов.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужила мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж 486 пациентов, находящихся на стационарном лечении в 5 моногоспиталях Тюмени и Тюменской области с подтверждённым диагнозом ВБП средней и тяжёлой степени и давших информированное добровольное согласие на проведение исследования. Из них у 282 человек подтверждено наличие SARS-CoV-2. Почти в 90% случаев пациенты получали оксигенотерапию, около 8% больных были подключены к аппаратам искусственной вентиляции лёгких.

Отбор и транспортировка биологического материала для лабораторного исследования проводились в соответствии с требованиями законодательства РФ в отношении возбудителей инфекционных заболеваний человека I–II групп патогенности¹. Посев клинических проб осуществлялся на протяжении 6 мес (с апреля по октябрь 2020 г.). Штаммы выделяли общепринятыми методами в соответствии с Приказом № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»². Отобранные бактерии идентифицировали по прямому белковому профилированию с помощью времяпролетной масс-спектрометрии c программным обеспечением «Maldi BioTyper 3.0». Уровень достоверности выше 2,0 свидетельствовал о точном определении вида микроорганизма. Для каждого исследованного штамма бактерий приводилась ссылка на National Center for Biotechnology Information.

Резистентность к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом на среде Мюллера–Хинтона («HiMedia»), результаты анализировали в соответствии с действующими нормативными документами³.

Чувствительность Streptococcus spp. (157 культур) оценивали к ампициллину, амоксициллин/ клавулановой кислоте, клиндамицину, цефотаксиму, левофлоксацину, азитромицину. Бактерии рода Staphylococcus (46 штаммов) исследовали на устойчивость к ингибиторзащищённому ампициллину, офлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, имипенему, меропенему, цефокситину, клиндамицину, азитромицину, амикацину. У штаммов бактерии рода Enterococcus (22 штаммов) определяли антибиотикограмму с использованием дисков с ампициллином, амоксициллин/сульбактамом, амоксициллин/клавулановой кислотой, ципрофлоксацином, левофлоксацином, имипенемом, меропенемом, гентамицином, ванкомицином. Проводилась интерпретация зон задержки роста изолятов неферментирующих грамотрицательных бактерий (74 штаммов) и бактерий семейства Enterobacteriaceae (95 культур микроорганизмов) под воздействием ампициллина, амоксициллин/клавулановой кислоты, амикацина, ципрофлоксацина, меропенема, имипенема, цефотаксима, цефепима, цефтазидима, цефоперазон/сульбактама, ко-тримоксазола.

В соответствии с клиническими рекомендациями⁴ изучена чувствительность 30 штаммов K. pneumoniae к двум коммерческим бактериофагам (АО НПО «Микроген»): бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный (П261, выпуск 1118) и секстафаг (П11, выпуск 0219).

На сухую поверхность среды Мюллера–Хинтона наносили культуру микроорганизма в концентрации 1,5 × 10⁸ КОЕ/мл и с помощью шпателя равномерно распределяли на поверхности питательной среды. Через несколько минут после подсыхания инокулята, не касаясь поверхности агара, капали исследуемые бактериофаги. Чашки инкубировали в термостате при 37ºС в течение 24 ч.

Литическую активность фага оценивали по пятибалльной шкале (по количеству «крестов»):

• «–» — отсутствие литической активности;
• «+» — низкая активность;
• «++» — образование зоны лизиса с большим количеством колоний вторичного роста бактерий;
• «+++» — зона лизиса с единичными колониями вторичного роста;
• «++++» — прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с использованием программного обеспечения «Statisticа v.22» («IBM SPSS»), предназначенного для научных работ. Если значения р-критерия были менее 0,05, а доверительные интервалы разности средних не содержали внутри себя 0, то гипотеза об их равенстве отвергалась и с достоверностью 95% можно было утверждать, что исследуемые группы различались по величине оцениваемого явления.

Результаты и обсуждение

У 282 (58%) пациентов с диагнозом ВБП с помощью ПЦР выявлен вирус SARS-CoV-2. Практически у десятой части пациентов, вне зависимости от наличия SARS-CoV-2, условно-патогенные бактерии в биоматериале не были обнаружены (SARSCoV-2 обнаружен — 10,6%, SARS-CoV-2 не обнаружен — 12,3%).

В ходе бактериологического исследования в биопробах пациентов с положительными тестами на РНК SARC-CoV-2 выделено и изучено 430 штаммов микроорганизма, с отрицательными результатами — 297 культур. Безусловно, при сборе мокроты происходит её контаминация бактериями носоглоточной слизи (верхних дыхательных путей), поэтому при статистической обработке результатов учитывался диагностически значимый для мокроты титр количества микроорганизмов. В структуре бактерий превалировали грамположительные кокки, в основном они представлены родом Streptococcus и грибами рода Candida. Подавляющее большинство культур микроорганизмов рода Streptococcus spp. относились к сапрофитной микрофлоре слизистой верхних дыхательных путей, из условно-патогенных стрептококков был изолирован S. pneumoniae только у 5 пациентов с лабораторно подтверждённым COVID-19. По результатам идентификации клинических штаммов грибов рода Candida особое место заняли C. albicans (80%), кроме того, были выделены C. kefyr, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. krusei.

Сравнительная характеристика микробиоценоза мокроты, промывных вод бронхов и альвеолярного лаважа больных с ВБП в зависимости от лабораторного подтверждения SARC-CоV-2 представлена в табл. 1.

При оценке частоты встречаемости различных групп микроорганизмов было установлено, что шансы обнаружения грамположительных микроорганизмов были выше при наличии у пациентов в пробах РНК SARC-CoV-2 (p < 0,001). Шанс выявления неферментирующих грамотрицательных бактерий и бактерий семейства Enterobacteriaceae у данной категории обследованных оказался ниже, чем у пациентов с отрицательными результатами ПЦР-исследования на коронавирусную инфекцию (p = 0,040 и p = 0,012) соответственно. При сравнении частоты встречаемости других бактерий в зависимости от наличия SARC-CoV-2 статистически значимые различия отсутствовали.

В табл. 2 показаны данные об основной структуре потенциальных возбудителей ВБП, выделенных из биоматериала пациентов. Лидирующие место из семейства Enterobacteriaceae занимают бактерии K. pneumoniae. Большая часть неферментирующих грамотрицательных бактерий представлена штаммами Acinetobacter spp.

 

Наибольшие уровни резистентности выявлены у штаммов Acinetobacter spp., Enterococcus spp. и коагулазонегативных Staphylococcus spp. (96,9, 75,8 и 75,4% соответственно), изолированных от пациентов с наличием вируса SARS-CoV-2. При этом у больных без лабораторного подтверждения SARSCoV-2 наибольшая устойчивость бактерий зафиксирована у Acinetobacter spp., коагулазонегативных Staphylococcus spp. и K. pneumoniae (92,3, 74,2 и 70% соответственно; табл. 3).

 

При сравнении показателей устойчивости микрофлоры в зависимости от наличия у пациентов SARS-CoV-2 с помощью расчёта шансов установлена статистически подтверждённая разница по антибиотикорезистентности штаммов в группе неферментирующих грамотрицательных бактерий и бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также у представителей рода Streptococcus spp. и у изолятов S. aureus.

Статистический анализ выявил, что в группе пациентов с ВБП, ассоциированными с SARSCoV-2, шансы встретить резистентные штаммы Streptococcus spp. в 1,5 раза выше, а с учётом 95% доверительного интервала величина этого показателя составила 1,1–2,1 раза.

У пациентов с отрицательным ПЦР-тестом на COVID-19 шансы обнаружить антибиотикорезистентные штаммы выше в группе неферментирующих грамотрицательных бактерий за счёт Pseudomonas spp., среди штаммов семейства Enterobacteriaceae — за счёт K. pneumoniae. Также зафиксирован более высокий уровень устойчивых штаммов S. aureus у данной категории пациентов.

Данные о резистентности грамположительных и грамотрицательных бактерий в зависимости от вида антимикробного препарата представлены в табл. 4 и табл. 5.

 

Группа бактерий Streptococcus spp. представлена преимущественно следующими видами: S. mitis, S. parasanguinis, S. vestibularis, S. salivarius, S. oralis, которые проявляли набольший уровень устойчивости к антимикробным препаратам пенициллинового ряда. Все указанные бактерии признаны доминирующей флорой слизистых оболочек верхних дыхательных путей, обеспечивающей нормобиоценоз у здоровых людей. Штаммы S. pneumoniae, изолированные от пациентов с подтверждённым COVID-19, отличались резистентностью к азитромицину.Среди бактерий рода Staphylococcus обнаружены S. aureus, S. haemolyticus, S. warneri, чаще демонстрирующие резистентность к пенициллиновой группе и азитромицину. Выявлены 2 штамма S. aureus, которые чувствительны только к амикацину. Штаммы бактерий рода Enterococcus представлены преимущественно видом E. faecium, отличались множественной резистентностью, исключение составил ванкомицин.

Бактерии семейства Enterobacteriaceae показывают высокий уровень толерантности к пенициллинам, что связано с природной устойчивостью штаммов K. pneumoniae, а также к цефалоспоринам III поколения, при этом цефалоспорины IV поколения демонстрировали максимальную чувствительность. Для лечения пневмоний, вызванных неферментирующими грамотрицательными бактериями, оптимально применять цефтазидим и цефоперазон сульбактам. Практически все штаммы Serratia marcescens были чувствительны к ко-тримоксазолу, что является особенностью данной культуры.

Проведено исследование чувствительности 30 штаммов K. pneumoniae, выделенных от пациентов с ВБП, ассоциированной с SARS-CoV-2, к двум коммерческим бактериофагам (бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный и сектафаг) методом Spot-test. Выявлен один клинический штамм K. pneumoniae, проявляющий чувствительность к вышеуказанным бактериофагам. Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоёв по Грациа [24]. Титр бактериофагов составлял 10⁸ БОЕ/мл. Таким образом, решение вопроса о необходимости расширения банка бактериофагов к наиболее значимым возбудителям бактериальных инфекций требует дальнейших углублённых исследований.

Выводы

1. В структуре микробиоты НДП пациентов при ВБП средней и тяжёлой степени, ассоциированной с SARS-CoV-2, преобладала грамположительная кокковая флора, представленная в основном бактериями рода Streptococcus, достоверно отличающимися большей резистентностью к антибиотикам.

2. Микробиом отделяемого НДП пациентов с ВБП средней и тяжёлой степени при отсутствии подтверждения наличия SARS-CoV-2 характеризовался более частым обнаружением грамотрицательных бактерий: семейства Enterobacteriaceae (K. pneumoniae) и неферментирующих грамотрицательных бактерий (Acinetobacter spp.).

3. Высокая антибиотикорезистентность грамположительных изолятов, вне зависимости от наличия коронавируса, регистрировалась преимущественно к пенициллиновой группе антимикробных препаратов.

4. Грамотрицательные изоляты семейства Enterobacteriaceae характеризуются резистентностью к пенициллиновой группе антимикробных препаратов и цефалоспоринам III поколения; неферментирующие грамотрицательные бактерии — множественной лекарственной устойчивостью.

5. Исследованные штаммы K. pneumoniae показали высокую резистентность к коммерческим бактериофагам.

About the authors

L. V. Kataeva

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Author for correspondence.
Email: kataevalv@tniikip.rospotrebnadzor.ru
ORCID iD: 0000-0001-9966-8454

Lyubov V. Kataeva — Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Head, Bacteriological laboratory, Tyumen Region Infection Pathology Research Institute.
Tyumen.

Russian Federation

A. A. Vakarina

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3112-4722

Arina A. Vakarina — junior researcher, Bacteriological laboratory, Tyumen Region Infection Pathology Research Institute.
Tyumen.

Russian Federation

T. F. Stepanova

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6289-6274

Tatiana F. Stepanova — D. Sci. (Med.), Professor, Director, Tyumen Region Infection Pathology Research Institute.
Tyumen.

Russian Federation

K. B. Stepanova

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5420-0919

Kseniya B. Stepanova — Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Head, Clinical department, Tyumen Region Infection Pathology Research Institute.
Tyumen.

Russian Federation

References

Supplementary files