Потенциал адаптации к млекопитающим вирусов гриппа птиц H7N2 североамериканской линии

Полный текст

Введение

Вирусы гриппа А подтипа Н7 ассоциируются с тяжёлыми эпизоотиями птичьего гриппа среди домашней птицы, преимущественно отряда курообразных. По вирулентным свойствам вирусы гриппа H7 подразделяются на низкопатогенные (апатогенные) и высокопатогенные [1]. Низкопатогенные вирусы бессимптомно циркулируют среди домашних и диких птиц околоводного комплекса [2, 3]. Высокопатогенные вирусы главным образом выделяют от домашних птиц, у которых они вызывают заболевание с характерными признаками и летальным исходом [4]. В период эпизоотий в неблагополучных районах высокопатогенные вирусы H7 были также обнаружены у разных видов синантропных и диких птиц [5, 6].

Случаи заражения людей вирусом Н7 были зафиксированы в ХХ в. у лиц, тесно контактировавших с больной птицей. В 2003 г. первые массовые заражения наблюдали у 82 работников птицефермы во время эпизоотии высокопатогенного гриппа Н7N7 в Нидерландах. Инфекция проявлялась в виде конъюнктивита и/или гриппоподобного заболевания в лёгкой форме, в 1 случае болезнь привела к летальному исходу [7].

В 2013–2017 гг. 5 волн эпидемии гриппа H7N9 поразили Китай. Возбудителем эпидемий оказались как низко- так и высокопатогенные вирусы гриппа птиц. За весь период было зарегистрировано 1568 заболевших, из которых 616 скончались. Источником заражения людей стали рынки живой птицы и дворовые хозяйства домашней птицы, где низкопатогенные вирусы Н7 бессимптомно присутствовали с 2013 г. [3, 6]. В 2016 г. на юге Китая (провинция Гуандун) появился высокопатогенный вирус H7, который резко отличался по свойствам и клиническим проявлениям от присутствовавших ранее и эволюционировал из предшественника одной из многочисленных линий низкопатогенного вируса Н7, циркулировавших в Китае с 2013 г. [6, 8–10].

Заболевания людей в тяжёлой лёгочной форме со смертельным исходом вызвали озабоченность ВОЗ в связи с потенциальной угрозой возникновения нового пандемического вируса подтипа Н7. Была разработана программа по противодействию возможной пандемии¹, что послужило стимулом для учёных разных стран к изучению особенностей вирусов гриппа птиц подтипа H7.

Филогенетически все вирусы подтипа Н7 разделяют на вирусы Западного полушария, Восточного полушария и линию вирусов гриппа лошадей. Среди вирусов Восточного полушария обособленно выделяется Австралийская линия вирусов. Остальные изоляты принадлежат хорошо изученной Евразийской линии и образуют многочисленные ветви на эволюционном дереве, отражающие их географическое распределение [11]. Вирусы H7 Западного полушария по НА разделяют на три больших кластера и несколько клад [12]. Исследуемый в настоящей работе вирус принадлежит кладе II-2 североамериканской линии.

Низкопатогенные вирусы Н7 вызывают бессимптомную инфекцию у диких водоплавающих птиц. Их занос в популяцию домашних птиц долгое время может оставаться незамеченным, если вирус не вызывает клинических проявлений [2, 4, 10]. Циркуляция среди домашних птиц (отряд курообразных) способствует накоплению мутаций, которые приводят к изменению вирулентности и формированию высокопатогенных вирусов [4, 8, 10, 13].

За 1959–2019 гг. в разных частях мира наблюдали 27 независимых событий происхождения высокопатогенных вирусов гриппа H7 из низкопатогенного предшественника [13].

Ведущую роль в эволюции и изменении патогенности вирусов гриппа H7 играет поверхностный белок гемагглютинин (НА), в котором находятся главные антигенные детерминанты вируса. На стадии проникновения вируса в клетку НА обеспечивает связь с клеточными рецепторами [14] и опосредует слияние вирусной и клеточной мембран [15]. Детерминантой патогенности вирусов H7 является структура сайта протеолитического расщепления предшественника НА: в апатогенных штаммах присутствует один аминокислотный остаток аргинина (R), в высокопатогенных — вставка из нескольких аминокислот с оснόвными свойствами [1, 13].

Специфичность вирусов гриппа относительно круга хозяев определяется их способностью распознавать рецепторы, характерные для определённого вида хозяина. Рецепторы птиц представляют собой сиалогликозиды с типом связи alpha2-3, а рецепторы человека (возможно, и других млекопитающих) — сиалогликозиды с типом связи alpha2-6. Структуру рецептор-связывающего кармана НА всех вирусов гриппа формируют три составляющих элемента (в нумерации Н3): петля-130 (а.к. 134–138), петля-190 (а.к.188–194) и петля-220 (а.к. 221–228). Мутации в этих участках НА приводили к адаптации вирусов к человеку и формированию пандемических штаммов подтипов H1N1 (E190D/G225D) и H2N2/H3N2 (Q226L и G228S) [14, 16].

Для межвидовой смены хозяина вирусы гриппа должны обладать способностью распознавать рецепторы нового хозяина и приспособиться к использованию клеточных факторов хозяина, которые необходимы вирусу для успешной репродукции. Мутации, способствующие адаптации к новому хозяину, в первую очередь затрагивают поверхностные белки НА и нейраминидазу (NA), белки полимеразного комплекса, а также неструктурный белок NS1. Белок NS1 ингибирует передачу сигналов противовирусной защиты хозяина и подавляет экспрессию его белков. Множественные функции NS1 осуществляет благодаря взаимодействию с белками, РНК и другими факторами хозяйской клетки, которые отличаются у разных хозяев. Отличия в первичной структуре NS1 специализированных вирусов разной хозяйской принадлежности отражают высокую пластичность этого белка, которому отводится важная роль в преодолении межвидового барьера и адаптации вируса к новому хозяину [17, 18]. Адаптированный к новым условиям вирус должен не только размножаться в новом организме, но и передаваться от одного индивидуума другому, т.е. обладать достаточно высокой контагиозностью. До сих пор не зафиксированы доказанные случаи передачи вирусов H7Nx от человека к человеку², заражение происходило при тесном контакте с источником инфекции — в основном с больной птицей.

В 1996 г. на рынках живой птицы на северо-востоке США были обнаружены низкопатогенные вирусы Н7 с делецией из 8 аминокислот (п. 221–228 в нумерации по H3) в НА — у них отсутствовала петля-220 в области рецепторсвязывающего сайта [2]. Североамериканская линия вирусов с делецией (клада II-2) циркулировала на северо-востоке США с 1996 по 2006 г. среди домашней птицы [12]. Вирусы имели сайт расщепления НА слабовирулентного фенотипа [2] и обладали двойственной специфичностью взаимодействия с рецепторами, т.е. наряду с высокой аффинностью к рецепторам «птичьего» типа (alpha2-3) они проявляли умеренное связывание с рецепторами, характерными для человека (alpha2-6) [11, 16, 19]. Существенную роль в сохранении третичной структуры НА и обеспечении двойственной рецепторной специфичности играют два аргинина — R220 и R229, оказавшиеся рядом из-за делеции п. 221–228 (в нумерации H3), как показало исследование вируса A/New York/107/2004 (H7N2) североамериканской линии (клада II-2), изолированного от человека [16].

Способность вирусов H7N2 распознавать рецепторы человеческого типа указывает на повышенный потенциал преодоления межвидового барьера и адаптацию к человеку или другим видам млекопитающих.

За время циркуляции вирусов подтипа H7N2 (1994–2006 гг.) на северо-востоке США были зафиксированы 2 лабораторно подтверждённых случая инфицирования людей этими вирусами. Позднее, c декабря 2016 г. по февраль 2017 г., в приютах для животных в Нью-Йорке наблюдали вспышку респираторной инфекции среди домашних кошек. Причиной заболевания около 500 кошек оказался низкопатогенный вирус гриппа H7N2 с делецией в НА. У ветеринара, тесно контактировавшего с больной кошкой, наблюдалась гриппоподобная инфекция. Секвенирование 6 изолятов от кошек и 1 изолята от человека показало, что все 8 сегментов кошачьих вирусов филогенетически были близки низкопатогенным вирусам кур, циркулировавшим в Нью-Йорке в конце 1990-х и начале 2000-х гг. Вирусы от кошек и человека были почти идентичны, и у них отсутствовали адаптационные мутации для млекопитающих [20, 21].

Возможность преодоления межвидового барьера вирусами H7N2 с делецией петли-220 в НА побудила нас к исследованию механизма адаптации этих вирусов к млекопитающим на примере одного из представителей этой линии — вируса A/chicken/New Jersey/294598-12/2004.

Цель работы — выяснить механизм адаптации к млекопитающим вирусов гриппа североамериканской линии H7N2 с делецией в НА.

Материалы и методы

Вирус A/chicken/NJ/294508-12/2004 (H7N2) (GenBank EU743253-EU743260), который поддерживался в куриных эмбрионах (КЭ), был любезно предоставлен доктором А.И. Климовым, CDC USA (CDC-2004708596). В результате клонирования вируса методом предельных разведений в КЭ был получен вариант A/chicken/New Jersey/294598-12/2004 (ch/NJ), который использовали в настоящей работе в качестве исходного вируса.

Адаптация вируса к размножению в лёгких белых беспородных мышей проведена, как описано ранее [25]. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Исследования на животных одобрены Комитетом по этике Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи (протокол № 12 от 28.06.2021).

Реакция гемагглютинации (РГА) проводилась по общепринятой методике [1]. 50% эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД₅₀/мл) вирусов гриппа определяли, как описано в работе [25], каждым разведением вируса заражали 5 КЭ. Среднее значение ЭИД₅₀/мл для каждого вируса вычисляли методом L.J. Reed и H. Muench [22].

Определение 50% летальной дозы (ЛД₅₀) вируса гриппа проводили на мышах линии BALB/c согласно [25], для каждого разведения вируса использовали по 6 мышей в группе. Значение ЛД₅₀/мл вычисляли по методу Кербера в редакции Ашмарина [23].

Секвенирование на платформе «MiSeq» («Illumina») выполнено сотрудниками лаборатории анализа геномов НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи О.Л. Ворониной, Е.И. Аксеновой, М.С. Кунда, Н.Н. Рыжовой (GenBank, MN400380-MN400395). Библиотеки готовили согласно [24], секвенирование выполняли на платформе «MiSeq» («Illumina») с использованием картриджа 600-cycle «MiSeq Reagent Kit v3». Сборку геномов de novo и по референсу A/chicken/NJ/294508-12/2004(H7N2) (EU743253-EU743260, GenBank) проводили в программе «CLC Genomics Workbench 10.0».

Секвенирование методом Сэнгера проведено, как описано ранее [25]. Для структурно-функционального анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали биоинформационные ресурсы The National Center for Biotechnology Information³ и Influenza Research Database⁴ (IRD).

Термостабильность НА вирусов гриппа определяли, как описано ранее [25]. Температурой инактивации считалась та, при которой после 40 мин инкубации вируса титр в РГА снижался на 6 log₂.

Значение рН активации НА определяли методом гемолиза эритроцитов [25], который основан на способности НА агглютинировать эритроциты при нейтральных значениях рН и вызывать их гемолиз при низких значениях вследствие конформационного изменения НА.

Сродство вирусов к аналогам клеточных рецепторов определяли по взаимодействию с сиалоолигосахаридами, конъюгированными с высокомолекулярным полиакриламидом, меченным биотином [14]. Использовали сиалоолигосахариды Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ (3’SLN) и Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ (6’SLN). Результаты выражали в виде константы диссоциации, рассчитанной по сиаловой кислоте (K_diss, nM SA).

Статистическая обработка данных выполнена с применением параметрического t-теста Стьюдента (рН активации и термостабильность НА), непараметрического критерия Фридмана (ANOVA) и Манна–Уитни (титр вирусов) при критическом уровне значимости p ≤ 0,05. Для проведения соответствующих расчётов использовали программы «MS Office Excel 2016» и «Statistica 8.0». Полученные результаты представлены как среднеарифметическое (рН активации и термостабильность НА) или среднегеометрическое (титр вирусов) значение со стандартным отклонением.

Результаты

Адаптация к мышам

Адаптацию вируса гриппа птиц A/chicken/NJ/294598-12/2004 (ch/NJ) к размножению в лёгких мышей проводили последовательными пассажами через лёгкие. После 10 пассажей получили вариант, который вызывал гибель мышей с обширными геморрагическими поражениями лёгких. Полученный вариант был однократно клонирован методом предельных разведений в КЭ для получения однородной вирусной популяции, назван A/chicken/NJ/294598-12MA/2004 (MA/NJ) и депонирован в Государственную коллекцию вирусов (подразделение Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) под номером 2890.

Фенотипические свойства вирусов

Исходный клонированный вариант ch/NJ накапливался в КЭ в титре 9,6 lg ЭИД₅₀, близкий титр накопления (9,7 lg ЭИД₅₀) был у адаптированного к мышам варианта MA/NJ.

Исходный ch/NJ и адаптированный к мышам MA/NJ-вариант были исследованы на патогенность для мышей, рецепторную специфичность, термостабильность вируса и значение рН активации НA (табл. 1).

 

Таблица 1. Фенотипические свойства исходного вируса A/chicken/NJ/294598-12/2004 (H7N2) (ch/NJ) и его адаптированного к мышам варианта (MA/NJ)

Table 1. Phenotypic properties of the original (ch/NJ) and mouse-adapted (MA/NJ) variants of the virus A/chicken/NJ/294598-12/2004 (H7N2)

Вирус Virus	Вирулентность* Virulence*	Термостабильность, ºС Thermostability, ºС	Значение рН активации HA# HA activation pH values#	Сродство к аналогам рецепторов, Кdiss, nm SA** Affinity for cell receptor analogues, Кdiss, nm SA**
				Fet-HRP	3’SLN	6’SLN#
ch/NJ	> 9,6 авирулентный avirulent	62,3 ± 0,2	5,2 ± 0,1	200 ± 100	100 ± 50	200 ± 50
MA/NJ	4,0 ± 0,2	62,3 ± 0,2	5,6 ± 0,1	200 ± 100	100 ± 50	500 ± 50

Примечание. Для каждого метода исследования приведены средние значения 3 независимых экспериментов.

*Вирулентность представлена как lg ЭИД₅₀ в единице ЛД₅₀.

**Результаты титрования с фетуиновым коньюгатом (Fet-HRP) и биотинилированными полимерами 3’SLN и 6’SLN представлены в виде константы диссоциации, выраженной в наномолях сиаловой кислоты. Более высокое значение соответствует меньшему сродству к рецепторным аналогам.

^#р ≤ 0,05 по критерию Стьюдента.

Note. The average values of three independent experiments are presented.

* Virulence for mice is represented as log₁₀ of EID₅₀ in one unit of LD₅₀. A lower value corresponds to a higher pathogenicity.

** The results of titration with peroxidase-labeled fetuin conjugate (Fet-HRP) and biotinylated polymers 3'SLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ) and 6'SLN (6'SLN — Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ) are presented as a dissociation constant expressed in nanomoles of sialic acid. A higher value corresponds to a lower affinity for cellular receptor analogues.

^#Significant differences according to the Student's criterion (p ≤ 0.05).

 

Исходный вирус обладал авирулентным фенотипом для мышей: мыши оставались живы после интраназального инфицирования предельно высокими дозами вируса (8,6 и 9,6 lg ЭИД₅₀ на мышь). Напротив, адаптированный вариант MA/NJ в меньших дозах (4,7 lg ЭИД₅₀ на мышь) вызывал гибель 100% животных с характерными изменениями в лёгких.

Возрастание вирулентности MA/NJ сопровождалось увеличением значения рН активации HA на 0,4 ед. по сравнению с исходным вирусом ch/NJ (табл. 1).

При определении рецепторной специфичности оба варианта вируса связывались с фетуином, что характерно для всех вирусов гриппа. Сродство к аналогу рецепторов птиц 3’SLN у них было немного выше, чем к аналогу человеческих рецепторов 6’SLN; у адаптированного варианта MA/NJ сродство к человеческому рецептору понизилось в большей степени, чем у исходного вируса ch/NJ.

Секвенирование

При секвенировании на платформе «Illumina» для некоторых позиций в сегментах 4 и 8 получены неоднозначные результаты, поэтому было проведено дополнительное секвенирование методом Сэнгера. Результаты секвенирования разными методами совпали (табл. 2). Установлено, что исходный вирус ch/NJ представлял собой гетерогенную популяцию c полиморфизмом в сегментах 4 и 8. Последовательные пассажи в лёгких мышей позволили получить гомогенную популяцию вируса с закреплением аминокислот, которые в исходном вирусе присутствовали в качестве минорных. Исключение составила п. 125/133 в НА, где наблюдали гетерогенность (F < L) в MA/NJ-варианте, отсутствующую в исходном вирусе. В адаптанте MA/NJ были обнаружены аминокислотные замены в 5 белках: по 1 в PB2, NA, NEP, 4 в HA, 6 в NS1.

 

Таблица 2. Аминокислотные различия в исходном (ch/NJ) и адаптированном к мышам (MA/NJ) вариантах вируса A/chicken/New Jersey/294598-12С/2004 (H7N2)

Table 2. Amino acid differences in the original (ch/NJ) and mouse-adapted (MA/NJ) variants of the A/chicken/New Jersey/294598-12/2004 (H7N2) virus

Белок Protein	Позиция аминокислоты Amino acid position	ch/NJ2	MA/NJ
PB2	627	E	K
HA1	125/133	F	L > F
HA	156/164	D > N	N
HA	198/207	G	E
HA	328/330	K	T
NA	127	K	N
NS1	73	N > T	T
NS1	114	S > G	G
NS1	118	K > R	R
NS1	171	G > A	A
NS1	214	F > L	L
NS1	224	R = G	R
NEP	14	E > Q	Q

Примечание. ¹Нумерация HA соответствует H3/H7. Приведена нумерация по зрелому белку HA/H3 штамма A/Aichi/2/68, для HA/H7 — по последовательности ACF25499 (GenBank).

²Преобладающая аминокислота выделена жирным шрифтом.

Note. ¹The numbering of HA corresponds to H3/H7. Numbering is given for the mature HA/H3 protein of strain A/Aichi/2/68, and for HA/H7 according to the sequence ACF25499 (GenBank).

²The ratio of alternative amino acids. The predominant amino acid is in bold font.

 

Обсуждение

Анализ аминокислотных замен в вирусных белках

В белке PB2 полимеразы замена E627K считается адаптационной к млекопитающим. Она повышает полимеразную активность вирусной полимеразы и увеличивает патогенность вируса для млекопитающих [26–28]. Можно предположить, что возрастание вирулентности для мышей варианта MA/NJ обусловлено именно этой мутацией.

Нейраминидаза обоих вариантов имеет делецию 16 аминокислот (п. 56–71)⁵ в стеблевой части молекулы. Замена K127N (143) (нумерация по QEL43992, GenBank) в NA подтипа N2 находится в головной части молекулы, выступающей на поверхности вириона, входит в состав экспериментально установленных эпитопов и отличается полиморфизмом (по данным IRD). Аминокислота 127K (143K) контактирует с аминокислотой 450F (466F) соседней цепи гомотетрамера NA. Замена аминокислоты 127K с протяжённой боковой цепью на 127N с короткой боковой цепью теоретически может повлиять на контакт соседних цепей. Для североамериканских вирусов H7N2 эта замена уникальная. Однако 127N в разные годы присутствовала в 146 природных изолятах исключительно вирусов птиц (преимущественно кур) других подтипов — H9N2 и H6N2 в Китае, непатогенных вирусах H5N2 в США и Мексике.

В НА, принадлежащем кладе II-2 североамериканской линии вирусов с делецией, в результате адаптации к мышам произошли 4 замены: F125/133L, D156/164N, G198/207E, K328/330T (табл. 2, табл. 3), которые слабо повлияли на рецепторную специфичность адаптанта MA/NJ (табл. 1) и не изменили термостабильность HA.

 

Таблица 3. Мутации в HA/H7 в адаптированном к мышам вирусе и альтернативные аминокислоты в данной позиции в природных изолятах, выделенных в Северной Америке в 1996–2022 гг.

Table 3. Mutations in HA/H7 of a mouse-adapted virus and alternative amino acids in these positions in natural isolates isolated in North America in 1996-2022

Позиция H3/H7 Position H3/H7	Аминокислота, вариант вируса Amino acid, virus variant		Количество вирусов H7 с указанной аминокислотой The number of H7 viruses with the indicated amino acid		Функциональный домен Functional domain	Источник Reference
			вирусы всех хозяев viruses of different hosts, n = 1107	HA c делецией петли-220 HA with 220 loop deletion, n = 230*
	ch/NJ	MA/NJ
125/133	F	F/L	L = 3, F = 1104	F = 230	Антигенный сайт Antigenic site	[9]
156/164	N/D	N	N = 1094, D = 4, K = 1, S = 8	N = 227, S = 3	Антигенный сайт Antigenic site	[9]
198/207	G	E	E = 5, G = 1102	E = 1, G = 229	Антигенный сайт Antigenic site	[9]
328/330	K	T	A = 8, K = 47, P = 211, T = 824	K = 46, P = 184	Сайт расщепления Сleavage site	[2]

Примечание. *В выборку не вошли штаммы, полученные в результате лабораторных манипуляций, например эскейп-мутанты.

Note. *The sampling did not include laboratory obtained strains, for example, escape mutants.

 

В MA/NJ наблюдается мутация K328/330T, расположенная в сайте расщепления НА в пози- ции –2. Структура сайта расщепления вирусов ch/NJ и MA/NJ — EKPKKR↓G и EKPKTR↓G — соответствует апатогенному фенотипу. По данным IRD, обе структуры встречаются у вирусов H7 разных видов птиц на североамериканском континенте.

В базе данных IRD имеются 1107 полных последовательностей НА вирусов подтипа H7, выделенных в Северной Америке в 1996–2022 гг., среди них 230, которые имеют делецию петли 220 в НА (табл. 3). Вирусы с делецией петли-220 представлены изолятами 1996–2006 и 2016 гг. Вирусы были выделены из окружающей среды, от кур, некоторых видов домашней птицы, дикой утки, 2 штамма изолированы от людей — один в 2003 г., а другой в 2016 г., когда были выделены 6 штаммов от кошек. Мы проанализировали вариабельность аминокислот в позициях, в которых в MA/NJ-вирусе были обнаружены замены. Из табл. 3 следует, что в адаптированном к мышам варианте заслуживают внимания только 2 замены — полиморфизм F/L с преобладанием L в позициях F125/133L и G198/207E, поскольку две другие позиции (156/164 и 328/330) представляют одну из альтернативных аминокислот, присутствующих в природных изолятах.

В исходном вирусе в позиции 125/133 находится F, как и в природных вирусах Н7. В MA/NJ наблюдается полиморфизм F/L с преобладанием L. Присутствие L в этой позиции — очень редкое явление. Среди природных вирусов H7 с такой заменой обнаружены 13 изолятов в разных частях мира, среди которых только 2 — в США (A/chicken/New York/Sg-00307/1998, H7N2 и A/American green-winged teal/Illinois/10OS4014/2010, H7N3). Такая редкая встречаемость свидетельствует о низкой конкурентной приспособленности HA с такой мутацией среди вирусов гриппа птиц.

Анализ вирусов H7N2 североамериканской линии, выделенных в 1999–2006 гг., указывает на то, что все эти вирусы имеют N в позиции 156/164. Наблюдаемый полиморфизм в исходном варианте ch/NJ с преобладанием в этой позиции D, скорее всего, частный случай.

Мутация D156/164N в адаптированном к мышам вирусе заменяет отрицательно заряженную аминокислоту на нейтральную. Замена G198/207E со сдвигом заряда в отрицательную сторону также относится к разряду редких среди исследованной группы вирусов. Не исключено, что две мутации со сменой заряда в позициях D156/164N и G198/207E, расположенных на поверхности НА, могут повлиять на его конформацию в зависимости от рН среды.

Изменения в белках NS1 и NEP

В процессе адаптации вируса кур ch/NJ к организму млекопитающих наибольшим изменениям подвергся сегмент 8, в котором изначально наблюдался полиморфизм 9 позиций нуклеотидной последовательности. В адаптированном варианте закрепились нуклеотиды, присутствовавшие в исходном варианте в меньшей доле. Из них 6 нуклеотидов привели к замене 6 аминокислот в белке NS1 и 1 замене в NEP (табл. 2, табл. 4).

 

Таблица 4. Замены в NS1 в адаптированном к мышам варианте MA/NJ и их вариабельность среди североамериканских вирусов гриппа птиц Н7

Table 4. NS1 substitutions in the mouse-adapted MA/NJ variant, and their variability among North American avian H7 viruses

Замена1 Mutation1	Варианты аминокислот в выборке вирусов Amino acid variability		Домен Domen	Локализация Location	Функция2 Function2
	H7N2, 1994–2007 (n = 263)	H7Nx, 1994–2022 (n = 908)
N73T	N = 47, S = 7, T = 138	A = 1, N = 23, F = 1, P = 1, S = 656, T = 226	Домен взаимодействия с РНК RNA binding domain	1–73	Взаимодействие с РНК, включая двухцепочечные; с клеточными белками RIG-I, PABPI и импортином-альфа Binding with several RNA species, including dsRNA. Interactions with host proteins RIG-I, PABPI, and importin-alpha
S114G	G = 44, P = 1, S = 123	G = 133, P = 1, S = 774	Эффекторный домен Effector domain	87–203	Опосредованное взаимодействие с рядом клеточных белков хозяина; ядерно-цитоплазматический транспорт зрелых мРНК. Стабилизирует N-концевой домен (1–73) взаимодействия с РНК Mediated interaction with several host cellular proteins; nuclear-cytoplasmic transport of mature mRNAs; stabilization of the N-terminal domain (1–73) due to RNA interaction
K118R	R = 7, K = 161	R = 658, K = 250
G171A	A = 60, R = 5, D = 7, G = 85, T = 11	A = 61, R = 5, N = 2, D = 648, G = 92, T = 100
F214L	I = 1, L = 75, F = 91, X = 1	I = 1, L = 790, F = 116, X = 1	C-концевой домен C-terminal domain	204–230	Содержит сигнальные мотивы для фосфорилирования CDK/ERK, связывания Crk/CrkL SH3, PDZ-лиганда, NoLS/NLS2 Contains signaling motifs for phosphorylation (CDK/ERK), Crk/CrkL SH3 binding, PDZ ligand and NolS/NLS2
G224R	R = 77, G = 90	R = 807, G = 94, K = 5, S = 1

Примечание. ¹Мутация в адаптированном к мышам варианте (исходный/адаптированный вариант). ²На основе данных работ [17, 18].

Note. ¹Mutation in the mouse-adapted variant (original/adapted variant). ²Based on data from [17, 18].

 

Следует заметить, что в природных вирусах ген NS представлен двумя аллелями: аллель A присутствует у всех вирусов гриппа млекопитающих и некоторых вирусов гриппа птиц, а аллель В характерен исключительно для вирусов гриппа птиц [29]. Исследуемый нами вирус A/chicken/New Jersey/294598-12/2004(H7N2) обладает аллелем В. Возможно, этим объясняется высокая изменчивость гена NS адаптированного к мышам варианта MA/NJ.

Линия североамериканских вирусов подтипа H7 с делецией петли-220 в НА, к которой принадлежат исследуемый нами вирус ch/NJ, представлена вирусами гриппа, изолированными от домашней птицы. Среди них, по данным GenBank, находится только один вирус, изолированный от человека, — A/New York/107/2003(H7N2), который, по сути, является вирусом «птичьего» происхождения. Сравнение последовательностей белков HA и NS1 этого вируса с исследованными нами вариантами ch/NJ и MA/NJ не обнаружило совпадающих мутаций в НА, в то время как в NS1 присутствуют три мутации — N73T, G171A, F214L, идентичные адаптированному к мышам варианту.

Мы провели анализ вариабельности белка NS1 среди вирусов гриппа H7 всех подтипов по NA (H7Nx), которые присутствовали среди птиц в Северной Америке в 1994–2022 гг., а также для вирусов подтипа H7N2 за 1994–2007 гг., включающие годы циркулирования линии вирусов с делецией в НА и их предшественников (табл. 4; рисунок, см. приложение в дополнительных файлах к статье на сайте журнала: DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-395-1).

В позициях 73, 114, 118, 171, 214 и 224, где произошли замены в варианте MA/NJ, между этими выборками нет существенных различий по набору варьирующих аминокислот, различается только процентное соотношение конкретных аминокислот (рисунок, см. приложение на сайте журнала). Наблюдаемое различие в распределении аминокислот в NS1 между двумя выборками вирусов гриппа птиц подтипа H7, отличающихся подтипом NA, может свидетельствовать об обособленности вирусов H7N2, циркулировавших в 1994–2007 гг., и существованием у них некоторой взаимосвязи (сцепленности) между сегментами 4, 6 и 8, кодирующими белки HA, NA и NS.

Во всех позициях NS1, которые подверглись заменам в варианте МА/NJ, наблюдается полиморфизм (табл. 4). Как в исходном ch/NJ, так и в MA/NJ- варианте в этих позициях присутствует одна из альтернативных аминокислот. Обнаруженные замены, по данным IRD, входят в состав экспериментально установленных коротких линейных эпитопов и в то же время находятся в структурно-функциональных доменах, которые осуществляют множественные контакты с факторами организма хозяина [17, 18].

В белке NEP в адаптированном к мышам варианте произошла одна замена E14Q, расположенная в сигнальной области NES (позиции 12–21, nuclear export signal), которая связывается с клеточным транспортным белком CRM1 и при его участии обеспечивает выход из ядра вирусных нуклеопротеиновых комплексов [30]. Сигнальная последовательность NES имеет гидрофобный характер (участок, богатый лейцинами или метионинами), в котором замена 14M существенно не нарушает структуру сигнальной области. Тем не менее в вирусе WSN замена аминокислоты в этой позиции M14Y приводила к задержке экспорта вирусных рибонуклеинопротеиновых комплексов (vRNP) из ядра, снижению ростовых свойств вируса и его аттенуации для мышей [30]. Структура NES в исследованных нами вирусах отличается всего одной позицией от вируса WSN: M14E — в исходном вирусе ch/NJ, M14Q — в MA/NJ. В нашем случае замена аминокислоты со сменой заряда (E14Q) — кислая на нейтральную полярную гидрофильную — гипотетически может оказать влияние на функционирование сигнала NES.

Адаптационный потенциал

Известно всего 8 выделенных от млекопитающих вирусов гриппа H7N2 клады II-2, для которых была определена структура полного генома: это 2 изолята от людей (A/NY/107/2003 и A/NY/108/2016) и 6 — от кошек [20, 21, 31]. Геном вируса A/NY/108/2016, выделенного от человека в 2016 г., почти полностью совпал с геномом вируса, выделенного от кошки, с которой контактировал заболевший [20]. Мы сравнили белки HA и NS этих вирусов, а также вируса MA/NJ с их близкородственным вирусом кур A/chicken/NJ/294508-12/2004 с целью найти общие отличия в изолятах от млекопитающих. В НА между МА/NJ и вирусами млекопитающих нет совпадающих замен относительно куриного вируса. Для белка НА сходство (дивергенция) с куриным вирусом для MA/NJ составило 99,5% (0,5%), для вируса человека A/NY/107/2003 — 96,6% (3,5%), для вирусов кошек и человека A/NY/108/2016 — 94% (6,2%).

Для белка NS1 сходство (дивергенция) с куриным вирусом для MA/NJ составило 97,4% (2,7%), для вируса человека NY/107/2003 — 97,8% (2,2%), для 5 вирусов кошек (WDL) одного приюта — 92,6% (7,3%), для вируса кошки A/feline/New York/16-040082-1/2016 и контактирующего с ней человека (A/NY/108/2016) — 92,2% (7,8%). В NS1 среди замен относительно куриного вируса ch/NJ 5 (N73T, S114G, G171A, F214L и G224R) совпали у адаптированных к мышам MA/NJ и кошачьих вирусов, из которых 3 (N73T, G171A, F214L) идентичны заменам в вирусе от человека A/New York/107/2003(H7N2).

В NEP присутствует только одна совпадающая замена E14Q. В кошачьих вирусах, кроме неё, имеются ещё 4 отличия от куриного вируса.

Что касается идентичных мутаций в вирусах H7N2 млекопитающих (в NS1 — N73T, G171A, F214L, в NEP — E14Q), то замена произошла на преобладающую или менее распространённую аминокислоту из числа альтернативных, присутствующих в природных «птичьих» изолятах. Это не позволяет признать их адаптационными без дополнительных исследований.

Примечательно, что в вирусах H7N2, изолированных от людей и кошек, отсутствовала мутация E627K в PB2 [20, 21], которую считают адаптационной к млекопитающим [26–28]. По данным разных авторов, появление мутации E627K при адаптации вирусов гриппа птиц к мышам сопровождалось усилением вирулентности вируса [27, 28], как и в нашем случае с MA/NJ. Помимо мутации в PB2, на изменение вирулентности MA/NJ могли повлиять замены в HA, которые способствовали возрастанию значения рН активации НА [10, 25].

Заключение

Проведённые нами исследования по адаптации к мышам низкопатогенного вируса гриппа кур H7N2, а также сведения о том, что вирусы этой линии смогли преодолеть видовой барьер и вызвать вспышку респираторной инфекции у кошек спустя 10 лет с момента их последнего обнаружения в природных условиях [20, 21], свидетельствуют о наличии адаптационного потенциала к млекопитающим у вирусов H7N2 североамериканской линии с делецией петли-220 в НА. Адаптация этих вирусов к разным видам млекопитающих, по-видимому, имеет свои особенности, и требуется некоторое время циркуляции в новом хозяине, чтобы вирус приобрёл мутации, способные вызвать клиническое проявление инфекции. Поскольку источник инфицирования кошек не установлен, то остаётся открытым вопрос, как вирусам H7N2 удавалось оставаться незамеченными и не попасть в поле зрения ветеринарных служб на протяжении более 10 лет.

 

¹ The PIP Framework’s Partnership Contribution (PC) High-Level Implementation Plan II 2018–2023 (HLIP-II).

URL: https://www.who.int/publications/i/item/pip-pc-preparedness-high-level-implementation-plan-ii-2018-2023

² Avian influenza A (H7N9) virus outbreak.

URL: https://www.who.int/emergencies/situations/avian-influenza-a-(h7n9)-virus-outbreak

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov

⁴ URL: https://www.bv-brc.org

⁵ В данном подразделе в круглых скобках приведена нумерация по NA референтного штамма A/Tokyo/3/1967(H2N2), AAO46245, GenBank; PDB: 1INH.

Об авторах

Александр Викторович Ляшко

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: lyaalex@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-5714-9461

м.н.с. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Ирина Александровна Руднева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: rudneva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5000-2547

к.б.н., в.н.с. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Дмитрий Николаевич Щербинин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: dim284@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-8518-1669

к.б.н., н.с. лаб. молекулярной биотехнологии

Россия, Москва

Наталья Фёдоровна Ломакина

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: nflomakina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2638-4244

к.б.н., с.н.с. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Анастасия Андреевна Трещалина

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: treshchalinaA@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3801-2413

м.н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов

Россия, Москва

Ирина Михайловна Куприянова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: irina.kupriyanovaaa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7301-388X

лаборант-исследователь лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Александра Сергеевна Гамбарян

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: al.gambaryan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1892-0548

д.б.н., в.н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов

Россия, Москва

Елена Борисовна Тимофеева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: helenheykey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7352-9808

инженер-исследователь лаб. клеточной микробиологии

Россия, Москва

Александр Александрович Шилов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: ashilov06@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-6338-4473

д.б.н., в.н.с. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Галина Кадымовна Садыкова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: gksadykova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2729-6767

к.б.н., с.н.с. лаб. молекулярной генетики

Россия, Москва

Алексей Геннадьевич Прилипов

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: a_prilipov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8755-1419

д.б.н., в.н.с., зав. лаб. молекулярной генетики

Россия, Москва

Борис Игоревич Тимофеев

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: boristim@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7425-0457

к.ф.-м.н., с.н.с. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Максим Михайлович Шмаров

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: mmshmarov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5268-1296

д.б.н., в.н.с., зав. лаб. молекулярной биотехнологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; доцент каф. инфектологии и вирусологии ПМГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Россия, Москва; Москва

Елена Леонтьевна Рязанова

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: scarobey64@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1375-3373

к.п.н., доцент каф. медицинской и биологической физики

Россия, Москва

Татьяна Анатольевна Тимофеева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи

Email: timofeeva.tatyana@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-8991-8525

к.б.н., в.н.с., зав. лаб. физиологии вирусов

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы