Application of ultrafiltration membranes for purification and concentration of Sabin poliovirus type 1

A. A. Kovpak; Ковпак А. А.; Yu. Yu. Ivin; Ивин Ю. Ю.; A. N. Piniaeva; Пиняева А. Н.; Yu. Kh. Khapchaev; Хапчаев Ю. Х.; S. V. Ozherelkov; Ожерелков С. В.; A. V. Belyakova; Белякова А. В.; A. A. Ishmukhametov; Ишмухаметов А. А.

doi:10.36233/0372-9311-94

Application of ultrafiltration membranes for purification and concentration of Sabin poliovirus type 1

Authors: Kovpak A.A.¹, Ivin Y.Y.¹, Piniaeva A.N.¹, Khapchaev Y.K.¹, Ozherelkov S.V.¹, Belyakova A.V.¹, Ishmukhametov A.A.¹^,2
Affiliations:
1. Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences
2. I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)
Issue: Vol 98, No 2 (2021)
Pages: 135-143
Section: ORIGINAL RESEARCHES
Submitted: 29.04.2021
Accepted: 29.04.2021
Published: 29.04.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1018
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-94
ID: 1018

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Since the development of inactivated polio vaccines, different stages of the production process have been changed and improved. Current production of inactivated polio vaccines based on both wild and attenuated strains includes several technological stages, one of which is the concentration of the virus-containing liquid, which ensures poliovirus concentration, and purification of the virus-containing liquid from a significant part of the ballast components.

Research objective is to compare the characteristics of ultrafiltration membranes and select the membranes that provide optimal value of purification and concentration of poliovirus type 1 (Sabin strain).

Materials and methods. Laboratory ultrafiltration systems from two manufacturers with 50, 100, and 300 kDa membranes were used for the concentration. Results were evaluated by the content of total protein, which is the main stress for the subsequent purification stages, the value of infectious virus titer in the concentrate, and the content of D-antigen as the target product.

Results and discussion. Obtained results demonstrated that the content of the target product (the highest D-antigen content) and purification from impurity proteins (the total protein content in the concentrate) were most optimal when a membrane with a cut-off of 300 kDa was used for concentration. The study also evaluated the real cut-off components by various membranes to determine the composition of the protein load on the target product.

Conclusion. In terms of quality of the resulting target product and the manufacturability of the production process, the use of a 300 kDa membrane is the most appropriate when working out the technology for manufacturing inactivated polio vaccine based on Sabin strains of poliovirus and the Vero line as a producing culture.

Keywords

ultrafiltration, concentration, inactivated polio vaccine, oral polio vaccine, poliomyelitis

Full Text

Введение

История результативной борьбы с полиомиелитом насчитывает более 60 лет со времени создания моно-, би- и трехвалентных инактивированных и живых вакцин [1].

Использование этих вакцин с середины 1950– 1960-х гг. позволило не только снизить заболеваемость полиомиелитом по всему миру, но и начать реализацию программы по искоренению этого заболевания [1]. Наиболее широко оба вида вакцин применялись в форме трехвалентных препаратов.

Присутствие в пероральной полиомиелитной вакцине живых аттенуированных штаммов полиовируса в редких случаях приводит к возникновению вакциноассоциированного паралитического полиомиелита или к вспышкам циркулирующего вакцинно-родственного полиовируса [2]. Для исключения подобных рисков большинство экономически развитых стран либо полностью перешли на использование только инактивированной полиомиелитной вакцины (ИПВ), либо применяют её в комбинации с пероральной полиомиелитной вакциной [1].

Для производства ИПВ до сих пор многие производители используют высоковирулентные (дикие) штаммы полиовируса. Всемирная организация здравоохранения в целях повышения биобезопасности процесса приготовления ИПВ рекомендует использовать в качестве вакцинных штаммов аттенуированные штаммы полиовируса, которые способны индуцировать нейтрализующие антитела как к аттенуированным, так и к диким штаммам вируса [3].

Производство ИПВ включает несколько стадий:

наработка клеточной и вирусной биомассы из чувствительных к вакцинным штаммам полиовируса культур клеток;
фильтрация и концентрирование вируссодержащей жидкости (ВСЖ);
очистка и инактивация вируса формальдегидом [4].

Традиционно для культивирования клеточных линий используют различные питательные среды с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в качестве ростового фактора. Это приводит к тому, что в составе ВСЖ находятся различные белки сывороточного происхождения, клеточные компоненты и производные питательной среды, составляющие основную белковую нагрузку на дальнейшую стадию очистки вакцинного полуфабриката.

Для грубой очистки ВСЖ от вышеперечисленного балласта применяют осветляющую и стерилизующую фильтрации [4].

Полученный фильтрат концентрируют. Процесс концентрирования проводят с использованием тангенциальной ультрафильтрации (УФ). Эта стадия получения вакцины является одной из основных стадий производства ИПВ, поскольку позволяет не только сконцентрировать вирус полиомиелита, но и очистить ВСЖ от значительной части балластных компонентов. Принципиальная схема установки для ультрафильтрации и пример потоков жидкости в мембранах кассетного типа представлены на рис. 1.

Рис. 1. Схема ультрафильтрации.

a — принципиальная схема установки для ультрафильтрации: 1 — питающий насос; 2 — рециркуляционный насос; 3 — линия фильтрата; 4 — линия концентрата.
б — направление потоков жидкости в кассете: 1 — исходная жидкость; 2 — концентрат; 3 — фильтрат.
Fig. 1. Ultrafiltration scheme.
a — schematic diagram of the ultrafiltration system: 1 — feed pump; 2 — recirculation pump; 3 — filtrate; 4 — concentrate.
b — example of cassette flow path: 1 — initial liquid; 2 — concentrate; 3 — filtrate.

Для УФ различных биопродуктов используют мембраны с широким диапазоном по НОММ (номинальное отсечение по молекулярной массе), которое определяет мельчайший белок, отсекаемый мембраной: от 5 до 300 кДa, однако для концентрирования вируса полиомиелита как в лабораторных, так и в промышленных масштабах применяют УФ-мембраны с отсечением 100 кДа [5–7].

Нами не обнаружены исследования в области подбора современного УФ-оборудования для концентрирования вируса полиомиелита. В зарубежной научной литературе имеются публикации, связанные с концентрированием вируса полиомиелита с помощью центрифугирования [8] или с применением устаревших методов ультрафильтрации, без подробного описания и анализа [9–11]. В отечественной научной литературе встречаются обзоры [12] и публикации о сравнительном анализе УФ-мембран для очистки и концентрирования других вирусов, например вируса гриппа [13].

Цель настоящей работы — подбор УФ-мембраны, обеспечивающей оптимальные показатели очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 (штамм Сэбина). Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

провести сравнительную оценку характеристик УФ-мембран разных производителей;
оценить влияние на качество целевого продукта мембран с разными показателями по отсечению;
сравнить фактическое отсечение компонентов ВСЖ различными мембранами для определения состава белковой нагрузки на целевой продукт.

Качество получаемого концентрата оценивали:

по количеству общего белка, составляющего основную нагрузку на последующие стадии очистки;
по количеству инфекционного титра вируса в концентрате, позволяющего определить степень концентрирования;
по содержанию D-антигена (специфические структуры на поверхности вирусной частицы [14], способные вызывать индукцию нейтрализующих антител) как целевого продукта, определяющего потенциал ИПВ.

Материалы и методы

Для проведения работ по концентрированию использовали две лабораторные УФ-системы двух производителей: кассеты немецкой фирмы (I) с мембранами 100 кДа и автоматизированную систему американской фирмы (II) с мембранами 50, 100 и 300 кДа. Сравнительная характеристика УФ-мембран представлена в табл. 1. Процессы концентрирования вирусного сбора проводили в соответствии с условиями производителей.

Таблица 1. Характеристика УФ-мембран
Table 1. Characteristics of ultrafiltration membranes

Показатель Parameter	УФ-мембрана I Membrane I	УФ-мембрана II Membrane II
Площадь фильтрующей поверхности, см²Surface area of the filtration, cm²	200	50
Минимальный рабочий объем, мл Minimal working volume, ml	20	15
Мёртвый объем мембраны, мл Dead volume of the membrane, ml	5,3	3,2
Материал Material	Полиэфирсульфон Polyethersulfone	Полиэфирсульфон Polyethersulfone
Размер пор мембран, мкм	~0,1	~0,1

Для репродукции вируса полиомиелита использовали перевиваемую культуру клеток линии Vero (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). Наработку культуры-продуцента проводили в спиннерных колбах («Bellco») рабочим объемом 3 л в условиях псевдосуспензии. В качестве микроносителей использовали «Cytodex 1» («GE Healthcare») в концентрации 3 г/л.

Клетки выращивали в питательной среде Игла МЕМ (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот»). Для получения вирусной суспензии использовали аттенуированный штамм Сэбина полиовируса типа 1 — LSc, 2аb (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). Множественность заражения клеток составляла 0,02 ТЦД₅₀ (тканевая цитопатогенная доза) на клетку. Получены две серии ВСЖ (титры 5,0 и 7,52 ТЦД₅₀/мл) для достижения целей работ, описанных выше.

Осветляющую и стерилизующую фильтрацию вирусного сбора проводили через 50–55 ч после заражения с использованием вакуумных бутылочных фильтров «Steritop» («Merсk Millipore») с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм. Перед проведением фильтрации ВСЖ отделяли от осадка частиц микроносителя декантированием.

Специфическую активность вируса определяли по стандартной методике на культуре клеток Hep-2 Цинциннати. Выражали титр в lg ТЦД₅₀/мл¹.

Концентрацию общего белка определяли по методике Лоури без осаждения².

Присутствие бычьего сывороточного альбумина в образцах определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по общепринятой методике³.

Образцы концентратов и фильтратов с каждого этапа концентрирования (50, 100, 300 кДа) подвергали электрофорезу по методу Лэмли в присутствии додецилсульфата натрия³. Разделённые в 12% полиакриламидном геле белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида («GE Healthcare»). Для предотвращения неспецифического связывания антител мембрану промывали блокирующим раствором (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05% Tвин 20, 5% сухое молоко), затем инкубировали с первичными антителами (табл. 2), которые связываются с исследуемым белком. Мембрану промывали для удаления всех несвязанных первичных антител и инкубировали с конъюгированными вторичными антителами (табл. 2), которые связываются с первичными антителами. Мембрану промывали для удаления всех несвязанных вторичных антител и инкубировали с субстратом ECL-Plus («GE Healthcare»), который реагирует с конъюгированными вторичными антителами для обнаружения расположения белка. Хемилюминесцентное излучение экспонировали на рентгеновскую пленку («Kodak»).

Таблица 2. Характеристика первичных и вторичных антител
Table 2. Characteristics of primary and secondary antibodies

Первичные антитела Primary antibodies	Молекулярная масса, кДа Molecular weight, kD	Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена Secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase
Кроличьи моноклональные антитела к гамма-актину (разведение 1 : 2500) Anti-actin rabbit monoclonal antibodies (dilution 1 : 2,500)	42	Антикролик (разведение 1 : 25 000) Anti-rabbit (dilution 1 : 25,000)
Поликлональные козьи антитела к a-Nup 96 (C-20) sc 27400 (разведение 1 : 1000) a-Nup 96 (C-20) sc 27400 goat polyclonal antibodies (dilution 1 : 1,000)	96	Курица-антикоза (разведение 1 : 1000) Chicken anti-goat (dilution 1 : 1,000)
Кроличьи моноклональные антитела к eiF4G (разведение 1 : 1000) eiF4G rabbit monoclonal antibodies (dilution 1 : 1,000)	170	Антикролик (разведение 1 : 25,000) Anti-rabbit (dilution 1 : 25,000)
Мышиные моноклональные антитела к Nup 153 [QE6] (разведение 1 : 2500) Nup 153 [QE6] mouse monoclonal antibodies (dilution 1 : 2,500)	153	Антимышь (разведение 1 : 2500) Anti-mouse (dilution 1 : 2,500)

В настоящее время главным способом определения содержания D-антигена в ИПВ является иммуноферментный анализ [15]. Для количественного определения целевого продукта использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа в «сэндвич»-варианте на основе специфических антител класса Y яичных желтков [16].

Результаты и обсуждение

На первом этапе работ была проведена ультрафильтрация с использованием мембран двух производителей с одинаковыми показателями по отсечению.

Фильтрацию и концентрирование ВСЖ (5,0 ТЦД₅₀/мл) проводили с использованием кассет с отсечением 100 кДa двух производителей: Германии (I) и США (II). В фильтратах, полученных в результате концентрирования, инфекционных вирусных частиц и D-антигена не обнаружено. Результаты анализов полученных концентратов представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты анализов концентратов вируса полиомиелита типа 1, полученных при использовании кассет I и II с отсечением 100 кДа (M ± m)
Table 3. Results of analyses of poliovirus type 1 concentrates obtained using cassettes I and II with 100 kDa cut-off (M ± m)

Показатель Parameter	Кассета I Сassette I	Кассета II Сassette II
Титры вируса, lg ТЦД₅₀/мл Virus titers, lg TCID₅₀/ml	5,85 ± 0,45	5,7 ± 0,07
D-антиген, DU/мл D-antigen, DU/ml	10,5 ± 0,83	11,6 ± 0,51*
Содержание общего белка, мг/мл Total protein, mg/ml	5,3 ± 0,5	5,3 ± 1,1

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с кассетой I (непарный, двухвостовой t-критерий Стьюдента).
Note. *р < 0,05 compared to cassette I (unpaired, two-tailed Student’s t-test).

Титры вируса и содержание общего белка в концентратах, полученных с использованием обоих мембранных фильтров, статистически достоверно не различались. Разница в содержании D-антигена составляла не более 10%.

Полученные результаты показывают, что оба типа мембранных кассет могут быть использованы для концентрирования ВСЖ вируса полиомиелита типа 1.

На втором этапе исследований была проведена ультрафильтрация ВСЖ (7,52 ТЦД₅₀/мл) вируса полиомиелита типа 1 с использованием мембран с отсечением 50, 100 и 300 кДа (I). Содержание D-антигена в концентрате, полученном с использованием мембраны с отсечением 100 кДа, было статистически достоверно выше показателей, полученных при использовании кассет с отсечением 50 и 300 кДа (табл. 4). Титры вируса в концентратах, полученных с использованием всех трёх типов мембран, достоверно не различались. По содержанию общего белка минимальный показатель был у концентрата, приготовленного при использовании мембраны с отсечением 300 кДа. Аналогичные показатели в двух других концентратах не различались и были статистические достоверно выше.

Таблица 4. Результаты анализов концентратов вируса полиомиелита типа 1, полученных при использовании кассет с отсечением 50, 100 и 300 кДа в сравнении с исходной ВСЖ (M ± m)
Table 4. Results of analyses of poliovirus type 1 concentrates obtained using 50, 100 and 300 kD cut-off cassettes in comparison with the original viral suspension (M ± m)

Показатель Parameter	Исходная ВСЖ Original viral suspension	50 кДа/kD	100 кДа/kD	300 кДа/kD
Титры вируса, lg ТЦД₅₀/мл Virus titers, lg TCID₅₀/ml	7,52 ± 0,31	8,73 ± 0,25*	8,52 ± 0,07*	8,43 ± 0,19*
D-антиген, DU/мл D-antigen, DU/ml	11,00 ± 0,58	496,00 ± 3,05‘‘	594,00 ± 9,07*	509,00 ± 35,3*^‘
Содержание общего белка, мг/мл Total protein, mg/ml	0,81 ± 0,03	44,66 ± 4,37*‘‘	44,49 ± 1,44*‘‘	29,52 ± 0,54*

Примечание. р < 0,05 по сравнению с: *исходной ВСЖ, +отсечением 100 кДа, ++отсечением 300 кДа (непарный, двухвостовой t-критерий Стьюдента).
Note. р < 0,05 compared to: *original viral suspension; +100 kD and ++300 kD cut-off cassettes (unpaired, two-tailed Student’s t-test).

Для оценки потерь целевого продукта фильтраты, полученные во время процессов концентрирования, также были проанализированы по показателям: специфическая активность вируса, содержание D-антигена и общего белка. Содержание общего белка в фильтратах также согласовалось с данными, полученными в концентратах: 0,18 ± 0,02, 0,19 ± 0,02 и 1,38 ± 0,1 мг/мл для кассет с отсечением 50, 100 и 300 кДа соответственно. Инфекционные вирусные частицы и D-антиген в фильтратах не обнаружены.

Получаемый полупродукт с использованием мембран с отсечением 300 кДа является наиболее оптимальным с точки зрения очистки концентрата от примесных белков и оценки его чистоты. По содержанию целевого продукта полученные концентраты отличаются не более чем на 15% от концентратов, полученных при использовании мембран с отсечением 100 кДа, что позволяет использовать мембраны с отсечением 300 кДа.

Для оценки фактического отсечения клеточных и вирусных компонентов мембранами 50, 100 и 300 кДа в соответствующих фильтратах и концентратах, а также определения компонентов, составляющих основную белковую нагрузку концентратов, использовали электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн-блоттинг. Клеточные компоненты были выбраны на основании их масс в диапазоне 40–170 кДа. На рис. 2 представлены результаты вестерн-блоттинга выбранных компонентов.

Рис. 2. Вестерн-блот-анализ концентратов (С), фильтратов (F) и вируссодержащей жидкости (S) с использованием антител к α-актину (a), фактору инициации трансляции (eIF4GI) (б), нуклеопоринам Nup 96 (в) и Nup 153 (г). На рисунке указаны продукты расщепления нуклеопоринов (c.p.).

Fig. 2. Western blot analysis of concentrates (C), filtrates (F), and viral suspension (S) using antibodies to α-actin (a), eIF4GI factor (b), nucleoporins Nup 96 (с) and Nup 153 (d). Тhe figure shows the cleavage products of nucleoporins (c.p.).

Несмотря на то что актин (рис. 2, a), имеющий молекулярную массу 42 кДа и размер 4–9 нм, является глобулярным, он полностью концентрируется мембранами на 100 и 300 кДа. Вероятно, это обусловлено связыванием актина с другими компонентами ВСЖ с образованием соединений с массой, превышающей отсечения пор.

На рис. 2, в, г представлены продукты расщепления нуклеопоринов Nup 96 и Nup 153 [17] в конце полиовирусной инфекции, которые одинаково удерживаются рассматриваемыми мембранами.

Фактор инициации трансляции eIF4GI является белком, который участвует в инициации трансляции эукариот и является компонентом кэп-связывающего комплекса eIF4F. На рис. 2, б представлены продукты расщепления этого белка [18]. Только при концентрировании ВСЖ кассетой с отсечением 300 кДа небольшая часть продуктов расщепления попадает в фильтрат, а основная масса, как и в случае использования мембран с отсечением 50 и 100 кДа, собирается в концентрате.

Исходя из полученных результатов вестерн-блоттинга, можно сделать вывод о том, что, вне зависимости от показателя отсечения мембраны, подавляющая часть клеточных компонентов ВСЖ не отсекается на стадии осветляющей и стерилизующей фильтрации, а концентрируется и составляет основную белковую нагрузку на целевой продукт.

На следующем этапе исследования для детекции вирусных белков использовали поликлональные кроличьи антитела (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). На рис. 3 представлен результат вестерн-блот-анализа исследуемых концентратов и фильтратов на капсидный белок полиовируса (VP1), имеющий молекулярную массу 32 кДа [19].

Рис. 3. Капсидный белок вируса полиомиелита VP1 в концентратах (C), фильтратах (F) и ВСЖ (S).

Fig. 3. Capsid protein of the poliomyelitis virus VP1 in concentrates (C), filtrates (F) and viral suspension (S).

На представленном вестерн-блоте отчётливо видны несколько полос: молекулярной массой 32 кДа — капсидный белок полиовируса (VP1) и полосы, характерные для неспецифического связывания вторичных антител с мембраной. Присутствие в фильтратах различных белковых продуктов вирусной природы может свидетельствовать о том, что в течение полиовирусной инфекции часть вирусных единиц могла не собраться в полный вирион и находится в ВСЖ в виде различных компонентов вируса, включая инфекционную РНК.

Производители УФ-мембран предлагают пользователю очень ограниченную информацию о свойствах УФ-мембран. В табл. 5 представлена характеристика рассматриваемых мембран одного из производителей УФ-оборудования. Производитель заявляет, что мембраны с отсечением 100 кДа задерживают менее 80% альбумина, 300 кДа не задерживают и пропускают его в фильтрат, а мембраны 50 кДа способны задерживать более 95% альбумина в растворе.

Таблица 5. Характеристика мембран по отсекаемым компонентам (%)
Table 5. Characteristics of membranes by cut-off components (%)

Вещество Substance	Приблизительная молекулярная масса, кДа Approximate molecular weight, kDa	Мембрана, кДа Membrane, kD
Вещество Substance		30	50	100	300
Витамин B₁₂ Vitamin B₁₂	1,2	—	—	—	—
Бычий сывороточный альбумин Bovine serum albumin	67	—	> 95	< 80	—
γ-Глобулин γ-Globulin	169	—	> 99	> 98	< 70
Декстран Dextran	2000	—	—	—	> 95

Исходя из полученных нами данных, можно сделать предположение, что все мембраны имеют минимальные различия по индикаторному белку — альбумину (рис. 4). Все рассматриваемые мембраны задерживают сывороточный альбумин в равной степени, незначительное отличие имеется только при использовании мембраны 300 кДа.

Рис. 4. Присутствие бычьего сывороточного альбумина в концентратах (C), фильтратах (F) и вируссодержащей жидкости (S).
Fig. 4. Presence of bovine serum albumin in concentrates (C), filtrates (F), and viral suspension (S).

Заключение

Показано, что применение мембран с тем или иным отсечением не оказывает существенного влияния на основные характеристики целевого продукта. Все использованные в работе мембраны удерживали тестируемые клеточные компоненты и компоненты сыворотки вне зависимости от размера отсечения. Это может быть связано как с конформацией компонентов, что приводит к их удерживанию мембраной, так и с налипанием их на другие компоненты ВСЖ (вирусные частицы). Разница не видна и в отношении вирусных белков, проскок которых в фильтрат практически одинаков для каждого типа мембран.

Применение мембран с отсечением 300 кДа с точки зрения качества получаемого целевого продукта и технологичности производственного процесса является наиболее целесообразным для отработки технологии изготовления ИПВ с использованием вируса полиомиелита штаммов Сэбина и клеток линии Vero в качестве культуры-продуцента.

При проведении процесса ультрафильтрации с мембранами с отсечением 300 кДа процесс концентрирования занимает меньше времени, чем при тех же условиях, но с применением других мембран.

Поскольку получаемый концентрат не является конечным продуктом, а только первой стадией получения ИПВ, основные требования, предъявляемые к качеству концентрата, включают в себя показатели содержания D-антигена и титр вируса, которые сильно зависят от степени концентрирования.

Концентраты также характеризуются содержанием целевого продукта, бычьего сывороточного альбумина и общего белка. Эти компоненты составляют основную нагрузку на стадии очисток полуфабриката (гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию) и, соответственно, напрямую влияют на качество очистки получаемого полупродукта на последующих стадиях. Концентраты, полученные с использованием мембран с отсечением 300 кДа, характеризуются наименьшим содержанием бычьего сывороточного альбумина и общего белка (табл. 4). Это позволяет очистить полупродукт (после хроматографических очисток) за меньшее количество циклов и избежать потерь целевого продукта, что является важным для производственного процесса.

1. МУК 4.2.2410-08 Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП).

2. ОФС.1.2.3.0012.15. Определение белка. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV, том I.

3. ОФС.1.2.3.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV, том I.