Получение и характеристика химерных Bst-подобных полимераз и их применение в изотермической амплификации в сочетании с экспресс-методами выделения РНК на примере вируса эпидемического паротита

Введение. Bst-полимераза играет ключевую роль в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний благодаря своим уникальным биохимическим свойствам и возможности применения в петлевой изотермической амплификации (LAMP). В литературе описано несколько аналогов Bst-полимеразы, однако данные ферменты не получили широкого применения в молекулярной диагностике.
Цель работы — получение рекомбинантных Bst- и Btlv-полимераз с Sso7d-доменом и тестирование новых возможностей для их применения.
Материалы и методы. Экспрессионные конструкции, несущие ген полимеразы, получали стандартными методами генетической инженерии. Целевой фермент был наработан в клетках Escherichia coli. Очистку проводили методами металл-аффинной хроматографии с последующим диализом и концентрированием. РНК-зависимую ДНК-полимеразную (ревертазную) и ДНК-полимеразную активности ферментов определяли с помощью нерадиоактивных методик с флуоресцентной детекцией. Функциональные свойства ферментов оценивали в наборе реагентов «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» и в методике, предназначенной для определения в биологическом материале РНК вируса эпидемического паротита в формате LAMP, совмещённой с обратной транскрипцией.
Результаты. В системе экспрессии на основе клеток E. coli получены рекомбинантные химерные ферменты с вытесняющей активностью: Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d. Разработанные протоколы культивирования и очистки позволяют получать ферменты в растворимой форме с выходом до 25% от собранной клеточной массы. Функциональное тестирование показало, что в LAMP химерные полимеразы демонстрировали сходную активность с Bst-полимеразой без Sso7d-домена. Вместе с тем полимераза Btlv_Sso7d имела повышенную ревертазную активность и устойчивость к ингибиторам.
Заключение. Полученная химерная полимераза Btlv_Sso7d, благодаря своим улучшенным свойствам, может быть использована в наборах реагентов для диагностики инфекционных заболеваний методом LAMP при использовании методов экспресс-экстракции нуклеиновых кислот.