Том 98, № 3 (2021)

Введение. Основным показателем специфической активности антител к вирусу SARS-CoV-2 является их способность нейтрализовать вирус. Тест на вируснейтрализующие антитела (ВНА) широко востребован в различных направлениях биомедицинских исследований.

Целью работы являлся подбор оптимальных условий для определения ВНА к вирусу SARS-CoV-2 по ингибированию цитопатогенного действия (ЦПД) в культуре клеток с возможностью как микроскопического, так и спектрофотометрического учёта результата.

Материалы и методы. Сыворотку крови реконвалесцентов COVID-19 и здоровых лиц (n = 96) изучали методом ИФА. Коронавирус SARS-CoV-2, штамм Dubrovka (номер GenBank: MW514307.1) выращивали в культуре клеток Vero CCL81 (ATСС). Идентификацию вируса проводили методами ОТ-ПЦР-РВ, ИФА и секвенирования по Сэнгеру. Результаты реакции нейтрализации (РН) учитывали по ЦПД микроскопически и в метилтетразолиевом (МТТ) тесте.

Результаты. От больного COVID-19 изолирован коронавирус SARS-CoV-2 и адаптирован к выращиванию в культуре клеток. При заражении низкой дозой (MOI = 0,00001) вирус вызывал выраженное ЦПД с выживаемостью клеток менее 3%, что позволяло учитывать результаты РН по ингибированию ЦПД. Сравни- тельный анализ сывороток в РН и методом ИФА показал достоверную корреляцию между титрами ВНА и титрами антител к RBD-домену S-белка (Спирмен r = 0,714; р < 0,001). Результаты определения ВНА с микроскопической и спектрофотометрической детекцией (тест МТТ) также достоверно коррелировали (Спирмен r = 0,963; р < 0,05).

Заключение. На основе адаптированного к культуре клеток Vero вируса SARS-CoV-2 разработана система оценки титра ВНА, позволяющая учитывать результат как с помощью микроскопического исследования, так и спектрофотометрически в МТТ-тесте. Применение теста МТТ позволяет автоматизировать учёт результатов РН, проводить статистическую обработку получаемых данных, снижает субъективизм при оценке результата. Являясь витальным красителем, МТТ выявляет только живые клетки, что повышает надёжность получаемых результатов по сравнению с другими красителями.

Цель исследования — определить роль ацетата в персистенции индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе через лизоцимрезистентность в модельных условиях ацетилирования–деацетилирования пептидогликана.

Материалы и методы. Исследовано по 16 штаммов двух видов индигенных бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum subsp. longum. Бифидобактерии культивировали в СO2-инкубаторе при cодержании O2 0,6%, CO2 9% и температуре 37ºС в течение 48 ч. Продукцию уксусной кислоты (ацетата) бифидобактериями выявляли методом газовой хроматографии. Влияние ацетата на устойчивость неиндигенных грамположительных бактерий к лизоциму определяли на модели штамма Listeria monoytogenes ICIS-280 путём культивирования в бульоне LB-Lennox с добавлением ацетата аммония в диапазоне концентраций, продуцируемых исследуемыми бифидобактериями, в серии разведений лизоцима в конечных концентрациях от 5 до 40 мкг/мл в течение 24 ч.

Результаты. Установлено, что у Bifidobacterium longum subsp. longum выделение ацетата в среднем было в 2 раза выше, чем у Bifidobacterium bifidum (14,7 и 27 ммоль/л соответственно), и вполне соответствовало концентрациям уксусной кислоты, определённым в кишечном содержимом (до 50 ммоль/л). Культивирование бифидобактерий в среде с лизоцимом, ацетатом аммония и их сочетанием не оказало существенного влияния на их показатели роста при максимальных использованных концентрациях данных веществ. У тест-штамма добавление ацетата аммония в диапазоне, создаваемом бифидобактериями, вызывало снижение минимальной подавляющей концентрации лизоцима более чем в 2 раза — от 40 до менее 20 мкг/мл. В контрольной среде без лизоцима не отмечено ингибирования роста индикаторной культуры вплоть до максимальных концентраций ацетата аммония.

Заключение. Выявлен механизм персистенции (выживания) индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе человека путём продукции ацетата, избирательно подавляющего лизоцимрезистентность неиндигенных грамположительных бактерий, за счёт обратимости деацетилирования пептидогликана, что позволяет индигенным бифидобактериям сохранять стабильное доминантное положение в биотопе.

Актуальность. В настоящее время проводится работа по конструированию новых диагностических и профилактических препаратов на основе бактериофагов, поэтому актуально изучение биологических свойств холерных фагов наравне с их генетической структурой. Эта информация необходима для прогнозирования жизненного цикла фага и оценки перспектив практического использования в экспериментальной деятельности, фагодиагностике или фагопрофилактике.

Материалы и методы. Наличие или отсутствие генов, характерных для умеренных бактериофагов, проверяли при помощи созданной авторами базы данных и программного обеспечения «PhageAnalyzer», позволяющего проводить быстрый анализ данных полногеномного секвенирования бактериофагов и прогнозировать их жизненный цикл.

Результаты и обсуждение. Морфологическая структура экспериментальных диагностических холерных фагов представлена головчатыми бактериофагами различных морфогрупп. Негативные колонии фагов различались по диаметру, форме и степени прозрачности. В геномах бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3 генетических детерминант факторов резистентности и токсинов не обнаружено. В результате филогенетического анализа определено, что исследованные холерные экспериментальные бактериофаги имеют сходство с головчатыми фагами из рода Vibrio, но являются уникальными, т.к. находятся «вне кластерных групп». Vibrio фаги Rostov-1 и Rostov M3 являются литическими. У холерных фагов Rostov-6 и Rostov 7 найдены гены, характерные для умеренных бактериофагов.

Заключение. Экспериментальный холерный бактериофаг Rostov-1 может быть использован для дифференциации холерного вибриона О1 серогруппы биовара El Tor, а Vibrio фаг Rostov M3 — для биовара Classical. Оба бактериофага являются литическими и перспективными компонентами для создания профилактических препаратов против холеры. Vibrio фаги Rostov-6 и Rostov 7 могут быть успешно использованы только в экспериментальной деятельности, а также при мониторинге холерных вибрионов из окружающей среды. Полные геномные последовательности зарегистрированы и доступны в международной базе GenBank (NCBI).

Цель. Изучение распространённости генотипов и геновариантов вируса Западного Нила (ВЗН) на территории юга России в 2010–2019 гг.

Материалы и методы. Для исследования использовали 311 инфицированных ВЗН образцов биологического материала от больных, переносчиков и резервуаров инфекции. Типирование ВЗН проводили посредством сконструированных 3 пар праймеров и 3 зондов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени и секвенированием участка генома ВЗН размером 277 п.н., соответствующего 5'-нетранслируемой области и локусу гена полипротеина, кодирующему капсидный белок. Анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы «Nucleotide BLAST» (NCBI).

Результаты. Из 311 РНК-изолятов ВЗН 15 (4,82%) были отнесены к генотипу 1 (из Астраханской и Волгоградской областей, Краснодарского и Ставропольского краев, Республики Татарстан), 285 (91,64%) — к генотипу 2 (из Астраханской, Волгоградской, Воронежской, Курской, Липецкой, Пензенской, Ростовской и Саратовской областей, Краснодарского и Ставропольского краёв, республик Калмыкия и Крым) и 11 (3,54%) — к генотипу 4 (из Волгоградской области, республик Калмыкия и Крым). Отмечено выраженное преобладание по частоте встречаемости вируса генотипа 2. Установлено, что выявленные изоляты возбудителя генотипа 1 относятся к астраханскому геноварианту, генотипа 2 — к российскому и европейскому геновариантам. Обнаружены ранее не встречавшиеся варианты ВЗН генотипов 1 и 4.

Заключение. В последнее десятилетие ВЗН генотипа 2 является доминирующим для юга европейской части России. Наиболее распространён российский вариант, его ареал расширяется. Циркуляция различных генетических линий ВЗН на территории России свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения их распространения, а также совершенствования диагностических методов и тест-систем для выявления и дифференциации штаммов возбудителя.

Медицинские учреждения всегда имели значение в передаче гемоконтактных инфекций. Манипуляции, сопровождающиеся образованием крови, представляют опасность в распространении гепатитов В, С и ВИЧ не только для персонала, но и для пациентов. С целью оценки значения медицинских учреждений в передаче гемоконтактных инфекций, выявления групп риска среди пациентов и факторов передачи проанализировано 75 вспышек гепатита В, С и ВИЧ, данные о которых опубликованы в разных странах в 2008–2020 гг. Проведено сравнение вспышек в США в течение 1992–2008 и 2008–2019 гг. Основной причиной вспышек гемоконтактных инфекций в медицинских учреждениях является несоблюдение медицинским персоналом стандартных профилактических мер: повторное использование изделий однократного применения; отсутствие обработки рук; повторное применение перчаток; отсутствие дезинфекции поверхностей, многоразовых приборов и устройств; отсутствие стерилизации многоразовых инструментов. К учреждениям высокого риска в отношении заражения гемоконтактными инфекциями от- носятся учреждения, проводящие гемодиализ, онкогематологические, амбулаторные учреждения, дома престарелых, интернаты, клиники, где проходят лечение пациенты с сахарным диабетом. Контингентом высокого риска являются пациенты, получающие гемодиализ, онкогематологические пациенты и пациенты с сахарным диабетом. Диагностика гемоконтактных инфекций на регулярной основе, вакцинация против гепатита В среди пациентов высокого риска, расследование вспышек, внедрение регламентов работы в сочетании с обучением и контролем приверженности персонала являются решением проблемы нозокомиальной передачи гемоконтактных инфекций.

Введение. Borrelia miyamotoi — возбудитель безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) — заболевания, широко распространённого в России. В геноме B. miyamotoi присутствуют гены десятков вариабельных основных поверхностных белков (Vmp). Vmp разделяют на два семейства — Vsp и Vlp (с подсемействами δ, γ, α и β). В конкретный момент времени отдельная B. miyamotoi экспрессирует единственный вариант гена Vmp.

Цель работы — создание методики для идентификации гена Vmp, находящегося в сайте экспрессии.

Материалы и методы. Методика реализована в формате мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Для её испытания были использованы образцы ДНК B. miyamotoi, выделенные из крови 172 больных ИКБ и 109 клещей. Образцы были собраны в 14 регионах России.

Результаты. Разработанная методика позволила идентифицировать экспрессирующийся Vmp в 82% исследованных проб, т.е. показала достаточную эффективность. Отрицательные результаты значимо реже наблюдались среди проб от больных, чем среди проб клещей. При этом доля проб с Vmp только одного типа одинакова среди клинических образцов и клещей, а доля проб, в которых детектируются одновременно два типа Vmp, значимо выше среди образцов от больных, где наиболее часто встречалась комбинация Vlp-δ и Vsp.

Обсуждение. Тот факт, что в образцах крови чаще выявляется сочетание двух типов Vmp, может говорить об одновременном присутствии нескольких субпопуляций B. miyamotoi в организме больных ИКБ. После того как к основному поверхностному белку штамма, занесённого клещом, вырабатываются протективные антитела, происходит переключение на синтез нового антигенного варианта Vmp. Такой феномен, называемый «иммунным избеганием», позволяет патогену персистировать в организме хозяина.

Заключение. Созданная методика мультиплексной ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить одновременную детекцию нескольких антигенных вариантов вариабельных основных поверхностных белков B. miyamotoi. Изучение антигенного спектра штаммов B. miyamotoi в сопоставлении с характеристикой консервативных участков генома методом мультилокусного секвенирования позволит прояснить этапы эволюции и распространения B. miyamotoi sensu lato.

.

.