Получение и характеристика химерных Bst-подобных полимераз и их применение в изотермической амплификации в сочетании с экспресс-методами выделения РНК на примере вируса эпидемического паротита

Полный текст

Введение

Сокращение времени исследования за счёт применения быстрых тестов является одной из ключевых тенденций в лабораторной диагностике. Этот подход особенно актуален для повышения пропускной способности лаборатории в условиях проведения массовых скринингов и позволяет медицинскому персоналу или эпидемиологам осуществлять диагностику в условиях ограниченности ресурсов, что способствует оказанию своевременной помощи пациентам, быстрому выявлению инфицированных лиц, оперативному расследованию инфекционных вспышек и принятию адекватных эпидемиологических мер, а также предотвращает избыточное назначение профилактических и терапевтических средств. Такие быстрые тесты должны соответствовать определённым требованиям — высокой точности и скорости, простоте и доступности, а также обладать высокой стабильностью при хранении и транспортировке [1, 2].

Пандемия коронавируса дала толчок развитию изотермических методов амплификации. Метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) [3–5] обладает высокой чувствительностью и специфичностью, важным преимуществом является то, что реакция амплификации проходит при постоянной температуре (без термоциклирования). Это позволяет проводить исследования как в оборудованных клинико-диагностических лабораториях, так и в полевых условиях, где отсутствует специальное лабораторное оборудование. Ключевая роль в дальнейшем развитии наборов реагентов для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний методом LAMP принадлежит Bst-полимеразе [6, 7] и её модификациям. Bst-полимераза является большим фрагментом ДНК-полимеразы I (Bst-LF), выделенной из термофильной бактерии Geobacillus stearothermophilus (ранее Bacillus stearothermophilus) [8] и имеющей температурный оптимум 60–70°С. Фермент был выделен J. Stenesh и соавт. в 1972 г. [9], за 4 года до открытия Taq-полимеразы [10, 11]. В дальнейшем как для исследовательских целей, так и в производственных решениях, как правило, стали использоваться рекомбинантные ферменты, в частности Bst-полимераза, клонированная и экспрессированная в клетках бактерий Escherichia coli. Бактериальная система на основе клеток E. coli отличается простотой и невысокой стоимостью культивирования, высокой скоростью роста микроорганизмов, для неё разработан широкий спектр различных векторов для экспрессии рекомбинантных белков. Для Bst-полимеразы и аналогичных полимераз с вытесняющей активностью из других организмов описаны подходы к клонированию и получению рекомбинантных ферментов в бактериальной системе экспрессии на основе клеток E. coli [12–14]. Поскольку на удельную каталитическую активность фермента влияют в том числе особенности нуклеотидной последовательности гена, условия экспрессии, протокол выделения и очистки, все эти этапы требуют оптимизации при получении любого фермента.

Основными подходами к изменению физико-химических характеристик фермента в соответствии с практическими задачами пользователя являются направленный мутагенез и добавление белковых доменов с заданными свойствами [15, 16]. Подобные модификации позволяют повысить выход растворимого фермента при экспрессии в клетках E. coli, упростить процесс очистки, а также получить ферменты с улучшенными свойствами: повышенной активностью и термостабильностью, устойчивостью к солям и ингибиторам. Немодифицированная Bst-полимераза обладает недостаточно высокой процессивностью, поскольку в нативном организме участвует в основном в репарации ДНК [17]. Модифицированный фермент обладает гораздо большей процессивностью, которая обусловлена наличием в клетках вспомогательных белков, повышающих стабильность комплекса полимераза–ДНК. Белок Sso7d относится к семейству ДНК-связывающих белков, выделенных из археи рода Sulfolobus, стабилен в широком диапазоне температуры и рН. Ряд авторов описывают стратегию слияния полимераз с белком Sso7d или подобными белками (Sto7d, SSB, TBD, DBD) для получения химерных ферментов, обладающих повышенной процессивностью, вытесняющей активностью, термостабильностью и толерантностью к ингибиторам, включая мочевину, цельную кровь и NaCl [18–22].

Термофильные бактерии родственных видов могут вырабатывать разные стратегии выживания, что обусловливается в том числе отличиями в свойствах их ферментов. В этой связи потенциально интересными направлениями становятся клонирование и получение рекомбинантных ДНК-полимераз из новых источников, например, из родственного организма и ближайшего гомолога — термофильной бактерии Geobacillus thermoleovorans (ранее Bacillus thermoleovorans) [23, 24].

Целью настоящей работы было получение химерных Bst-подобных полимераз из G. stearothermophilus, а также их сравнение с гомологом — Btlv-полимеразой из G. thermoleovorans для оценки возможности их применения в реакции изотермической амплификации в сочетании с экспресс-методами выделения РНК.

Материалы и методы

Получение генов Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4, Btlv_Sso7d

Нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность Btlv-полимеразы из G. thermoleovorans, получали методом сборки из длинных перекрывающихся праймеров — «методом лесенки» [25]. На концах нуклеотидной последовательности были введены сайты рестрикции: Ndel — на 5'-конце и XhoI — на 3'-конце для последующего переклонирования в экспрессионный вектор рЕТ16b+. В результате был получен экспрессионный вектор pET16-Btlv-Nhis. Правильность нуклеотидной последовательности клонированного гена подтверждали методом секвенирования.

В качестве источников генов Bst и Bst_mut4 использовали плазмиды, полученные ранее в лаборатории: рЕТ16_Bst и рЕТ16_Bst_NHis_m4 соответственно [7, 26]. Матрицей для амплификации гена Sso7d также служила ранее полученная конструкция pPSS, содержащая ген Sso7d дикого типа.

Для получения генов химерных ферментов проводили амплификацию гена целевого фермента и гена ДНК-связывающего домена Sso7d. Полученные ампликоны были выделены и очищены из геля и лигированы между собой с использованием фланкирующих праймеров (табл. 1).

 

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованные для клонирования генов

Матрица	Имя	Последовательность 5’-3’	ПЦР2
Bst_Sso7d
рЕТ16_Bst	BstF	gaaaggaggaggagctctaacatctgcggaaggcgaaaaaccg
	BstR	agtctcgagttatttcgcatcataccagg	˅
pPSS	SsoF	tcgtcatatggcgaccgtgaagttcaagtataaag	˅
	SsoR	agatgttagagctcctcctcctttcttctgtttttccag
Bst_Sso7d_mut4
рЕТ16_Bst_NHis_m4	BstF	gaaaggaggaggagctctaacatctgcggaaggcgaaaaaccg
	BstR	agtctcgagttatttcgcatcataccagg	˅
pPSS	SsoF	tcgtcatatggcgaccgtgaagttcaagtataaag	˅
	SsoR	agatgttagagctcctcctcctttcttctgtttttccag
Btlv_Sso7d
pET16-Btlv-Nhis	BtlvF	gaaaggaggaggagctctaacatctccgtcttctgaggaagaaaagcc
	BtlvR	aagtctcgagttatttcgcatcataccaagtagaaccgtagtg	˅
pPSS	SsoF	tcgtcatatggcgaccgtgaagttcaagtataaag	˅
	SsoR	agatgttagagctcctcctcctttcttctgtttttccag

 

Для получения выступающих А-концов очищенный ампликон инкубировали 30 мин при 72°С в присутствии Taq-полимеразы и смеси дезоксинуклеотидов dNTPs. Целевой продукт затем был клонирован в вектор pGEM-T («Promega»). Наличие целевой последовательности и её корректность подтверждали с помощью секвенирования методом Сэнгера.

Получение экспрессионных плазмидных векторов, содержащих гены Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4, Btlv_Sso7d

Плазмидную ДНК, содержащую ген химерного фермента, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI и полученный продукт рестрикции клонировали в плазмидный вектор pET16b+, предварительно обработанный теми же эндонуклеазами рестрикции. В результате были получены экспрессионные векторы, содержащие гены, которые кодируют следующие гибридные белки: Bst_Sso7d с молекулярной массой 75 кДа, Bst_Sso7d_mut4 с молекулярной массой 75,2 кДа и Btlv_Sso7d с молекулярной массой 75 кДа. Правильность нуклеотидной последовательности клонированных генов была подтверждена секвенированием.

Подбор штаммов E. coli для экспрессии генов Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d

В качестве штаммов-носителей для созданных экспрессионных векторов pET16-Bst_Sso7d, pET16-Bst_Sso7d_mut4 и pET16-Btlv_Sso7d использовали штаммы E. coli ER2566, BL21de3 pLys и Rosetta De3. Трансформированные клетки высевали на среду LB (1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) с агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина для клеток ER2566 и 20 мкг/мл хлорамфеникола для клеток BL21 (DE3) pLys и Rosetta (DE3), и выращивали в течение 16 ч при 37°С для получения отдельных колоний. Затем 7–8 колоний переносили в 100 мл среды LB с 100 мкг/мл ампициллина и выращивали 18 ч при 37°С на шейкере при перемешивании со скоростью 180 об/мин для получения ночной культуры. Полученные ночные культуры штаммов-продуцентов E. coli переносили в среду LB с 100 мкг/мл ампициллина в культуральных колбах Эрленмейера (процент засева составлял 2%) и выращивали при 37°С при перемешивании со скоростью 160 об/мин. При достижении оптической плотности культуры бактерий 0,8 опт. ед. вносили изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид до концентрации 0,4 мМ и выращивали при 23°С и 37°С в течение 4 и 24 ч. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 595 нм. Клеточную биомассу получали центрифугированием в течение 20 мин при 4°С и 4000 об/мин на центрифуге «Avanti JXN-30» («Beckman Coulter»).

Выделение Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d

Клеточную биомассу (2 г) штаммов-продуцентов E. coli BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst_Sso7d, BL21 (DE3)pLys/pET16-Bst_Sso7d_mut4 и BL21 (DE3)pLys/pET16-Btlv_Sso7d ресуспендировали в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 8,5 с 1 мМ PMSF в соотношении 1 : 10 (w/v) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора «Branson sonifier 250» («Branson Ultrasonics») в течение 20 мин при 4°С (цикл — 0,5 с, амплитуда — 50%). Затем центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге «Allegra X-30R» («Beckman Coulter»). После центрифугирования супернатант разбавляли в 2 раза буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl pH 8,5 и наносили на хроматографический сорбент IMAC FF, предварительно уравновешенный буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl pH 8,5 (буферный раствор А). Очистку от балластных белков проводили буферным раствором А. Целевой белок элюировали линейным градиентом буферного раствора А с 500 мМ имидазолом.

После металл-хелатной хроматографии фракции, содержащие целевой белок, диализовали против буферного раствора 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 0,5% Tween-20, 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,3. После проведения диализа к раствору белка добавляли глицерин до 50%.

Определение активности ферментов

РНК-зависимую ДНК-полимеразную (ревертазную) активность ферментов определяли с помощью нерадиоактивной методики с флуоресцентной детекцией, основанной на образовании дуплекса полиадениловой РНК и олигонуклеотидного праймера dT18, в который встраивался интеркалирующий краситель GelStar («Lonza»). ДНК-полимеразную активность ферментов определяли с помощью нерадиоактивной методики [27]. В качестве матрицы использовали олигонуклеотид, содержащий на 3’-конце шпилечную структуру. В присутствии ионов Mg²⁺ полимеразы катализировали включение дезоксинуклеотидов, тем самым удлиняя матрицу. Описанные нерадиоактивные методики позволяют определять активности ферментов с помощью амплификаторов с оптическим модулем для детекции флуоресценции в режиме реального времени.

Устойчивость ферментов к температурному воздействию оценивали с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии в диапазоне 55–85°С по 1°С на шаг, продолжительность шага составляла 50 с, кривые плавления детектировались по каналу Fam на приборе «CFX 96» («Bio-Rad Laboratories»).

Оптимальные концентрации ионов в реакционной смеси подбирали аналогично анализу полимеразной активности с использованием концентраций KCl в диапазоне 50–500 мМ.

Аналитические методы

Концентрацию белка определяли с помощью набора «QuDye Protein» (ООО «Люмипроб РУС») на флуориметре «Qubit 4» («Thermo Scientific»), чистоту белка — с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях [28]. При проведении ДСН-ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях использовали маркер длин белков — маркер молекулярных масс («ThermoScientific»).

Петлевая изотермическая амплификация, совмещённая с обратной транскрипцией

Для оценки потенциальной возможности использования полученных химерных ферментов в составе новых наборов реагентов для диагностики инфекционных заболеваний, проводили тестирование на наборе реагентов «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» (РУ № РЗН 2021/14599). В качестве образцов использовали генетическую конструкцию, представляющую собой бактериофаг MS2 со специфической вставкой гена ORF1ab коронавируса. Реакционные смеси содержали 0,8 мкл тестируемых ферментов в концентрации 0,288 ЕД/мкл или такое же количество Bst-полимеразы без Sso7d-домена, а также ревертазу (MMLv). Каждый образец амплифицировали в 3 повторах на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen»).

Функциональные свойства ферментов также тестировали в лабораторной методике, предназначенной для определения в биологическом материале РНК вируса эпидемического паротита в формате LAMP с совмещённой обратной транскрипцией. Амплифицировали фрагмент гена фосфопротеина вируса эпидемического паротита (размер ампликона 225 пар оснований, GC-состав 54%). В качестве образцов использовали мочу и мазки со слизистой оболочки ротоглотки, содержание РНК вируса эпидемического паротита (Mumps virus) подтверждали секвенированием по методу Сэнгера с помощью набора «BigDye Terminator v. 1.1 Cycle Sequencing Kit» («Thermo Fisher Scientific») на секвенаторе «3500xL Genetic Analyzer» («Thermo Fisher Scientific»).

Экстракцию нуклеиновых кислот проводили с помощью экспресс-комплекта «ЭДЭМ» (РУ № 2010/07828), а также лизирующего раствора, содержащего гуанидин гидрохлорид. В качестве контрольного метода экстракции использовали комплект реагентов «РИБО-преп» (РУ № ФСР 2008/03147). Реакционные смеси содержали олигонуклеотиды, комплементарные участкам амплифицируемых мишеней, а также интеркалирующий краситель, что позволило регистрировать накопление специфического продукта амплификации путём измерения интенсивности флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени»; а также смесь глицерина с тиоглицеролом, солями и поверхностно-активными веществами (все использованные дополнительные реагенты разработаны и производятся в ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). В качестве контрольного лота использовали немутированную форму Bst-полимеразы без Sso7d-домена в концентрации по белку, равной концентрации тестируемых ферментов. Реакцию проводили по программе: 37°С — 5 мин, 65°С — 30 с, 40 циклов с детекцией по каналу FAM (общая продолжительность 25 мин).

Оценка устойчивости ферментов к ингибиторам LAMP

Для оценки устойчивости ферментов к ингибиторам LAMP использовали муцин («Sigma-Aldrich»), а также предварительно охарактеризованные остаточные образцы биологического материала человека (моча, мазки со слизистой оболочки ротоглотки, плазма и цельная кровь). Мазки со слизистой оболочки ротоглотки содержались в транспортной среде для хранения и транспортировки респираторных мазков (РУ № ФСР 2009/05011; ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Ингибиторы добавляли в реакционную смесь для LAMP. Реакцию проводили по программе: 37°С — 5 мин, 65°С — 30 с, 40 циклов с детекцией по каналу FAM (общая продолжительность 25 мин). Результаты оценивали по наличию/отсутствию флуоресцентного сигнала (обнаружено/не обнаружено) и величине значений пороговых циклов (Ct), что является достаточным для диагностических систем с качественным определением.

Результаты

Семейство Sso7d включает в себя небольшие многочисленные неспецифические ДНК-связывающие белки, впервые обнаруженные в гипертермофильной бактерии Archaea sulfolobus. Они имеют массу 7–10 кДа и обладают различными видами функциональной активности: стабилизация двойной спирали, отжиг ДНК при температуре выше температуры её плавления и предотвращение агрегирования белков. Кроме того, такие белки изменяют конформацию ДНК, вызывая расплетение двойной спирали ДНК [29].

Для получения рекомбинантной Bst-mut4- и Btlv-полимеразы были разработаны уникальные синтетические последовательности с учётом оптимизации частоты встречаемости кодонов для экспрессии в E. coli. Далее к генам Bst- и Btlv-полимеразы был присоединён ген Sso7d, и такие конструкты были клонированы в экспрессионный вектор pET16b+ для прокариотической экспрессии в клетках E. coli. В ходе подбора штаммов-носителей для экспрессии генов Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d была исследована динамика накопления ферментов при разных температурах (23 и 37°С) и времени индукции белкового биосинтеза (4 и 24 ч). В результате было показано, что все ферменты эффективно нарабатывались в растворимой форме при 23°С в течение 24 ч в клетках E. coli BL21 (DE3)pLys (табл. 2–4).

 

Таблица 2. Подбор штаммов-носителей для экспрессии генов Bst-Sso7d

Штамм-носитель E. coli	Условия культивирования	Содержание белка, %	Съём клеточной биомассы, г/л
ER2566	23°С, 4 ч	10	2,1
	23°С, 24 ч	15	2,3
	37°С, 4 ч	12	2,3
	37°С, 24 ч	12	2,5
Rosetta De3	23°С, 4 ч	23	2,4
	23°С, 24 ч	23	2,6
	37°С, 4 ч	21	2,5
	37°С, 24 ч	24	2,9
BL21 De3 pLys	23°С, 4 ч	23	2,7
	23°С, 24 ч	25	3,14
	37°С, 4 ч	24	2,9
	37°С, 24 ч	21	3,2

 

Таблица 3. Подбор штаммов-носителей для экспрессии генов Bst_Sso7d_mut4

Штамм-носитель E. coli	Условия культивирования	Содержание белка, %	Съём клеточной биомассы, г/л
ER2566	23°С, 4 ч	10	2,1
	23°С, 24 ч	11	2,5
	37°С, 4 ч	14	2,5
	37°С, 24 ч	16	1,7
Rosetta De3	23°С, 4 ч	19	2,2
	23°С, 24 ч	21	2,4
	37°С, 4 ч	21	2,3
	37°С, 24 ч	22	2,5
BL21 De3 pLys	23°С, 4 ч	21	2,1
	23°С, 24 ч	23	2,6
	37°С, 4 ч	21	2,5
	37°С, 24 ч	20	2,7

 

Таблица 4. Подбор штаммов-носителей для экспрессии генов Btlv_Sso7d

Штамм-носитель E. coli	Условия культивирования	Содержание белка, %	Съём клеточной биомассы, г/л
ER2566	23°С, 4 ч	18	2,0
	23°С, 24 ч	16	2,5
	37°С, 4 ч	16	2,4
	37°С, 24 ч	14	2,8
Rosetta De3	23°С, 4 ч	18	2,3
	23°С, 24 ч	17	2,4
	37°С, 4 ч	19	2,5
	37°С, 24 ч	19	2,7
BL21 De3 pLys	23°С, 4 ч	21	2,4
	23°С, 24 ч	23	2,5
	37°С, 4 ч	23	2,5
	37°С, 24 ч	21	2,7

 

Для очистки ферментов от клеточных белков использовали металл-аффинную хроматографию в линейном градиенте имидазола (рис. 1).

 

Рис. 1. Электрофореграмма очистки ферментов Bst_Sso7d (а), Bst_Sso7d_mut4 (б) и Btlv_Sso7d (в).

М — маркер молекулярных масс; 1 — осветлённый клеточный лизат; 2 — проскок с металл-хелатного сорбента; далее — фракции после аффинной хроматографии.

 

Фракции с чистотой более 90% объединяли и проводили диализ против буферного раствора 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 0,5% Tвин-20, 0,1 мМ ЭДТА pH 8,3 с последующим концентрированием. По данным электрофоретического анализа чистота фермента составила не менее 90% (рис. 2) с концентрацией не менее 2 мг/мл.

 

Рис. 2. Электрофореграмма очистки ферментов Bst_Sso7d_mut4, Bst_old_Sso7d и Btlv_Sso7d.

М — маркер молекулярных масс; 1, 3, 5 — осветлённый клеточный лизат Bst_Sso7d_mut4, Bst_Sso7d и Btlv_Sso7d соответственно; 2, 4, 6 — конечный очищенный препарат ферментов Bst_Sso7d_mut4, Bst_Sso7d и Btlv_Sso7d соответственно.

 

Стоит отметить, что, несмотря на более высокий процент содержания белка от общей массы влажных клеток: в случае экспрессии Bst_Sso7d — 25% против 23% для Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d, после очистки более высокие выходы демонстрировали последние два фермента. Это связано с тем, что оптимизация состава кодонов кодирующей последовательности приводит к увеличению выхода белка в растворимой форме.

Тестирование полимеразной активности выделенных ферментов Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d проводили на образцах РНК бактериофага MS2 со специфической вставкой, содержащей фрагмент генома SARS-CoV-2, методом LAMP с обратной транскрипцией с использованием реагентов, входящих в состав набора «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT». Концентрация матрицы составляла 10⁵ копий в реакцию. Все новые ферменты проявляли полимеразную активность, однако средние значения пороговых циклов отличались от контрольного лота Bst-полимеразы без Sso7d-домена в сторону увеличения значений в среднем на 3,73 для Bst_Sso7d, на 3,42 для Bst_Sso7d_mut4 и 2,88 для Btlv_Sso7d (рис. 3), что может свидетельствовать о неоптимальных условиях реакции для новых ферментов.

 

Рис. 3. Оценка активности полученных полимераз в наборе реагентов «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» (средние значения порогового цикла).

 

Все исследуемые ферменты показали сопоставимые результаты в экспериментах по оценке их устойчивости к температурному воздействию (рис. 4).

 

Рис. 4. Термостабильность химерных полимераз.

а — профили термической денатурации; б — производные величины флуоресценции от температуры.

 

Выделенные ферменты Bst_Sso7d, Bst_mut4_Sso7d и фермент сравнения проявляли слабую РНК-зависимую ДНК-полимеразную (ревертазную) активность как в методике [7], так и при тестировании в наборе «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» без использования фермента ревертазы. Вместе с тем Btlv_Sso7d-полимераза проявляла ревертазную активность, сравнимую с активностью ревертазы (MMLv), но только в присутствии KCl и (NH₄)₂SO₄, что позволяет использовать фермент не только для амплификации ДНК/кДНК, но и для обратной транскрипции РНК. Изменение состава реакционной смеси (главным образом, добавление KCl) позволило добиться увеличения полимеразной активности всех химерных ферментов, оптимальная концентрация KCl в буфере для LAMP составила 200 мМ (рис. 5).

 

Рис. 5. Оптимальная концентрация KCl для химерных полимераз.

 

Наборы реагентов на основе LAMP позволяют сократить время амплификации с 1,5–2,5 ч (метод ПЦР) до 25–40 мин, при этом имеют высокую специфичность за счёт использования 4–6 олигонуклеотидов. Однако процесс экстракции нуклеиновых кислот из биологического материала по-прежнему является достаточно длительным. Исследуемые образцы обрабатываются лизирующим раствором, вследствие чего происходит разрушение клеточных стенок бактерий и вирусных оболочек с последующим высвобождением в раствор компонентов клетки и нуклеиновых кислот. Применение в протоколе экстракции последующих отмывок приводит к удалению из раствора веществ и компонентов клетки, которые ингибируют ПЦР. Экспресс-методы отличаются отсутствием этапа отмывки либо наличием всего одной отмывки: клинический материал, взятый в специальную транспортную среду (например, «ТС-ЭДЭМ»), подвергается термической обработке и центрифугированию, в результате чего нерастворимые компоненты осаждаются, а нуклеиновые кислоты, остающиеся в надосадочной жидкости, используются для проведения ПЦР. Однако после обеззараживания без экстракции или после экспресс-экстракции образцы РНК/ДНК содержат примеси, которые могут служить ингибиторами ПЦР, например, компоненты транспортных сред, лизирующего раствора, крови, мазков, мочи и других биоматериалов.

Функциональные свойства полученных в работе полимераз были проверены на устойчивость к наиболее часто встречающимся ингибиторам (компонентам цельной крови, плазмы крови, мочи, муцину) в реакции LAMP в модельной системе с использованием положительных контрольных образцов. Ингибиторы добавляли в реакционную смесь, содержащую праймеры из набора реагентов «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» и выделенную РНК бактериофага MS2 со специфической вставкой, содержащей фрагмент генома SARS-CoV-2. Результаты оценивали по наличию/отсутствию флуоресцентного сигнала («обнаружено»/«не обнаружено»), что является достаточным для диагностических систем с качественным определением (табл. 5).

 

Таблица 5. Сравнение влияния ингибиторов на обнаружение РНК вируса эпидемического паротита при использовании тестируемых ферментов

Ингибиторы		Обнаружение РНК вируса эпидемического паротита
название	концентрация	Bst-полимераза (контроль)	Bst_Sso7d	Bst_Sso7d_mut4	Btlv_Sso7d
Цельная кровь, об. %	0	+	+	+	+
	0,5	+	+	+	+
	1,0	+	+	+	+
	2,5	+	–	–	+
	5,0	+	–	–	+
	10,0	–	–	–	+
Плазма крови, об. %	0	+	+	+	+
	1	–	–	–	+
Муцин, мг/мл	0	+	+	+	+
	0,2	+	+	+	+
	0,5	+	+	+	+
Моча, об. %	0	+	+	+	+
	5	+	–	–	+
	10	–	–	–	+

 

Модифицированные ферменты на основе Bst-полимеразы, содержащие ДНК-связывающий домен Sso7D: Bst_Sso7d и Bst_Sso7d_mut4, продемонстрировали сниженную устойчивость к присутствию в реакционной смеси цельной крови и мочи по сравнению с контрольным ферментом. В то же время фермент Btlv_Sso7d характеризуется более высокой устойчивостью к присутствию цельной крови (10 об. %), плазмы (1 об. %), мочи (10 об. %). Все ферменты сохраняют свою активность в присутствии муцина до 0,5 мг/мл.

Дальнейшие эксперименты по определению влияния ингибиторов на эффективность реакции LAMP проводились только с использованием фермента Btlv_Sso7d. Устойчивость полимеразы Btlv_Sso7d к ингибиторам из биоматериала (слизь из ротоглоточных мазков, соли из мочи), компонентам транспортной среды (транспортная среда для хранения и транспортировки респираторных мазков (РУ № ФСР 2009/05011)) и лизирующего раствора (1М гуанидина гидрохлорида) была также протестирована на 12 клинических образцах мочи и 12 образцах мазков со слизистой оболочки ротоглотки, содержащих РНК вируса эпидемического паротита в концентрации 10⁵–10⁸ копий/мл, выделенных тремя различными методами: методом, основанным на преципитации с использованием набора «РИБО-преп»; экспресс-методом «ЭДЭМ»; обработкой раствором 1М гуанидина гидрохлорида (для обеззараживания биоматериала) без последующих отмывок. Далее все выделенные образцы сравнивали в методике LAMP без добавления ревертазы (MMLv) (рис. 6).

 

Рис. 6. Выявление вируса эпидемического паротита в биологических образцах с помощью LAMP с использованием различных полимераз без добавления ревертазы.

 

При использовании Btlv_Sso7d-полимеразы, в отличие от контрольного фермента, реакция LAMP сохраняет свою эффективность во всех изученных условиях, а все биологические образцы, содержащие РНК вируса эпидемического паротита использованные в работе, идентифицируются как положительные. Наблюдается также не такое значительное повышение значений Ct при анализе образцов после выделения нуклеиновых кислот экспресс-методом «ЭДЭМ», как в случае контрольного фермента. Всё это показывает, что полимераза Btlv_Sso7d обладает достаточной ревертазной активностью и повышенной толерантностью к ингибиторам для качественного обнаружения РНК вируса эпидемического паротита (рис. 6).

За счёт более высокой толерантности к ингибиторам применение новой Btlv_Sso7d-полимеразы в реакциях изотермической амплификации на основе метода LAMP в сочетании с экспресс-методами экстракции нуклеиновых кислот, которые включают только этап лизиса, позволит вывести молекулярную диагностику на новый уровень скорости и сделать возможным применение тестов на основе LAMP в полевых условиях или «у постели больного».

Обсуждение

Метод LAMP является перспективным направлением в молекулярной диагностике инфекционных заболеваний. Основное достоинство метода — это более короткое время анализа: этап амплификации занимает всего 25–40 мин, а чувствительность и специфичность метода при этом сопоставимы с методом ПЦР [1, 2]. Изотермический режим проведения реакции позволяет использовать более простое оборудование для проведения реакции: термостат с модулем детекции флуоресценции вместо амплификатора.

Кроме этапа собственно амплификации, любой анализ чаще всего включает этап выделения нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот проводится с целью избавления от основных ингибиторов амплификации, которые могут присутствовать в биологических образцах. В среднем, в зависимости от используемого метода, этап выделения может занимать от 1 до 3 ч. Сокращение этой стадии за счёт применения экспресс-методов выделения нуклеиновых кислот (10–30 мин) позволит существенно снизить общее время исследования. Для успешной реализации такой стратегии необходимы разработка и применение ферментов, устойчивых к основным ингибиторам амплификации.

Полученные в работе Bst-полимеразы, содержащие ДНК-связывающий домен Sso7D: Bst_Sso7d и Bst_Sso7d_mut4 продемонстрировали сниженную устойчивость к присутствию в реакционной смеси цельной крови и мочи по сравнению с контрольным ферментом, не содержащим дополнительных доменов. В то же время фермент Btlv_Sso7d характеризуется более высокой устойчивостью к присутствию цельной крови (10 об. %), плазмы (1 об. %), мочи (10 об. %). Все ферменты сохраняют свою активность в присутствии муцина до 0,5 мг/мл. Эти данные демонстрируют, что добавление ДНК-связывающего домена не привело к повышению устойчивости к ингибирующему эффекту мочи и цельной крови в случае Bst-полимеразы. В литературе опубликованы подобные работы, свидетельствующие об обратном эффекте при использовании различных Bst-подобных полимераз [17, 18, 30, 31]. Однако родственный химерный фермент Btlv_Sso7d, полученный в данной работе, демонстрирует высокую устойчивость к ингибирующему эффекту компонентов цельной крови, плазмы и мочи на реакцию LAMP. Такая разница результатов может объясняться особенностями генно-инженерных конструкций, наличием или отсутствием дополнительных спейсеров между ДНК-связывающим доменом и полимеразой, структурой этих спейсеров, условиями культивирования и очистки рекомбинантных белков. Полученные данные демонстрируют необходимость дальнейших детальных исследований в данной области для определения влияния ДНК-связывающих доменов на свойства химерных ферментов в каждом конкретном случае и определения взаимосвязей между структурой и функциями химерных ферментов.

Заключение

В бактериальной системе экспрессии на основе клеток E. coli получены рекомбинантные химерные ферменты с вытесняющей активностью: Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d. Разработанные протоколы получения и очистки позволяют получать ферменты в растворимой форме с выходом до 25% от всей собранной клеточной массы. В реакциях LAMP химерные полимеразы продемонстрировали сходную активность с Bst-полимеразой без Sso7d-домена. Вместе с тем Btlv_Sso7d-полимераза характеризуется повышенной ревертазной активностью и устойчивостью к ингибиторам, что позволяет использовать её в наборах реагентов для диагностики инфекционных заболеваний методом LAMP в сочетании с экспресс-экстракцией нуклеиновых кислот путём термоинактивации или лизиса в присутствии гуанидина хлорида без последующих отмывок от компонентов биоматериала и лизирующего раствора. Это позволяет существенно сократить время проведения анализа.

По мере роста потребности в быстрой и точной диагностике инфекционных заболеваний использование методов LAMP, а следовательно, и аналогов Bst-полимеразы с улучшенными свойствами, будет только увеличиваться.

Об авторах

Татьяна Львовна Замотаева

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: sazonova@pcr.ms
ORCID iD: 0009-0003-9799-3749

н. с., Центр разработки, развития продукции и инноваций

Россия, Москва

Екатерина Александровна Дедяева

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: safronova.e@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-2501-0956

старший технолог-разработчик, Центр разработки, развития продукции и инноваций

Россия, Москва

Ольга Олеговна Михеева

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: olga.mikheeva.92@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1721-5134

н. с., научная группа генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Мария Игоревна Пика

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: m.zotova@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-3279-6811

м. н. с., научная группа генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Евгений Александрович Черкашин

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: e.cherkashin@pcr.ms
ORCID iD: 0000-0002-3627-6047

канд. хим. наук, рук. Центра разработки, развития продукции и инноваций

Россия, Москва

Анна Сергеевна Черкашина

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: cherkashina@pcr.ms
ORCID iD: 0000-0001-7970-7495

канд. хим. наук, рук. научной группы генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Василий Геннадьевич Акимкин

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: v.akimkin@cmd.su
ORCID iD: 0000-0003-4228-9044

д-р мед. наук, проф., академик РАН, директор

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы