Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology1890910.36233/0372-9311-604TRVYOBSCIENCE AND PRACTICEНАУКА И ПРАКТИКАResearch ArticleProduction and characterization of chimeric Bst-like polymerases and their application in isothermal amplification combined with rapid RNA extraction methods using the example of the mumps virusПолучение и характеристика химерных Bst-подобных полимераз и их применение в изотермической амплификации в сочетании с экспресс-методами выделения РНК на примере вируса эпидемического паротитаhttps://orcid.org/0009-0003-9799-3749ZamotaevaTatyana L.ЗамотаеваТатьяна Львовна
Russian Federation

Researcher, Center for development, product development and innovation

н. с., Центр разработки, развития продукции и инноваций

sazonova@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0002-2501-0956DedyaevaEkaterina A.ДедяеваЕкатерина Александровна
Russian Federation

Technologist-developer, Center for development, product development and innovation

старший технолог-разработчик, Центр разработки, развития продукции и инноваций

safronova.e@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0002-1721-5134MikheevaOlga O.МихееваОльга Олеговна
Russian Federation

Researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology, Department of molecular diagnostics and epidemiology

н. с., научная группа генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

olga.mikheeva.92@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3279-6811PikaMaria I.ПикаМария Игоревна
Russian Federation

Researcher, Research group of genetic engineering and biotechnology, Department of molecular diagnostics and epidemiology

м. н. с., научная группа генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

m.zotova@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0002-3627-6047CherkashinEvgeny A.ЧеркашинЕвгений Александрович
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), Head, Center for development, product development and innovation

канд. хим. наук, рук. Центра разработки, развития продукции и инноваций

e.cherkashin@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0001-7970-7495CherkashinaAnna S.ЧеркашинаАнна Сергеевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), Head, Research group of genetic engineering and biotechnology

канд. хим. наук, рук. научной группы генной инженерии и биотехнологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

cherkashina@pcr.mshttps://orcid.org/0000-0003-4228-9044AkimkinVasily G.АкимкинВасилий Геннадьевич
Russian Federation

Dr. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director

д-р мед. наук, проф., академик РАН, директор

v.akimkin@cmd.suCentral Research Institute of EpidemiologyЦентральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора100820251509202510243914031008202510082025Copyright ©; 2025, Zamotaeva T.L., Dedyaeva E.A., Mikheeva O.O., Pika M.I., Cherkashin E.A., Cherkashina A.S., Akimkin V.G.Copyright ©; 2025, Замотаева Т.Л., Дедяева Е.А., Михеева О.О., Пика М.И., Черкашин Е.А., Черкашина А.С., Акимкин В.Г.2025Zamotaeva T.L., Dedyaeva E.A., Mikheeva O.O., Pika M.I., Cherkashin E.A., Cherkashina A.S., Akimkin V.G.Замотаева Т.Л., Дедяева Е.А., Михеева О.О., Пика М.И., Черкашин Е.А., Черкашина А.С., Акимкин В.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18909

Introduction. Bst polymerase plays a key role in the rapid diagnosis of infectious diseases due to its unique biochemical properties and potential application in loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Several analogs of Bst polymerase have been described in the literature; however, these enzymes have not been widely used in molecular diagnostics.

The aim of the study is to obtain recombinant Bst and Btlv polymerases with the Sso7d domain and to test new possibilities for their application.

Materials and methods. Expression constructs carrying the polymerase gene were obtained using standard genetic engineering methods. The target enzyme was produced in Escherichia coli cells. Purification was carried out using metal-affinity chromatography methods followed by dialysis and concentration. RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) and DNA polymerase activities of the enzymes were determined using non-radioactive methods with fluorescent detection. The functional properties of the enzymes were assessed using the Amplisens SARS-CoV-2-IT reagent kit and a method designed for the detection of mumps virus RNA in biological material using the LAMP format combined with reverse transcription.

Results. In the E. coli-based expression system, the following recombinant chimeric enzymes with displacing activity have been obtained: Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 and Btlv_Sso7d. The developed cultivation and purification protocols allow for the production of enzymes in soluble form with a yield of up to 25% of the collected cell mass. Functional testing showed that in LAMP, the chimeric polymerases demonstrated similar activity to Bst polymerase without the Sso7d domain. At the same time, the Btlv_Sso7d polymerase exhibited increased reverse transcriptase activity and resistance to inhibitors.

Conclusion. The obtained chimeric polymerase Btlv_Sso7d, due to its improved properties, can be used in reagent kits for the diagnosis of infectious diseases by the LAMP method when using nucleic acid extraction methods.

Введение. Bst-полимераза играет ключевую роль в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний благодаря своим уникальным биохимическим свойствам и возможности применения в петлевой изотермической амплификации (LAMP). В литературе описано несколько аналогов Bst-полимеразы, однако данные ферменты не получили широкого применения в молекулярной диагностике.

Цель работы — получение рекомбинантных Bst- и Btlv-полимераз с Sso7d-доменом и тестирование новых возможностей для их применения.

Материалы и методы. Экспрессионные конструкции, несущие ген полимеразы, получали стандартными методами генетической инженерии. Целевой фермент был наработан в клетках Escherichia coli. Очистку проводили методами металл-аффинной хроматографии с последующим диализом и концентрированием. РНК-зависимую ДНК-полимеразную (ревертазную) и ДНК-полимеразную активности ферментов определяли с помощью нерадиоактивных методик с флуоресцентной детекцией. Функциональные свойства ферментов оценивали в наборе реагентов «АмплиСенс SARS-CoV-2-IT» и в методике, предназначенной для определения в биологическом материале РНК вируса эпидемического паротита в формате LAMP, совмещённой с обратной транскрипцией.

Результаты. В системе экспрессии на основе клеток E. coli получены рекомбинантные химерные ферменты с вытесняющей активностью: Bst_Sso7d, Bst_Sso7d_mut4 и Btlv_Sso7d. Разработанные протоколы культивирования и очистки позволяют получать ферменты в растворимой форме с выходом до 25% от собранной клеточной массы. Функциональное тестирование показало, что в LAMP химерные полимеразы демонстрировали сходную активность с Bst-полимеразой без Sso7d-домена. Вместе с тем полимераза Btlv_Sso7d имела повышенную ревертазную активность и устойчивость к ингибиторам.

Заключение. Полученная химерная полимераза Btlv_Sso7d, благодаря своим улучшенным свойствам, может быть использована в наборах реагентов для диагностики инфекционных заболеваний методом LAMP при использовании методов экспресс-экстракции нуклеиновых кислот.

Bst polymerasedisplacing activityisothermal amplificationinhibitor resistanceBst-полимеразавытесняющая активностьизотермическая амплификацияустойчивость к ингибиторамThe Russian GovernmentПравительство Российской ФедерацииРубель М.С., Дубровина И.А., Мясников В.А. и др. Сравнительная характеристика современных экспресс-методов диагностики инфекционных заболеваний, основанных на методе изотермической полимеразной цепной реакции. Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2018;(1):160–3. Rubel M.S., Dubrovina I.A., Miasnikov V.A., et al. Comparative characteristics of modern express methods of diagnosing infectious diseases base on isothermal PCR technology. Bulletin of the Russian Military Medical Academy. 2018;(1):160–3. EDN: https://elibrary.ru/emrzyiЧемисова О.С., Цырулина О.А., Трухачев А.Л., Носков А.К. Сравнительный анализ методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(1):126–38. Chemisova O.S., Tsyrulina O.A., Trukhachev A.L., Noskov A.K. Comparative analysis of methods for isothermal amplification of nucleic acids. Journal Of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2022;99(1):126–38. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-176 EDN: https://elibrary.ru/qbqrwjNotomi T., Okayama H., Masubuchi H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63Смирнова Д.И., Петруша О.А., Грачёва А.В. и др. Быстрая диагностика генитального герпеса методом петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(6):40–6. Smirnova D.I., Petrusha O.A., Gracheva A.V., et al. Rapid diagnostics of genital herpes by loop-mediated isothermal amplification method with fluorescent detection. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2019;96(6):40–6. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-40-46 EDN: https://elibrary.ru/yskkecАкимкин В.Г., Петров В.В., Красовитов К.В. и др. Молекулярные методы диагностики новой коронавирусной инфекции: сравнение петлевой изотермической амплификации и полимеразной цепной реакции. Вопросы вирусологии. 2021; 66(6):417–24. Akimkin V.G., Petrov V.V., Krasovitov K.V., et al. Molecular methods for diagnosing novel coronavirus infection: comparison of loop-mediated isothermal amplification and polymerase chain reaction. Problems of Virology. 2022;66(6): 417–24. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-86 EDN: https://elibrary.ru/bsgdloShirshikov F.V., Bespyatykh J.A. Loop-mediated isothermal amplification: from theory to practice. Russ. J. Bioorg. Chem. 2022;48(6):1159–74. DOI: https://doi.org/10.1134/S106816202206022XПика М.И., Михеева О.О., Соловьева Е.Д. и др. Получение Bst-полимеразы для диагностики различных инфекций методом петлевой изотермической амплификации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2023;100(3):210–8. Pika M.I., Mikheeva O.O., Solovyova E.D., et al. Production of Bst polymerase for diagnosis of different infections using loop-mediated isothermal amplification. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2023;100(3):210–8. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-364 EDN: https://elibrary.ru/phcmoqWada K., Suzuki H. Biotechnological platforms of the moderate thermophiles, Geobacillus species: notable properties and genetic tools. In: Salwan R., Sharma V., eds. Physiological and Biotechnological Aspects of Extremophiles. Academic Press; 2020:195–218. DOI: https://doi.org/10.1016/C2018-0-03860-8Stenesh J., McGowan G.R. DNA polymerase from mesophilic and thermophilic bacteria. III. Lack of fidelity in the replication of synthetic polydeoxyribonucleotides by DNA polymerase from Bacillus licheniformis and Bacillus stearothermophilus. Biochim. Biophys. Acta. 1977;475(1):32–41. DOI: https://doi.org/10.1016/0005-2787(77)90336-7Chien A., Edgar D.B., Trela J.M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bacteriol. 1976;127(3):1550–7. DOI: https://doi.org/10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976Oscorbin I., Filipenko M. Bst polymerase – a humble relative of Taq polymerase. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2023;21:4519–35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.csbj.2023.09.008Li P., Amenov A., Kalendar R., et al. Cloning and purification of large fragment of DNA polymerase I from geobacillus stearothermophilus and application in isothermal DNA amplification. Eurasian J. Appl. Biotechnol. 2017;(1):50–8. EDN: https://elibrary.ru/zbenmtOscorbin I.P., Boyarskikh U.A., Filipenko M.L. Large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus sp. 777: сloning and comparison with DNA polymerases I in practical applications. Mol. Biotechnol. 2015;57(10):947–59. DOI: https://doi.org/10.1007/s12033-015-9886-xChander Y., Koelbl J., Puckett J., et al. A novel thermostable polymerase for RNA and DNA loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Front. Microbiol. 2014;5:395. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00395Wang Y., Prosen D.E., Mei L., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res. 2004;32(3):1197–207. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkh271Sidstedt M., Rådström P., Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS-mechanisms and solutions. Anal. Bioanal. Chem. 2020;412(9):2009–23. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-020-02490-2Oscorbin I.P., Belousova E.A., Boyarskikh U.A., et al. Derivatives of Bst-like Gss-polymerase with improved processivity and inhibitor tolerance. Nucleic Acids Res. 2017;45(16):9595–610. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkx645Li J., Li Y., Li Y., et al. An enhanced activity and thermostability of chimeric Bst DNA polymerase for isothermal amplification applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2023;107(21):6527–40. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-023-12751-6Yu Z., Wang J. Strategies and procedures to generate chimeric DNA polymerases for improved applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2024;108(1):445. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-024-13276-2Paik I., Bhadra S., Ellington A.D. Charge engineering improves the performance of Bst DNA polymerase fusions. ACS Synth. Biol. 2022;11(4):1488–96. DOI: https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00559Ordóñez C.D., Lechuga A., Salas M., Redrejo-Rodríguez M. Engineered viral DNA polymerase with enhanced DNA amplification capacity: a proof-of-concept of isothermal amplification of damaged DNA. Sci. Rep. 2020;10(1):15046. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-71773-6Coulther T.A., Stern H.R., Beuning P.J. Engineering polymerases for new functions. Trends Biotechnol. 2019;37(10):1091–103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.03.011Lischer K., Tansil K.P., Ginting M.J., et al. Cloning of DNA Polymerase I Geobacillus thermoleovorans SGAir0734 from a Batu Kuwung Hot Spring in Escherichia coli. Int. J. Technol. 2020;11(5):921–30. DOI: https://doi.org/10.14716/ijtech.v11i5.4311Gaultier N.E., Junqueira A.C.M., Uchida A., et al. Genome sequence of Geobacillus thermoleovorans SGAir0734, isolated from Singapore air. Genome Announc. 2018;6(27):e00636–18. DOI: https://doi.org/10.1128/genomea.00636-18Xiong A.S., Yao Q.H., Peng R.H., et al. A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Nucleic Acids Res. 2004;32(12):e98. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gnh094Черкашина А.С., Михеева О.О., Пика М.И. и др. Способ получения большого фрагмента Bst-полимеразы (варианты). Патент РФ № 2 809 366;2023. Cherkashina A.S., Mikheeva O.O., Pika M.I., et al. Method for obtaining a large fragment of Bst polymerase (variants). Patent RF № 2 809 366;2023.Брагин А.Г., Глушков С.А., Иванов М.К. и др. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Биохимия. 2008;73(9)1252–64. EDN: https://elibrary.ru/jubdgz Bragin A.G., Glushkov S.A., Ivanov M.K., et al. Determination of DNA polymerase and nuclease activities of DNA-dependent polymerases using real-time fluorescent detection. Biochemistry. 2008;73(9):1007–17. DOI: https://doi.org/10.1134/S0006297908090083 EDN: https://elibrary.ru/lliwvlLaemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680–5. DOI: https://doi.org/10.1038/227680a0Napoli A., Zivanovic Y., Bocs C., et al. DNA bending, compaction and negative supercoiling by the architectural protein Sso7d of Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res. 2002;30(12):2656–62. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkf377Xiang R., Liu G.Y., Hou Y., et al. Double domain fusion improves the reverse transcriptase activity and inhibitor tolerance of Bst DNA polymerase. Int. J. Biol. Macromol. 2024;274(Pt. 1):133243. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.133243Hernández-Rollán C., Ehrmann A.K., Vlassis A., et al. Neq2X7: a multi-purpose and open-source fusion DNA polymerase for advanced DNA engineering and diagnostics PCR. BMC Biotechnol. 2024;24(1):17. DOI: https://doi.org/10.1186/s12896-024-00844-7