Evaluation of the ability of cholera vibrios to form a biofilm on the surface of the chitinous shell of a crayfish by real-time PCR

E. A. Menshikova; Меньшикова Е. А.; E. M. Kurbatova; Курбатова Е. М.; S. O. Vodopyanov; Водопьянов С. О.; R. V. Pisanov; Писанов Р. В.; S. V. Titova; Титова С. В.

doi:10.36233/0372-9311-99

Evaluation of the ability of cholera vibrios to form a biofilm on the surface of the chitinous shell of a crayfish by real-time PCR

Authors: Menshikova E.A.¹, Kurbatova E.M.¹, Vodopyanov S.O.¹, Pisanov R.V.¹, Titova S.V.¹
Affiliations:
1. Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute
Issue: Vol 98, No 4 (2021)
Pages: 434-439
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 21.09.2021
Accepted: 21.09.2021
Published: 21.09.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1091
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99
ID: 1091

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Most of the bacteria exist in natural ecosystems not in the form of free floating cells; but in the form of biofilms attached to the substrate. One of the most ecologically important substrates is chitin. Vibrio cholerae; like most members of the Vibrionaceae family; has a chitinolytic complex and can degrade chitin. The ability of V. cholerae to form a biofilm on chitinous substrates can explain the mechanism of the formation of an ecological niche for the preservation and transfer of the pathogen to new regions with the likelihood of the formation of new foci of cholera.

Aim — to determine the ability of V. cholerae to form a biofilm on the chitinous shell of crayfish (Astacus astacus) by means of real-time PCR.

Materials and methods. A comparative analysis of the timing of biofilm formation by V. cholerae of different serogroups and toxigenicity was carried out.

Results. In the course of the study; it was found that cholera vibrios were shown to be capable of forming a biofilm regardless the serogroup and toxigenicity. However; toxigenic tcpA⁺ strains have a higher intensity of biofilm formation than nontoxigenic ones; in which the tcpA gene is absent.

Keywords

Vibrio cholerae, biofilm, chitin, biofilm formation index

Full Text

Введение

В результате накопленных к настоящему времени экспериментальных данных некоторые исследователи стали рассматривать планктонную форму как способ перемещения микробной клетки от одной поверхности к другой, т.е. как кратковременное состояние в жизни бактерий [1]. В настоящее время известно, что большинство бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а в виде прикреплённых к субстрату биопленок [1]. Формирование биоплёнки — одна из стратегий выживания Vibrio cholerae, которая ассоциируется с повышенной стрессоустойчивостью, расширением доступа к питательным веществам и использованием её в качестве средства для распространения, когда возбудитель холеры прикрепляется к живым мобильным хозяевам [2].

M. Sultana и соавт. (2018), проводя исследования поверхностных водоёмов, пришли к выводу, что биоплёнки являются средством персистенции и неотъемлемой частью годового жизненного цикла V. cholerae в Бангладеш. При мониторинге поверхностных водоёмов в течение года авторы установили, что в весенне-летний период V. cholerae находятся в планктонной форме, и это совпадает с ежегодными сезонными вспышками холеры в этом регионе [3]. По данным F. Yildiz (2009), D. Srivastava (2012), переход от свободного плавания к прикреплённому образу жизни [4][5] усиливает природную компетентность и горизонтальный перенос генов [6], а также обеспечивает повышенную защиту от хищников [7].

Особую роль в сохранении V. cholerae в водных экосистемах играют хитиновые покрытия членистоногих, некоторых диатомовых водорослей и грибов, на поверхности которых вибрион способен существовать в виде биоплёнки. Хитин — один из наиболее распространённых в природе полисахаридов. Эволюционно хитин для вибрионов служит основным питательным субстратом, а сформированные на его поверхности биоплёнки служат местом их обитания и убежищем от неблагоприятных факторов окружающей среды. Известно, что для человека биоплёнки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязнённой планктоном воды или термически необработанных морепродуктов [8–12]. Несмотря на то что в последние десятилетия получены обширные экспериментальные знания о биоплёнках V. cholerae, до сих пор нет простых и доступных методов для оценки способности формирования V. cholerae на поверхности хитина.

Цель работы — оценка способности V. cholerae формировать биоплёнку на поверхности хитинового панциря речного рака (по показателю биоплёнкообразования — ПБ) методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Материалы и методы

Для определения способности V. cholerae формировать биоплёнку был разработан метод с использованием хитина широкопалого речного рака Astacus astacus в качестве биотического субстрата¹.

Фрагменты хитинового панциря речного рака размером 0,5 × 0,5 см и массой 100 мг помещали во флаконы (100 мл) с 30 мл речной воды и автоклавировали при 132о С 30 мин. Штаммы V. cholerae El Tor ctxА⁺tcpА⁺ № Р-19613 (Инаба), № 5879 (Инаба), № 18332 (Огава), № 19241 (Инаба); ctxА^–tcpА^– № 19754 (Инаба), № 20000 (Огава), № 17817 (Инаба); V. cholerae classical ctxА⁺tcpА⁺ № 434 (Огава) и V. cholerae nonO1/nonO139 ctxА^–tcpА^– № 30, выделенные в разные годы от людей и из воды поверхностных водоёмов, добавляли в среду культивирования до конечной концентрации 10⁴микробных клеток (МК) на 1 мл. Работу проводили в соответствии с требованиями биологической безопасности². Исследуемые штаммы V. cholerae культивировали при 15 ± 2ºС, что соответствует весеннеосенней температуре в поверхностных водоёмах в Ростове-на-Дону.

Для постановки ПЦР фрагменты хитина извлекали пинцетом, трижды промывали в физиологическом растворе, несвязавшиеся клетки удаляли на листе фильтровальной бумаге и вносили в стандартные пробирки (Эппендорф) ёмкостью 1,5 мл с 1 мл физиологического раствора. Лизис клеток, включая образцы биоплёнок, проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09³. Полученные препараты использовали для постановки ПЦР-РВ. С целью определения количества клеток вибрионов при проведении ПЦР-РВ были использованы образцы с известным количеством искомой ДНК — стандарты, в качестве которых использовали разведения взвесей суточных культур V. cholerae с известной концентрацией клеток, которую определяли путём высева на агаровые пластины и последующего подсчёта КОЕ. Количество клеток в исследуемых препаратах рассчитывали автоматически с помощью программного обеспечения амплификатора «DTlite 5S1» (ДНК-технология). В качестве мишени амплификации использовали ген hlyA [13][14]. ПБ рассчитывали как отношение количества МК V. cholerae на фрагменте хитинового панциря к их количеству в среде инкубации над хитиновыми пластинами.

Для визуализации экзополисахарида (основного компонента матрикса биоплёнки) и клеток V. cholerae фрагменты хитинового панциря с биоплёнкой отпечатывали на предметном стекле с помощью пинцета, после чего фрагменты хитина погружали в дезинфицирующий раствор, а покровное стекло с мазком-отпечатком фиксировали в 96о спирте в течение 20 мин. Препараты окрашивали конго красным и фуксином (оба «Интерхим»). В качестве контроля использовали планктонную форму штаммов. Исследуемые образцы изучали в световом микроскопе «Zeiss Axiostarplus» («Carl Zeiss Microscopy»).

Наличие/отсутствие роста исследуемых штаммов параллельно подтверждали бактериологическим методом, отпечатывая фрагменты хитинового панциря с биоплёнкой на агаровых пластинах (агар Мартена, рН 7,4 ± 0,2).

Результаты

В ходе исследования установили, что у большинства токсигенных штаммов V. cholerae, выделенных от человека, начало образования биоплёнки происходило со 2-х суток от начала эксперимента. ПБ этих штаммов на 2-е сутки составлял 1,0–1,7. На 6–7-е сутки от начала эксперимента количество МК на хитиновом панцире превышало их количество в планктоне (2,4–8,1). Исключение составили штаммы V. cholerae El Tor № 5879 ctxА⁺tcpА⁺, V. cholerae classical № 434 ctxА⁺tcpА⁺, у которых максимальное количество МК на хитиновом субстрате отмечали на 35-е сутки от начала эксперимента (3,0 и 7,5 соответственно). Интересно, что эти штаммы относятся к разным сероварам (Инаба и Огава). У штаммов ctxА⁺tcpА⁺ водного происхождения на 2-е сутки от начала эксперимента этот показатель был ниже — 0,5–0,8. К 7-м суткам инкубации ПБ токсигенных штаммов, выделенных из воды, значительно превышал этот показатель штаммов ctxА⁺, выделенных от человека (3,5–8,1).

У штаммов V. cholerae El Tor ctxА^–tcpА^– и V. cholerae nonO1/nonO139 водного происхождения количество МК на хитиновом панцире превышало количество МК в субстрате также на 6–7-е сутки, однако ПБ были значительно ниже, чем у токсигенных штаммов (0,1–1,7). Возможно, данный процесс у этих штаммов остановился на стадии обратимой адгезии. В течение срока наблюдения ПБ изменялся (уменьшался или увеличивался; таблица), следовательно, биоплёнкообразование — это динамичный процесс.

ПБ V. cholerae на хитиновом панцире речного рака
Biofilm formation index of V. cholerae on the chitinous carapace of crayfish

Штамм Strain name	Номер Number	Наличие генов ctx и tcp Presence of ctx and tcp gene	Объект выделения Source of isolation	Срок инкубации, сут Incubation time, days
Штамм Strain name	Номер Number		Объект выделения Source of isolation	1	2	5	6	7	17	20	25	35
01 El Tor	5879	ctxA⁺tcpA⁺	Человек Human	0,5	1,0	0,9	1,1	0,4	0,8	0,8	0,8	3,0
01 El Tor	18332	ctxA⁺tcpA⁺	Человек Human	0,2	1,7	1,2	0,6	2,4	0,8	0,6	0,5	0,5
01 El Tor	19613	ctxA⁺tcpA⁺	Вода Water	0,3	0,8	0,4	0,5	3,5	1,3	1,0	2,4	1,0
01 El Tor	301	ctxA⁺tcpA⁺	Вода Water	0,4	0,5	1,4	1,7	8,1	3,2	2,7	0,6	0,3
01 classical	434	ctxA⁺tcpA⁺	Человек Human	0,2	1,4	0,9	2,5	1,1	3,0	2,5	2,1	7,5
01 El Tor	19754	ctxA^-tcpA^-	Вода Water	0,2	0,4	0,4	0,1	0,4	0,2	0,4	0,3	0,2
01 El Tor	17817	ctxA^-tcpA^-	Вода Water	0,03	0,1	0,1	0,3	0,1	0,3	0,2	0,2	0,1
01 El Tor	20000	ctxA^-tcpA^-	Вода Water	0,1	1,1	1,2	1,2	1,7	0,9	1,0	0,7	0,7
nonO/nonO139	30	ctxA^-tcpA^-	Вода Water	0,3	1,2	0,3	1,7	0,5	0,6	0,2	0,3	0,3

При визуализации мазков-отпечатков к 7-м суткам у токсигенных штаммов на всех микропрепаратах отмечали крупное скопление клеток V. cholerae, окружённых аморфным веществом (экзополисахаридом), окрашенным в ярко-розовый цвет, без чёткой формы, т.к., наслаиваясь друг на друга, они образовывали разного размера конгломераты (рис. 1, а).

Нетоксигенные V. cholerae образовывали скопления разных размеров, окружённые аморфным веществом розового цвета по всему полю зрения, однако размеры скоплений клеток и окраска экзополисахарида были менее интенсивными, чем у токсигенных штаммов (рис. 1, б). В контрольных пробах (планктонная форма) в микропрепаратах наблюдали единичные клетки V. cholerae (рис. 2).

Рис. 1. Биоплёнка V. cholerae на хитиновом фрагменте, ×1600. а — V. cholerae № 19613 ctxА+tcpА+; б — V. cholerae № 20000 ctxА– tcpА– . Fig. 1. V. cholerae biofilm on a chitinous fragment, ×1600. а — V. cholerae No. 19613 ctxA⁺tcpA⁺; b — V. cholerae No. 20000 ctxA^–tcpA^–.

Рис. 2. Планктонная форма V. cholerae, ×1600. а — V. cholerae № 19613 ctxА+tcpА+; б — V. cholerae № 20000 ctxА– tcpА– . Fig. 2. Planktonic form of V. cholerae, ×1600.
а — V. cholerae No. 19613 ctxA⁺tcpA⁺; b — V. cholerae No. 20000 ctxA^–tcpA^–.

Ранее нами было проведено электронно-микроскопическое исследование образцов биоплёнок V. cholerae O1 El Tor Inaba штамм № Р-19613 ctxA⁺tcpA⁺ и V. cholerae O1 El Tor Ogava штамм № Р-20000 ctxA^–tcpA^–. Сравнительный анализ электронограмм показал, что образование биоплёнки на поверхности хитина у V. cholerae происходит независимо от наличия генов токсин-корегулируемых пилей адгезии tcpA и холерного токсина ctxA, однако интенсивность биоплёнкообразования у данных штаммов различна [15].

Обсуждение

Исходя из полученных данных, токсигенный штамм V. cholerae О1 ctxA⁺tcpA⁺ обладает большей интенсивностью биоплёнкообразования, чем штаммы V. cholerae О1 ctxA^–tcpA^–. На это указывают большая толщина биопленки, объём, плотность матрикса и активность их метаболических процессов.

Такая разница в структурных образованиях биоплёнок между токсигенными и нетоксигенными штаммами, выявленная при изучении в световом микроскопе и методом трансмиссионной электронной микроскопии, свидетельствует о том, что их образование зависит в значительной степени от наличия tcpА в геноме штаммов V. cholerae, взятых в эксперимент. Это согласуется с выводами ряда авторов о большей биоплёнкообразующей способности штаммов tcpА⁺, что указывает на эпидемическую опасность биоплёнкообразования [15–19].

Заключение

Таким образом, представленные результаты подтверждают возможность использования методических приёмов, предлагаемых в работе, для оценки способности V. cholerae формировать биоплёнку на биотических субстратах. Способность токсигенных штаммов V. cholerae колонизировать поверхность хитиновых субстратов может привести к накоплению возбудителя в поверхностных водоёмах в случае завоза с эндемичных по холере территорий. Полученные результаты могут быть использованы как в фундаментальных научных исследованиях, так и в практических целях для дополнительной оценки патогенетического и персистентного потенциала штаммов V. cholerae.

1. Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Меньшикова Е.А., Курбатова Е.М., Титова С.В. Способ моделирования биопленок формируемых Vibrio cholerae О1 серогруппы на поверхности хитина. Патент РФ № 2685878; 2019.

2. СП 1.3.3118-13. Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности). М.; 2014.

3. МУ 1.3.2569-09. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности. М.; 2010.