Immunogenic properties of the preparation containing the Chikungunya virus antigen inactivated by β-propiolactone

Full Text

Введение

Лихорадка Чикунгунья (ЛЧ) представляет собой космополитический арбовирус, передающийся преимущественно комарами из рода Aedes (A. aegypti и A. albopictus). Подавляющее количество случаев ЛЧ — симптоматические (75–95%) [1]. Типичными симптомами ЛЧ являются высокая температура и поражения скелетно-мышечной системы, которые могут длиться от нескольких месяцев до года и более с утратой трудоспособности. Летальность при ЛЧ невысокая, с преимущественной регистрацией среди новорождённых, престарелых, а также пациентов с хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой, дыхательной и нервной систем [2].

Такие факторы, как глобальное потепление, вырубка лесов и урбанизация, ведут к росту распространения арбовирусных инфекций, в том числе ЛЧ [3]. В 2007 г. локальная передача инфекции была впервые отмечена в Европе, когда в ходе локализованной вспышки на северо-востоке Италии было выявлено 197 заболевших. Тем самым подтвердилась возможность вспышек заболеваний, передаваемых комарами A. albopictus, на территории Европы [4][5]. Случаи ЛЧ зарегистрированы более чем в 100 странах Европы, Океании, Африки, Азии, Карибского бассейна, Южной и Северной Америки [4][5].

РНК вируса Чикунгунья (далее — ЧИКВ) достаточно консервативна. Циркулирующие генотипы ЧИКВ генетически близки и составляют единый серотип. Перекрёстная защита между разными штаммами ЧИКВ, а также взаимная перекрёстная защита среди других альфа-вирусов были продемонстрированы на животных моделях [6][7]. Считается, что перенесённая инфекция ЧИКВ обеспечивает пожизненный иммунитет, повторные случаи инфицирования практически не регистрируются [8–10]. Этот фактор, наряду с отсутствием специфической терапии как самой инфекции, так и её последствий, делает вакцинацию наиболее перспективным путём профилактики ЛЧ.

Впервые кандидатная вакцина для профилактики ЛЧ была разработана более 50 лет назад, когда V.R. Harrison и коллеги, используя инактивированный формалином штамм ЧИКВ 15561, получили специфический иммунный ответ у мышей и обезьян [11]. Для разработки профилактических вакцин против ЧИКВ используются разные технологические платформы. Вакцины на основе одного штамма ЧИКВ могут обеспечить длительную перекрёстную защиту против гетерологичных штаммов вируса, что было продемонстрировано в экспериментах на мышах и макаках, несмотря на высокую вирулентность, проявленную некоторыми изолятами ЧИКВ [12].

Технология производства инактивированных вакцин является традиционной и успешной для большого количества вирусных вакцин. Данная технологическая платформа признана одной из наиболее безопасных [5], и разработка таких вакцин не требует генетических манипуляций с вирусом. Две формалин-инактивированные вакцины были разработаны с использованием разных штаммов ЧИКВ — азиатского 15561 и индийского DRDE-06, а также клеточной линии Vero и затем успешно прошли доклинические исследования на лабораторных животных, продемонстрировав свой иммуногенный потенциал [11][13]. В относительно небольших сравнительных исследованиях на мышах линии BALB/c продемонстрировано преимущество инактивированного β-пропиолактоном (β-ПЛ) препарата антигена ЧИКВ над формалин-инактивированным препаратом в формировании специфического гуморального и клеточного иммунитета [14]. Аттенуированные вакцины, разработанные для профилактики ЛЧ, ранее продемонстрировали высокую реактогенность в клинических исследованиях, в том числе за счёт реверсии мутаций в гене Е2 ЧИКВ [5].

Целью настоящей работы было изучение иммуногенных свойств препарата, содержащего инактивированный β-ПЛ антиген штамма Nic ЧИКВ (GenBank acc. no MN271692). Данный штамм ЧИКВ был адаптирован к клеточной линии Vero, наработан и инактивирован с помощью β-ПЛ. Очищенный препарат был внутримышечно введён мышам дважды с интервалом 14 дней; показатели гуморального и клеточного иммунитета были оценены в динамике.

Материалы и методы

Вирус. В работе был использован штамм Nic ЧИКВ, полученный из рабочей коллекции вирусов ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН. История выделения и пассирования штамма ЧИКВ описана ранее [15]. Нуклеотидная последовательность штамма ЧИКВ представлена в GenBank, acc.no MN271692.

Клетки. Клетки Vero (производственный банк клеток ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН) культивировали в среде Игла МЕМ (производство ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН) с 5% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота («Gibco»).

Лабораторные животные. В исследовании использовали мышей линии BALB/c (гаплотип Н-2^d) обоего пола массой 12–14 г. Животные были получены из питомника «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА.

Препараты. Для получения инактивированного препарата ранее адаптированный штамм Nic ЧИКВ нарабатывали на клетках Vero при роллерном культивировании. Множественность заражения составляла 0,0001 TЦД50 на 1 клетку. Инактивацию ЧИКВ проводили β-ПЛ в соотношении 1 : 1000 в течение 48 ч при 5^оС при постоянном перемешивании. Инактивированную вируссодержащую жидкость концентрировали в 50 раз методом ультрафильтрации с помощью концентратора «Vivaflow 100» («Sartorius»). Полученный инактивированный вирусный концентрат очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на сорбенте «Sepharose-6FF» («GE Healthcare»). Внутрипроизводственные контроли подтвердили стерильность препарата и отсутствие эндотоксинов. Содержание остаточной ДНК клеток Vero было менее 5 нг/мл, рН 7,4. Далее препарат инактивированного и очищенного антигена ЧИКВ был сорбирован на гидроокиси алюминия. Содержание гидроокиси алюминия в конечной дозе препарата составляло 0,46 мкг на дозу. Инактивированный препарат ЧИКВ был произведён с разным содержанием антигена: 10, 25 и 40 мкг в одной дозе препарата. Однократно вводимый объём препарата составлял 0,5 мл.

Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения содержания антигена ЧИКВ проводили с помощью набора «БиоСкрин-Чикунгунья комплект G» («Биосервис») в соответствии с инструкцией производителя. Для калибровки использовали очищенный по описанной выше методике инактивированный ЧИКВ с известной концентрацией общего белка, который определяли по методу Лоури без осаждения в соответствии с ОФС «Определение белка» ХIV Государственной фармакопеи РФ.

ИФА для определения титра антител ЧИКВ. Очищенный инактивированный антиген ЧИКВ сорбировали на 96-луночные планшеты в концентрации 100 нг на лунку в 0,01 M карбонат-гидрокарбонатном буфере с рН 9,6. Блокировку производили фосфатно-солевым буфером рН 7,2 с 1% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота («Gibco»). Перед проведением анализа образец сыворотки разводили 1 : 100 и далее шагом 2 — до 1 : 12 800. Инкубацию антигена с полученными сыворотками проводили при 37^оС в течение 1 ч. Инкубацию со вторичным антивидовым HRP-конъюгатом проводили также при 37^оС в течение 1 ч.

Иммунный комплекс выявляли с помощью готового субстрата TMB. Остановку реакции производили 2 М серной кислотой. Учёт реакции проводили при длине волны 450 нм. Каждое разведение сыворотки оценивали в 3 повторах.

Исследование пролиферативной активности спленоцитов. Оценку пролиферации спленоцитов осуществляли фотометрическим методом по ранее описанной методике [16]. Стоковый раствор PMS («Sigma»), приготовленный на фосфатно-солевом буфере (40 мкг/мл), длительное время хранился при –20ºС в защищённом от света месте. Приготовление стокового раствора ХТТ («Sigma») на фосфатно-солевом буфере (1,25 мг/мл) проводили непосредственно перед использованием. Готовую смесь реагентов (XTT : PMS = 4 : 1) стерилизовали пропусканием через фильтр «Millex» (0,22 мкм, «Millipore») и добавляли в лунки (50 мкл/лунку) за 8 ч до окончания периода инкубации.

Оптическую плотность (ОП) регистрировали при длине волны 450 нм против контрольной длины волны 630 нм.

Результат теста рассчитывали по формуле:

ИС = ОП_С/ОП_К,

где ИС — индекс стимуляции; ОП_С — ОП в лунке со стимулированными спленоцитами; ОП_К — ОП в контрольных лунках.

При изучении клеточного иммунитета использовали следующие антигены: антиген ЧИКВ, инактивированный β-ПЛ (5 мкг/мл); антиген вируса SARS-CoV-2 — штамм Aydar-1, инактивированный β-ПЛ (5 мкг/мл), а также митогены: конканавалин А (КонА, «ICN», 5 мкг/мл) и липополисахарид Salmonella typhimurium (ЛПС, «Sigma», 5 мкг/мл). Каждый антиген и митоген использовали для стимуляции спленоцитов животных в 4 повторах.

Реакцию нейтрализации (РН) проводили по ранее описанной методике [13] на 96-луночных планшетах с использованием культуры клеток Vero и того же штамма ЧИКВ в дозе 100 ТЦД50.Полученный результат переводили в log2 для статистической обработки.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016». Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения среднего. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Дизайн исследования. Животные были разделены на группы по 25 мышей в каждой:

• группа А — иммунизированы внутримышечно препаратом в дозе 10 мкг/0,5 мл на 0-е и 14-е сутки эксперимента;
• группа В — иммунизированы внутримышечно препаратом в дозе 25 мкг/0,5 мл на 0-е и 14-е сутки эксперимента;
• группа С — иммунизированы внутримышечно препаратом в дозе 40 мкг/0,5 мл на 0-е и 14-е сутки эксперимента;
• группа D — контрольные животные, иммунизированные внутримышечно препаратом гидроокиси алюминия в дозе 0,46 мкг/0,5 мл на 0-е и 14-е сутки эксперимента.

Иммунизацию животных проводили внутримышечно (бедренная мышца), разделив 1 дозу на 2 введения, по 0,25 мл препарата в каждую конечность. У животных всех групп до проведения 1-й иммунизации (0-е сутки), до проведения 2-й иммунизации (на 14-е сутки), а также на 21, 28 и 35-е сутки эксперимента (7, 14 и 21-е сутки после 2-й иммунизации соответственно) производили забор крови из глазной вены. Кровь пулировали, после центрифугирования разливали по пробиркам в объёме 200 мкл и хранили при –70°С для последующего одномоментного исследования. Во всех группах на каждую точку забора крови использовали 4 животных.

У животных групп С и D одновременно со взятием крови выделяли селезёнку для дальнейшего получения суспензии спленоцитов.

Все процедуры на отдельных мышах проводили вне визуального, аудиального или обонятельного контакта с другими животными. Работу с животными проводили в соответствии с международными принципами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» ETS № 123 (Страсбург, 1986), Приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

Результаты

Доза препарата, содержащего 10 мкг антигена ЧИКВ, вызывала незначительный подъём специфических антител в группе А после 2-й иммунизации с падением к 35-м суткам наблюдения (табл. 1). Введение дозы препарата, содержащего 25 мкг антигена ЧИКВ, привело к формированию достаточно высокого уровня специфических антител в группе В на 14-е сутки после 2-й иммунизации, который, однако, также снизился к 35-м суткам наблюдения (табл. 1). В сыворотке животных группы С, привитых дважды дозой 40 мкг антигена ЧИКВ, уже через 7 сут отмечался подъём специфических IgG, превосходящий максимальные значения IgG в группах А и В. Максимальный титр специфических IgG в сыворотке животных группы С превосходил таковые в группе А в 16 раз и в группе В — в 4 раза. Максимальные титры специфических IgG сохранялись у животных группы С до конца срока наблюдения.

В сыворотке животных группы А вируснейтрализующие IgG были зарегистрированы однократно на 14-е сутки после 2-й иммунизации (табл. 2). Показатели вируснейтрализующих антител, сформировавшихся у животных группы В на введение препарата, содержащего 25 мкг антигена ЧИКВ, на все сроки наблюдения были достоверно выше таковых (р < 0,05) в группе А и достоверно ниже (р < 0,05) показателей, сформировавшихся на введение препарата, содержащего 40 мкг антигена ЧИКВ в группе С (табл. 2). Максимальный уровень вируснейтрализующих IgG в группе В отмечался аналогично титрам в ИФА через 14 сут после 2-й иммунизации с дальнейшим падением. В ответ на введение инактивированного препарата с разным содержанием антигена ЧИКВ наиболее выраженный иммунный ответ, как и в ИФА, отмечался для дозы антигена ЧИКВ 40 мкг/0,5 мл. В группе С максимальный прирост специфических антител был на 14-е сутки после 2-го введения препарата и сохранялся до конца срока наблюдения.

У животных контрольной группы D специфические IgG в ИФА и РН не выявлялись в сыворотке ни в одной из контрольных точек (данные не приведены).

Для дальнейших исследований клеточного иммунного ответа был выбран препарат с дозой антигена ЧИКВ 40 мкг как обеспечивший наиболее выраженный и стабильный гуморальный иммунный ответ у мышей линии BALB/c после двукратной иммунизации.

Влияние иммунизации инактивированным препаратом антигена ЧИКВ на функциональное состояние лимфоцитов (спленоцитов) мышей BALB/c и, соответственно, на формирование специфического клеточного ответа оценивали в реакции пролиферации спленоцитов. Как следует из представленных в табл. 3 данных, использованные в реакции вирусные антигены, специфический ЧИКВ и гетерологичный SARS-CoV-2 in vitro не вызывали подавления пролиферации спленоцитов на 0-е сутки у животных в группе С и в контрольной группе D (табл. 3).

Пролиферативная реакция спленоцитов животных обеих групп на стимуляцию in vitro митогенами КонA и ЛПС была достаточно выраженной и достоверно превосходила таковую при использовании вирусных антигенов на все сроки наблюдения (p < 0,05).

Спленоциты неиммунных животных группы D отвечали выраженной пролиферацией на стимуляцию in vitro только митогенами Т- и В-клеток (КонA и ЛПС), но не пролиферировали при стимуляции вирусными антигенами — как антигеном ЧИКВ, так и антигеном SARS-CoV-2 на все сроки наблюдения (табл. 3).

Как следует из представленных в табл. 3 данных, спленоциты мышей BALB/c, иммунизированных инактивированным препаратом ЧИКВ в группе С, отвечали на стимуляцию in vitro специфическим антигеном ЧИКВ, начиная с 14-х суток после 1-й иммунизации. Результаты, полученные на 14-е сутки, свидетельствуют о том, что после однократной иммунизации ИC спленоцитов достоверно превосходит этот же показатель на 0-е сутки (р < 0,05). На 21, 28 и 35е сутки эксперимента у иммунизированных животных ИС спленоцитов на антиген ЧИКВ достоверно превосходит аналогичный показатель на 14-е сутки после 1-й иммунизации (р < 0,05). ИС спленоцитов в ответ на стимуляцию антигеном ЧИКВ у животных группы С после 2-й иммунизации достиг максимума на 28-е сутки эксперимента. Статистически достоверная разница между ИС спленоцитов антигеном ЧИКВ у животных групп С и D на всём сроке наблюдения свидетельствует о специфичности пролиферативной реакции спленоцитов у иммунных животных.

Обсуждение

Консервативность вирусной РНК ЧИКВ, перекрёстная защита между разными штаммами ЧИКВ, пожизненный иммунитет и практическое отсутствие повторных случаев инфицирования [8–10], а также отсутствие специфической терапии как самой инфекции, так и её последствий делает вакцинацию наиболее перспективным путём профилактики ЛЧ.

Два основных вида традиционных вакцин — инактивированные и аттенуированные — имеют преимущество с точки зрения экономической эффективности и устоявшихся нормативных стандартов. Эти преимущества упрощают исследования и разработку технологии, а также лицензирование для удовлетворения спроса и профилактики заболевания. Главным преимуществом инактивированных вакцин являются их безопасность при отсутствии риска реверсии вирулентности, стабильность и минимальные проблемы хранения и транспортировки. Определённым недостатком является необходимость многократных бустерных доз для выработки и поддержания эффективного иммунного ответа.

Для производства цельновирионных инактивированных вакцин используются различные технологии инактивации вирусов, такие как ультрафиолетовое облучение, формалин или β-ПЛ.

Известно, что инактивация вируса формалином происходит за счёт моногидроксиметилирования аденина, сшивания белков путём образования интер- и внутримолекулярных метиленовых мостиков, а также сшивания РНК вируса с белками капсида, что приводит к блокировке чтения генома. Таким образом, формальдегид может нарушать структуру вируса и приводить к низкой иммуногенности некоторых вирусных вакцин [17]. Тем не менее предыдущие исследования формалин-инактивированных вакцин для профилактики ЛЧ [13][14] показали их достаточный иммуногенный потенциал, продемонстрировав выработку специфических вируснейтрализующих антител [11][13][14], а также развитие клеточного иммунитета [13] в доклинических исследованиях. Клеточный иммунитет при ЛЧ остаётся малоизученным, однако доказана его критическая роль для контроля и клиренса ЧИКВ [18].

β-ПЛ широко используется для инактивации вирусов, как например, в вакцинах для профилактики бешенства, гриппа, желтой лихорадки и коронавируса, в основном действуя как алкилирующий агент на гуанин вирусной ДНК или РНК [19]. Свойство β-ПЛ алкилировать преимущественно вирусный геном способствует развитию протективного иммунного ответа на ведение вакцины [17]. Однако полностью исключить модификацию вирусных белков при воздействии β-ПЛ нельзя. Как показало проведённое ранее исследование, количество и характер модификаций вирусных компонентов, как белков, так и ДНК или РНК, зависят от концентрации β-ПЛ, типа буфера, pH, а также внутренней реакционной способности отдельных нуклеофильных групп [19]. Таким образом, условия инактивации вируса β-ПЛ при производстве вакцины должны быть максимально оптимизированы, чтобы, с одной стороны, добиться полной инактивации вируса, а с другой — устойчиво высокой иммуногенности вакцины.

В данном исследовании продемонстрирована иммуногенность инактивированного β-ПЛ препарата для профилактики ЛЧ. Максимальный прирост специфических антител наблюдался у привитых животных всех экспериментальных групп через 14 сут после 2-го введения. Специфические вируснейтрализующие антитела сохранялись у животных экспериментальных групп до конца срока наблюдения. Наилучший результат со стороны гуморального иммунитета, как в реакции ИФА, так и в РН, зарегистрирован после иммунизации животных препаратом, содержащим 40 мкг антигена ЧИКВ. В группе животных, привитых препаратом, содержащим 40 мкг в дозе, максимальные показатели гуморального иммунитета сохранялись до конца срока наблюдения. В то же время в группах животных, привитых меньшими дозами (10 и 25 мкг) антигена ЧИКВ, показатели гуморального иммунитета снижались к 21-м суткам после 2-й иммунизации.

Результаты исследования пролиферации спленоцитов иммунных животных позволяют сделать заключение, что при иммунизации препаратом, содержащим разные дозы инактивированного антигена ЧИКВ, у мышей BALB/c формировался клон клеток памяти, которые при повторной встрече со специфическим антигеном реагировали выраженной пролиферацией. Результаты исследования пролиферации спленоцитов иммунных лабораторных животных в ответ на стимуляцию специфическим антигеном ЧИКВ in vitro продемонстрировали результаты, сходные с результатами исследования показателей гуморального иммунитета в ИФА и РН. Максимальный прирост ИС спленоцитов in vitro наблюдался у привитых животных через 14 сут после 2-го введения препарата и сохранялся до конца срока наблюдения в группе животных, привитых препаратом, содержащим 40 мкг антигена ЧИКВ в дозе 0,5 мл.

Препарат инактивированного β-ПЛ ЧИКВ, наработанного на производственном банке клеток Vero, аттестованном в соответствии с ОФС «Требования к клеточным культурам — субстратам производства иммунобиологических препаратов» XIV Государственной Фармакопеи РФ, с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта продемонстрировал выраженные иммуногенные свойства при двукратном введении мышам BALB/c. β-ПЛ имеет очевидные преимущества перед формалином, в том числе в формировании более выраженного специфического поствакцинального гуморального и клеточного иммунитета при использовании для инактивации ЧИКВ [14]. Учитывая быстрый рост адаптированного к клеткам Vero ЧИКВ, данная технологическая платформа позволяет производителю, использующему клетки Vero для производства других инактивированных вирусных вакцин, достаточно быстро произвести вакцину для профилактики ЛЧ. Таким образом, полученные в представленной работе результаты позволяют оценить инактивированный препарат антигена ЧИКВ в дозе 40 мкг/0,5 мл как перспективный.

Заключение

Очищенный инактивированный β-ПЛ препарат антигена ЧИКВ продемонстрировал выраженный иммуногенный потенциал. Выбранная в результате исследований иммунизирующая доза антигена ЧИКВ 40 мкг/0,5 мл при двукратном введении мышам линии BALB/c вызывает формирование как специфического гуморального иммунитета, характеризующегося появлением IgG, обладающих вируснейтрализующей активностью, так и специфического клеточного иммунного ответа, характеризующегося выраженной пролиферацией спленоцитов при стимуляции специфическим антигеном ЧИКВ in vitro.

Представленные результаты позволяют оценить препарат как перспективный для профилактики ЛЧ с использованием дозы и схемы, апробированных в данном исследовании.

About the authors

G. M. Ignatyev

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ignatjev_gm@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-9731-3681

Georgy M. Ignatyev — D. Sci. (Med.), Professor, Deputy Head, Department for quality and innovative development, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological Products of Russian Academy of Sciences.
Moscow.

Russian Federation

K. V. Kaa

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8446-1853

Konstantin V. Kaa — junior researcher, Laboratory of molecular biology of viruses, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological Products of Russian Academy of Sciences.
Moscow.

Russian Federation

L. P. Antonova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1221-1134

Lilia P. Antonova — junior researcher, Laboratory of molecular biology of viruses, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological Products of Russian Academy of Sciences.
Moscow.

Russian Federation

A. V. Atrasheuskaya

Saint-Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Serums and the Enterprise for the Production of Bacterial Preparations

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2491-4072

Alena V. Atrasheuskaya — senior specialist, R&D Department, Saint-Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Serums and the Enterprise for the Production of Bacterial Preparations.
Saint Petersburg.

Russian Federation

A. A. Ishmukhametov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-6130-4145

Aidar A. Ishmukhametov — D. Sci. (Med.), Professor, General Director, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological Products of Russian Academy of Sciences.
Moscow.

Russian Federation

References

Supplementary files