Mechanism of persistence of indigenous bifidobacteria under the impact of acetate in the human colon biotope

Cover Page


Cite item

Abstract

Aim. To determine the role of the acetate in the persistence of indigenous bifidobacteria in the colon biotope through the lysozyme resistance in model conditions of the acetylation–deacetylation of peptidoglycan.

Materials and methods. The study was performed on 16 strains of the two indigenous bifidobacteria speсies: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum subsp. longum. Bifidobacteria was cultivated in the 0.6% O2 and 9% CO2 atmosphere at the temperature 37ºС in CO2 incubator for 48 hours. The production of the acetate by the bifidobacteria was determined by gas chromatography. The effect of the acetate on the lysozyme resistance of non-indigenous gram-positive bacteria was determined on the Listeria monocytogenes ICIS-280 model strain by the cultivation in LB-Lennox broth with ammonium acetate added in the concentration range matching the concentrations produced by the studied bifidobacteria, in lysozyme serial dilutions at final concentrations 5 μg/ml to 40 μg/ml within 24 hours.

Results. It was found that the acetate release of Bifidobacterium longum subsp. longum was on average two times higher that of Bifidobacterium bifidum (27.0 and 14.7 mmol/liter, respectively) and was quite consistent with the concentrations of acetic acid determined in the intestinal contents (up to 50 mmol/liter). Cultivation of bifidobacteria in a medium with lysozyme, ammonium acetate and their combination did not have a significant impact on their growth parameters at the maximum used concentrations of these substances. In the test strain, the addition of ammonium acetate in the range created by bifidobacteria caused a decrease in the minimum inhibitory concentration of lysozyme by more than two times — from 40 μg/ml to less than 20 μg/ml. In the control medium without lysozyme, no inhibition of the growth of the indicator culture was observed up to the maximum concentrations of ammonium acetate.

Conclusion. The mechanism of persistence (survival) of indigenous bifidobacteria in the human intestinal biotope has been identified, which is associated with the production of acetic acid at a level that selectively suppresses lysozyme resistance of non-indigenous gram-positive microbiota viareversible deacetylation of peptidoglycan. This allows indigenous bifidobacteria to maintain a stable dominant position in the biotope.

Full Text

Введение

Среди биотопов организма человека толстый кишечник отличается исключительно высокой численностью и разнообразием микроорганизмов. Данные об их экологической структуре, механизмах и условиях формирования всё ещё характеризуются существенной неполнотой и противоречивостью. В данном биотопе обращают на себя внимание бактерии рода Bifidobacterium, которые важны для нормального функционирования пищеварительного тракта человека [1] и дискриминации в организме патогенов [2].

Главным конечным метаболитом индигенных бифидобактерий является уксусная кислота [3]. Ранее было показано, что именно её продукция предотвращает летальную инфекцию энтеропатогенных Escherichia coli [4]. Однако механизм протективного эффекта метаболитов бифидобактерий в отношении патогенной или условно-патогенной грамположительной микробиоты не изучен.

Известно, что в основе формирования симбиотических взаимодействий бактерий с хозяином лежит явление персистенции (длительного выживания микроорганизмов в организме хозяина), где ключевой биомишенью иммунитета является клеточная стенка — её пептидогликан (ПГ) [5], а разрушает ПГ фермент лизоцим. В случае грамположительных бактерий ПГ открыт для иммунной системы хозяина (не защищен). Единственный описанный к настоящему времени механизм обеспечения устойчивости грамположительных бактерий к ферментативному действию лизоцима — модификация ПГ [6].

Известны два наиболее распространённых пути такой модификации:

1) O-ацетилирование ПГ, встречающееся как у грамположительных, так и у некоторых грамотрицательных бактерий [7], обеспечивающее толерантность к лизоциму ПГ Bifidobacterium longum [8];

2) де-N-ацетилирование ПГ, выявляемое только у грамположительных бактерий.

Наше внимание обратил на себя тот факт, что де-N-ацетилазы ПГ выявлялись преимущественно у микроорганизмов, которые нельзя было отнести к резидентной микробиоте человека, в частности бацилл, клостридий [9] и листерий. Однако именно этот механизм обеспечивал основной вклад в их лизоцимрезистентность [10].

Оба механизма включали уксусную кислоту, но в разнонаправленном качестве. В случае O-ацетилирования её остаток (ацетат) присоединяется к остатку N-ацетилмурамовой кислоты ПГ, а в случае де-N-ацетилирования — отщепляется от остатка N-ацетилглюкозамина ПГ. При этом фермент де-N-ацетилаза ПГ, относящийся к 4-му семейству эстераз углеводов, подобно деацетилазе хитина, также является обратимым [11]. Поэтому избыточный ацетат в среде способен смещать равновесие реакции деацетилирования в сторону интактного ПГ. Другими словами, свободный ацетат может блокировать устойчивость к лизоциму чужеродных для кишечника человека грамположительных бактерий.

Цель исследования — определить роль ацетата в персистенции индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе через лизоцимрезистентность в модельных условиях ацетилирования–деацетилирования ПГ.

Материалы и методы

Объекты исследования

На первом этапе работы были отобраны 16 штаммов двух наиболее распространённых видов индигенных бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum subsp. longum, выделенных ранее после получения информированного согласия от условно здоровых лиц (по 1 штамму от каждого обследуемого) в лаборатории инфекционной симбиологии ИКВС УрО РАН в рамках исследования «Диагностический цитокиновый маркер бесплодия мужчин — интерлейкин 4» (протокол заседания локального комитета по биоэтике ИКВС УрО РАН от 21.04.2021 № 1). Штаммы идентифицировали по культурально-морфологическим признакам, биохимическим свойствам с использованием набора «ANAEROtest-23» («LaChema») и по белковому профилю методом MALDI-TOF на масс-спектрометре «Microflex» («Bruker Daltonics»).

Определение ацетат-продукции бифидобактериями

С целью установления диапазона концентраций ацетата, создаваемого индигенными бифидобактериями кишечника, определяли уровень его продукции in vitro методом газовой хроматографии. Бифидобактерии вносили в количестве 108 КОЕ в объёме 0,1 мл бактериальной взвеси в 0,9% растворе NaCl в 4,9 мл бульона Shaedler («HiMedia») и культивировали в СO2 -инкубаторе («Binder») при cодержании О2 0,6%, СО2 9% и температуре 37ºС в течение 48 ч. Пробы центрифугировали при 13 600g в течение 15 мин, к 500 мкл супернатанта добавляли 50 мкл 98% серной кислоты («Panreac»). Экстракцию летучих жирных кислот из образцов осуществляли в 750 мкл изобутилового спирта («SigmaAldrich»), процесс повторяли дважды. Детекцию ацетата проводили в газожидкостном хроматографе «GC-2010 Plus» («Shimadzu»), оборудованном пламенно-ионизационным детектором с капиллярной колонкой HP-FFAP («Agilent Technologies») диаметром 0,32 мм, длиной 50 м. Температура испарителя составила 240ºС; температурная программа для капиллярной колонки: 0 мин — 70ºС, 10 мин — 160ºС, 5 мин — 180ºС и 25 мин — 240ºС; температура детектора — 260ºС. В качестве газа-носителя использован гелий, скорость газа-носителя — 21 см/с. Расчёт концентраций по площадям пиков осуществляли с помощью программного обеспечения «GCsolution» («Shimadzu»).

Определение влияния ацетата на уровень лизоцимрезистентности бактерий

Устойчивость бактерий к лизоциму определяли путём культивирования в бульоне LB-Lennox с добавлением серии разведений лизоцима куриного яичного белка («Sigma») в конечных концентрациях 5–40 мкг/мл в 3 повторах.

Среди грамположительных неиндигенных бактерий в качестве индикатора нами была выбрана тест-культура Listeria monocytogenes (штамм ICIS-280), поскольку для данного вида наиболее полно описана роль де-N-ацетилазы ПГ в обеспечении устойчивости к C-лизоциму [10]. Модельные условия инкубации тест-штамма: в бульоне LB-Lennox при 37ºС в течение 24 ч в серии разведений лизоцима, идентичных указанным для бифидобактерий.

Для определения влияния ацетата на устойчивость исследуемых бактерий к лизоциму использовали нейтральную соль уксусной кислоты — ацетата аммония, добавленную в среду культивирования в диапазоне молярных концентраций ацетата, создаваемых исследованными штаммами бифидобактерий. Наличие роста тест-штамма определяли фотометрически на микропланшетном фотометре «Multiscan Ascent» при длине волны 450 нм и превышении оптической плотности (ОП) культуральной среды над таковой у контрольного стерильного бульона более чем на 0,01. Статистический анализ проводили с использованием критерия U Манна– Уитни [12] в программе «Minitab 14.1».

Результаты

Характеристика ацетат-продукции индигенных бифидобактерий

У бактерий вида B. bifidum выделение уксусной кислоты варьировало в диапазоне 6,4–38,5 ммоль/л, тогда как у штаммов, принадлежащих к B. longum subsp. longum, выделение ацетата в среднем было в 2 раза выше (p < 0,01), варьировало в пределах 11,2– 50,6 ммоль/л (таблица) и вполне соответствовало концентрациям уксусной кислоты, определённым в кишечном содержимом [13].

Характеристика продукции ацетата исследуемыми штаммами бифидобактерий (M ± m)
Characteristics of the acetate production of the studied bifidobacteria strains (M ± m)


Примечание. Выделены штаммы, подвергнутые полногеномному секвенированию.
Note. The strains with available complete genome sequences are emphazied.

В то же время максимальные уровни продукции ацетата у B. bifidum оказались на 10 ммоль/л выше среднего уровня, определённого для B. longum subsp. longum, но гомологов любого из 7 генов 2 систем активного транспорта фруктозы, маннозы и рибозы, описанных как ключевые детерминанты высокого уровня продукции ацетата бифидобактериями [4], не было выявлено ни в секвенированном ранее геноме штамма с рекордным уровнем ацетатпродукции (B. bifidum ICIS-310; NCBI BioProject accession: PRJNA345151), ни в одном из других секвенированных штаммов B. bifidum, депонированных в базах данных NCBI [14]. При этом в геноме штамма со средним уровнем продукции ацетата 28,3 ммоль/л (B. longum subsp. longum ICIS-505; NCBI BioProject accession: PRJNA379379) все данные детерминанты присутствовали в том же виде, что и в геномах типовых штаммов B. longum MC-42 и B. longum NCC2705. Данные факты показывают, что высокая интенсивность продукции уксусной кислоты бифидобактериями может быть обеспечена не только при наличии указанных в работе [4] генетических детерминант мембранного транспорта углеводов.

Влияние ацетата на лизоцимрезистентность индикаторного штамма

Для оценки влияния ацетата на лизоцимрезистентность бактерий, деацетилирующих свой ПГ, проведено определение минимальной подавляющей концентрации лизоцима у тест-штамма Listeria monocytogenes в средах с добавлением ацетата аммония и лизоцима в 3 повторах. В качестве критерия роста культуры использовали повышение ОП контрольного штамма. В средах с комбинированным добавлением лизоцима и ацетата аммония в диапазоне, создаваемом индигенными бифидобактериями, отмечено снижение МПК лизоцима для штамма-индикатора более чем в 2 раза — от 40 до менее чем 20 мкг/мл (рис. 1). Устойчивость листерий к лизоциму в контрольной среде без добавления ацетата аммония не превышала 50 мкг/мл (положительный контроль). В контрольной среде без лизоцима (отрицательный контроль) не отмечено ингибирования роста индикаторной культуры вплоть до максимальных концентраций добавляемого ацетата аммония (50 ммоль/л).

Рис. 1. Влияние ацетата аммония на минимальную подавляющую концентрацию лизоцима индикаторного штамма Listeria monocytogenes ICIS-280.
Fig. 1. Effect of the ammonium acetate on lysozyme minimum inhibitory concentration of the model strain Listeria monocytogenes ICIS-280.

Таким образом, полученный результат согласуется с описанным эффектом обратимости реакции деацетилирования углеводов [11]. Избыток ацетата в среде смещает реакцию деацетилирования ПГ бактерий в сторону исходного (нативного) состояния, чувствительного к лизоциму. Обнаружено, что ацетат, продуцируемый бифидобактериями, индигенными для биотопа, в условиях физиологических значений кислотности также способен реализовать описанный эффект на модельной системе — тест-культуре де-N-ацетилирующих свой ПГ бактерий.

Характеристика лизоцимрезистентности индигенных бифидобактерий

Культивирование исследуемых штаммов индигенных бифидобактерий (ICIS-216, ICIS-310, ICIS-505) в среде с лизоцимом и ацетатом аммония не показало существенного отличия их показателей роста (p > 0,05) в контрольном бульоне от таковых в среде с добавлением максимальных использованных концентраций данных веществ (40 мкг/мл лизоцима и 50 ммоль/л ацетата аммония): 1,07 ± 0,05 и 1,01 ± 0,03 ед. ОП у штамма ICIS-216; 0,72 ± 0,07 и 0,8 ± 0,05 ед. ОП у штамма ICIS-310; 0,63±0,2 и 0,63±0,6 ед. ОП у штамма ICIS-505 соответственно.

Полученные данные свидетельствуют, что устойчивость к лизоциму у индигенных бифидобактерий не связана с наличием ацетата в среде, что согласуется с механизмом обеспечения их лизоцимрезистентности при O-ацетилировании ПГ — избыток ацетата в среде не оказывает подавляющего влияния на реакцию ацетилирования.

Обсуждение

Совокупность полученных данных свидетельствует, что продукция ацетата индигенными бифидобактериями обеспечивает не только уже известную устойчивость биотопа к ряду грамотрицательных патогенов, но и осуществляет дискриминацию неиндигенных грамположительных бактерий. При этом требуемый уровень данной продукции обеспечивается не только штаммами-носителями известных детерминант систем активного транспорта фруктозы, маннозы и рибозы, но и наблюдается у некоторых штаммов широко распространённого в кишечнике человека вида B. bifidum, не обладающего ими.

Проведённый анализ позволил нам составить схему механизма персистенции индигенных бифидобактерий (рис. 2):

1. Попадая в пищеварительный тракт, ПГ грамположительных бактерий напрямую контактирует с лизоцимом хозяина. Микроорганизмы с нативным, немодифицированным, ПГ элиминируются [15] — «первичный фильтр» микросимбионтов.

2. В толстом кишечнике бактерии, прошедшие лизоцимный, кислотный и протеолитический фильтры, в дополнение к лизоциму хозяина встречают значительные количества ацетата, выделяемого индигенными бифидобактериями и их метаболическими ассоциантами (бактероидами) [3]. Присутствие ацетата в среде смещает равновесие обратимой реакции деацетилирования [11], катализируемой де-N-ацетилазой неиндигенной микробиоты в сторону немодифицированного ПГ бактерий, что оставляет его чувствительным к действию лизоцима [10], возвращаясь к элиминации его носителей — «вторичный фильтр» микросимбионтов.

К тому же, как показано нами, этот эффект наблюдался при физиологических концентрациях ацетата, образующихся в биотопе.

3. О-ацетилирование ПГ бактерий сохраняет свою работоспособность в присутствии ацетата и обеспечивает персистенцию реализующих его микроорганизмов, включая бифидобактерии [8], которые таким образом формируют пул индигенной микробиоты данного биотопа.

Рис. 2. Схема отбора грамположительных бактерий в толстом кишечнике по механизмам их лизоцим-резистентности.
Fig. 2. Selection of gram-positive bacteria in the large intestine by the mechanism of their lysozyme resistance.

В связи с этим низкий уровень антилизоцимной активности, определяемый у бифидобактерий [2], оказывается закономерным, усиливая их селективное преимущество в толстом кишечнике. Таким образом, выделяясь в процессе катаболизма бифидобактериями, ацетат способствует изменению функционирования механизма персистенции бактерий-ассоциантов, выполняя по сути функцию регулятора лизоцимрезистентности в биотопе.

Заключение

Выявлен механизм персистенции индигенной бифидофлоры через альтернативную модификацию ПГ микроорганизмов, где ацетат является ключевым регулятором, определяющим доминантную роль бифидобактерий в кишечном биотопе хозяина, обеспечивая как первичную дискриминацию неиндигенных кишечных ассоциантов через блокирование де-N-ацетилирования их ПГ, так и сохранение индигенной грамположительной микробиоты с О-ацетилированием ПГ. Учёт роли подобного биохимического регулятора в биоценозе может способствовать повышению эффективности мер по коррекции и предупреждению дисбиотических состояний.

×

About the authors

O. V. Bukharin

Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Orenburg of Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6039-5265

Oleg V. Bukharin — D. Sci. (Med.), Academician of the RAS, scientific director

Orenburg

Russian Federation

S. V. Andryuschenko

Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Orenburg of Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: rattus000@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1691-7588

Sergey V. Andryuschenko — Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of biomonitoring and molecular genetic researches

Orenburg

Russian Federation

N. B. Perunova

Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Orenburg of Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6352-8879

Natalia B. Perunova — D. Sci. (Med.), Professor of RAS, leading researcher (with the duties of the Head of the laboratory), Laboratory of biomonitoring and molecular genetic researches

Orenburg

Russian Federation

E. V. Ivanova

Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg Federal Research Center, Orenburg of Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4974-8947

Elena V. Ivanova — D. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of biomonitoring and molecular genetic researches

Orenburg

Russian Federation

References

  1. Ventura M., Turroni F., Lugli G.A., van Sinderen D. Bifidobacteria and humans: our special friends, from ecological to genomics perspectives. J. Sci. Food Agric. 2014; 94(2): 163–8. https://doi.org/10.1002/jsfa.6356
  2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б, Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. Екатеринбург; 2014.
  3. Rios-Covian D., Cuesta I., Alvarez-Buylla J.R., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., de Los Reyes-Gavilán C.G. Bacteroides fragilis metabolises exopolysaccharides produced by bifidobacteria. BMC Microbiol. 2016; 16(1): 150. https://doi.org/10.1186/s12866-016-0773-9
  4. Fukuda S., Toh H., Taylor T.D., Ohno H., Hattori M. Acetateproducing bifidobacteria protect the host from enteropathogenic infection via carbohydrate transporters. Gut Microbes. 2012; 3(5): 449–54. https://doi.org/10.4161/gmic.21214.
  5. Vollmer W., Blanot D., de Pedro M.A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 2008; 32(2): 149–67. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00094.x
  6. Андрющенко С.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В. Молекулярные механизмы взаимодействия бактерий с лизоцимом и их роль в микросимбиоценозе. Успехи современной биологии. 2015; 135(5): 453–63.
  7. Pfeffer J.M., Strating H., Weadge J.T., Clarke A.J. Peptidoglycan O acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. J. Bacteriol. 2006; 188(3):902–8. https://doi.org/10.1128/jb.188.3.902-908.2006
  8. Sakurai T., Hashikura N., Minami J., Yamada A., Odamaki T., Xiao J.Z. Tolerance mechanisms of human-residential bifidobacteria against lysozyme. Anaerobe. 2017; 47: 104–10. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2017.05.001
  9. Ho T.D., Williams K.B., Chen Y., Helm R.F., Popham D.L., Ellermeier C.D. Clostridium difficile extracytoplasmic function σ factor σV regulates lysozyme resistance and is necessary for pathogenesis in the hamster model of infection. Infect. Immun. 2014; 82(6): 2345–55. https://doi.org/10.1128/IAI.01483-13.
  10. Rae C.S., Geissler A., Adamson P.C., Portnoy D.A. Mutations of the Listeria monocytogenes peptidoglycan N-deacetylase and O-acetylase result in enhanced lysozyme sensitivity, bacteriolysis, and hyperinduction of innate immune pathways. Infect. Immun. 2011; 79(9): 3596–606. https://doi.org/10.1128/iai.00077-11
  11. Aragunde H., Biarnés X., Planas A. Substrate recognition and specificity of chitin deacetylases and related family 4 carbohydrate esterases. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(2): 412. https://doi.org/10.3390/ijms19020412.
  12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Медгиз; 1962.
  13. Sze M.A., Topçuoğlu B.D., Lesniak N.A., Ruffin M.T. 4th, Schloss P.D. Fecal short-chain fatty acids are not predictive of colonic tumor status and cannot be predicted based on bacterial community structure. mBio. 2019; 10(4): e01454-19.
  14. Андрющенко С.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В., Бекпергенова А.В. Генетическая характеристика адаптивного потенциала бифидобактерий биотопа дистального отдела кишечника человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(4): 4–11. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-4-11
  15. Davis KM, Weiser JN. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 2011; 79(2): 562–70. https://doi.org/10.1128/IAI.00651-10.

Copyright (c) 2021 Bukharin O.V., Andryuschenko S.V., Perunova N.B., Ivanova E.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies