Получение рекомбинантного белка VP1 норовируса и его антигенные и иммуногенные свойства

Полный текст

Введение

В этиологической структуре вирусных острых кишечных инфекций норовирусы (НВ; сем. Caliciviridae, род Norovirus) находятся на 2-м месте после ротавирусов. В странах, проводящих вакцинацию против ротавирусов, НВ вышли на 1-е место [1, 2]. В группы риска заражения НВ входят дети, молодые и пожилые люди. Вспышки инфекции НВ регистрируются в течение всего года с подъёмом заболеваемости в весенние и летние месяцы.

НВ человека представляет собой икосаэдрический вирус без оболочки, имеет геном в виде одноцепочечной позитивно-смысловой РНК длиной примерно 7,5–7,7 кб, кодирующей 3 открытые рамки считывания. Капсид вируса построен из наружного (VP1) и внутреннего (VP2) белков. ORF1 кодирует большой полипротеин, предшественник 6 неструктурных белков (NS1/2–NS7), ORF2 — основной структурный белок VP1 капсида, ORF3 — минорный структурный белок VP2 капсида, который расположен внутри вирусной частицы. VP1 способен самособираться в вирусоподобные частицы, которые практически неотличимы от нативных вирионов и обладают выраженными иммуногенными свойствами.

Для НВ известны 10 геногрупп, на основе анализа аминокислотной последовательности наружного капсидного белка VP1 выделены 48 генотипов. Наиболее распространённой геногруппой НВ является GII, на долю которой в России приходится большинство случаев НВ-гастроэнтерита детей первых лет жизни. Так, в Свердловской области в 2022 г. наибольший удельный вес в генотипической структуре циркулирующих НВ занимaли НВ, относящиеся к геногруппе GII (58%) Сходные данные были получены в ходе молекулярно-эпидемиологического анализа генетических вариантов НВ в ряде других европейских стран, Японии и Китае. В отдельные годы на долю геногруппы GII приходилось до 80–90% случаев НВ-гастроэнтерита детей. К доминирующим вариантам вируса этой геногруппы относят НВ GII.4 [3, 4]. Значимость НВ в инфекционной патологии человека и опасность возникновения крупных эпидемических вспышек в организованных коллективах определяют необходимость разработки средств специфической профилактики инфекции. На примере успешного внедрения ротавирусной вакцины показано, что программы вакцинации могут значительно снизить количество случаев гастроэнтерита [5]. На основе белков НВ в мире также разрабатывается несколько кандидатных вакцин против НВ, две из которых в настоящее время находятся на II/III стадии клинических испытаний и предназначены для профилактики инфекции НВ у детей и взрослых [6, 7].

Целью работы явилось получение и анализ иммуногенных и антигенных свойств рекомбинантного белка НВ VP1.

Материалы и методы

Анализ нуклеотидных последовательностей, дизайн олигонуклеотидов, конструирование гена, расчёт молекулярной массы белка, изоэлектрической точки и коэффициента экстинкции осуществляли с помощью пакета программного обеспечения «Lasergene 7.1.0» («Dnastar, Inc.»). Оптимизацию кодонов проводили на основе базы данных Codonusage database¹. В работу была взята нуклеотидная последовательность VP1 эпидемического варианта НВ с генотипом GII.4, доминирующего на территории Нижегородской области. Нуклеотидные последовательности секвенировали с использованием генетического анализатора «ABI Prism 310» («Thermo Fisher Scientific»).

Клетки Escherichia coli, штамм Rosetta 2 (DE3), трансформированные полученной генетической конструкцией на основе плазмиды pET22b и кодирующей VP1 НВ, выращивали в среде LB-Miller pH 7,0. Индукцию синтеза белка проводили путём добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до конечной концентрации 0,5 мM к каждой культуре. Биомассы клеток получали центрифугированием, лизировали в растворе, содержащем 25 мМ HEPES (pH 7,5), 1 М NaCl, 10% глицерина, 1% Triton X-100, ДНКазы I (10 мкг/мл), РНКазыА (10 мкг/мл), лизоцима (50 мкг/мл), 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида, дезинтегрировали ультразвуком с помощью «QSonica Q55» («QSonica sonicators»), центрифугировали и добавляли промывочный буфер, содержащий 25 мМ HEPES pH 7,5, 1 М NaCl, 10% глицерина, 1 М мочевины с последующим центрифугированием.

Выделение VP1 НВ проводили методом металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях с помощью сорбента Ni-NTA Superflow («GEHealthcare»). Ренатурацию VP1 осуществляли с помощью диализа. Электрофорез белков в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили общепринятым методом, иммуноблоттинг — с использованием сывороточных антител (АТ) человека против VP1 НВ и конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных АТ к IgG человека «Hytest». После переноса белки на мембране окрашивали в растворе субстрата Super Signal West Dura Extended Duration Substrate («Thermo Scientific») и измеряли хемилюминесценцию с помощью сканера «C-DiGit Blot Scanner» («Li-Сor»). Микрофотографии вирусоподобных частиц, образуемых VP1 НВ, получали с помощью электронного микроскопа «НТ7700» («Hitachi»). Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/c возрастом 8 нед и массой 16–18 г. Животных содержали в условиях вивария в соответствии с межгосударственными стандартами ГОСТ 33216-2014 и ГОСТ 33215-2014. Биоматериал для исследования брали у мышей с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах европейского сообщества (86/609/ЕС).

Исследования проводили согласно биоэтическим и этическим принципам, установленным Хельсинкской декларацией (принятой в июне 1964 г. и пересмотренной в октябре 2013 г.). Для оценки антигенных свойств рекомбинантных белков использовали 637 образцов плазмы крови, полученных из диагностического центра «Гемохелп» (ООО «ТИАС ЛОТУС») от лиц в возрасте 19–44 лет, обратившихся для проведения диагностических исследований и давших письменное согласие на использование их биоматериала в исследовании.

АТ к VP1 НВ определяли с помощью твёрдофазного иммуноферментного анализа. VP1 сорбировали в лунки планшетов в концентрации 1 мкг/мл в течение 18 ч при 20^oC. Тестируемую сыворотку крови мышей разводили с шагом 2, плазму крови волонтёров разводили перед тестированием с шагом 10. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку неиммунизированных мышей. При определении АТ в крови лабораторных животных использовали конъюгированные с пероксидазой корня хрена кроличьи АТ против иммуноглобулинов мыши. При определении АТ человека использовали конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи АТ против иммуноглобулинов классов G, M и А (IgG, IgM, IgA). За положительную реакцию принимали значение оптической плотности больше среднего значения отрицательного контроля, умноженного на 3.

Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения «Microsoft Excel» («Microsoft»). Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «Graph Pad Prism 8» («Graph Pad Software»). Различия в данных считали статистически достоверными при р ≤ 0,05.

Результаты

В начало нуклеотидной последовательности, кодирующей белок VP1 эпидемически значимого штамма НВ генотипа GII.4, был внесён сайт для эндонуклеазы рестрикции NdeI. К последовательности, кодирующей С-терминальную часть белка, была добавлена нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 гистидинов, стоп-кодон (ТАА) и сайт для рестриктазы XhoI, использованные для последующего молекулярного клонирования. Схематичное строение гена представлено на рис. 1. Полученную последовательность синтезировали в фирме «Евроген». Последовательность, кодирующая VP1, была перенесена в плазмиду pET22b («Thermo Fisher Scientific»), позволяющую с высокой эффективностью экспрессировать рекомбинантные белки в штаммах E. coli, содержащих в геноме DE3 лизоген [8].

 

Рис. 1. Схематичное строение генетической конструкции, кодирующей VP1 НВ в составе pET22b.

Fig. 1. Schematic representation of the genetic construct encoding VP1 of norovirus in pET22b.

 

Полученной генетической конструкцией, кодирующей VP1 НВ, трансформировали клетки E. coli, штамм Rosetta 2 (DE3). Была оценена эффективность продукции белка, составившая 20–40 мг белка на 1 л клеточной культуры. Белок формировал «тельца включения». Определён оптимальный состав среды и условия культивирования трансформированных клеток E. coli. Максимальная плотность культуры клеток (OD₆₀₀ = 2,8) соответствовала 5 г биомассы на 1 л культуры в среде LB, содержащей 0,5% глицерина и 25 мМ фосфатного буфера pH 7,4. Оптимальная концентрация изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида составила 0,5 мМ, оптимальная температура для экспрессии белков — 30ºС, время индукции — 4–8 ч.

В результате последующей очистки с помощью металл-хелатной хроматографии в присутствии 8 М мочевины и рефолдинга путём диализа против раствора, содержащего 25 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl и 5% глюкозы, получен растворимый белок, состоящий из 560 аминокислот, имеющий расчётную молекулярную массу 60,6 кДа, изоэлектрическую точку, равную 6,15, и коэффициент экстинции 1,04 (рис. 2, а).

 

Рис. 2. Характеристика рекомбинантного белка VP1.

а — электрофореграмма очищенного VP1 белка НВ; б — вестерн-блот рекомбинантного VP1 НВ; 1 — VP1; 2 — маркеры молекулярной массы; в — электронно-микроскопические фотографии вирусоподобных частиц, образуемых рекомбинантным VP1 НВ. Контрастирование 3% уранилацетатом pH 4,6.

Fig. 2. Characteristics of the recombinant VP1 protein.

a — electrophoregram of purified norovirus VP1 protein; b — Western-blot of purified norovirus VP1 protein; 1 — VP1; 2 — molecular weight marker; с — electron microscopic photographs of virus-like particles formed by recombinant norovirus VP1. Contrast with 3% uranyl acetate, pH 4.6.

 

Белок наработан в препаративных количествах и использован для оценки способности формировать вирусоподобные частицы и для иммунизации лабораторных мышей. На рис. 2, б представлена электронно-микроскопическая фотография, свидетельствующая о способности рекомбинантного белка VP1 образовывать вирусоподобные частицы диаметром 30–50 нм, что соответствует данным других авторов [9]. При этом вестерн-блот (рис. 2, в) показал способность рекомбинантного VP1 взаимодействовать с сывороточными АТ серопозитивных лиц.

Двукратная внутрибрюшинная иммунизация 10 лабораторных мышей с интервалом в 2 нед и последующим получением сыворотки крови через 3 нед после 2-й иммунизации в дозе 10 мкг (0,5 мл) приводила к образованию в крови животных АТ против VP1 НВ. АТ в крови животных обнаруживались в титрах от 1 : 1024 до 1 : 4096, средний титр составил величину, равную 1 : 1536. Иммунизация животных той же дозой белка по той же схеме, но в смеси с 100 мг гидроокиси алюминия вызвала появление АТ к VP1 НВ в титрах до 1 : 32 768. В среднем титр АТ был равен 1 : 13 720, что почти на порядок превышало титры АТ у животных, иммунизированных без гидроокиси алюминия (рис. 3). Таким образом, показано, что полученный рекомбинантный белок способен вызвать выраженный антительный ответ, значительно повышающийся в присутствии использованного адъюванта.

 

Рис. 3. Титры АТ у мышей, иммунизированных рекомбинантным VP1 НВ.

1 — без гидроокиси алюминия; 2 — с гидроокисью алюминия.

Fig. 3. Antibody titers in mice immunized with recombinant norovirus VP1.

1 — without aluminum hydroxide; 2 — with aluminum hydroxide.

 

Поскольку НВ широко циркулирует среди населения, закономерно ожидать наличие АТ к его белкам в крови людей. Проведена оценка наличия АТ разных классов к полученному рекомбинантному белку в крови лиц, проживающих в средней полосе России. Определяли частоту обнаружения АТ к VP1 в образцах плазмы крови 637 волонтёров. Как следует из рис. 4, АТ класса IgG обнаруживались у 14,8% волонтёров, АТ класса IgM — у 7,1%, АТ класса IgА — у 38,5%. Суммарная встречаемость АТ составила 47,4%.

 

Рис. 4. Частота детекции АТ разных классов к рекомбинантному VP1 НВ в крови здоровых волонтёров.

Fig. 4. Detection rate of antibodies of different classes to recombinant norovirus VP1 in the blood of healthy volunteers.

 

Результаты свидетельствуют о том, что эпитопы полученного нами рекомбинантного VP1 НВ GII.4 распознаются АТ, присутствующими в крови человека. Однако титры АТ класса IgG в большинстве своем были невелики и превышали у серопозитивных волонтеров величину, равную 1 : 1000 и более, только в 4,3% случаев (4 из 94), что свидетельствует о давнем инифицировании этих лиц НВ. У волонтёров, имевших АТ к VP1 НВ класса IgA, высокие титры (равные 1 : 1000 и более) обнаруживались со сходной частотой (4,9% случаев). В то же время из 25 волонтёров, имевших АТ к VP1 НВ класса IgM, титры, равные 1 : 1000 и более, обнаружены в 16% случаев. Вероятно, эти лица имели недавний контакт с вирусом.

Обсуждение

Полученные данные о частоте встречаемости АТ против VP1 НВ GII.4 и их титрах соответствуют результатам других авторов. Сообщается о широком разбросе в частоте обнаружения АТ и их титрах у лиц разного возраста, проживающих в разных странах. Суммарная частота обнаружения колеблется от 25 до 95%. При этом наблюдается перекрёстная реактивность с НВ других геногрупп [10, 11].

Белок VP1 НВ состоит из 2 доменов, принимающих участие в самосборке вирусоподобных частиц [12]. Cпособность VP1 НВ к самосборке может быть использована для получения образующих вирусоподобные частицы химерных белков, состоящих из S-домена VP1 НВ и фрагментов других белков, выступающих в качестве антигена. То есть, существует возможность декорирования разными антигенами вирусоподобных частиц НВ, что продемонстрировано в работах ряда авторов [13–15]. Генетическая конструкция, кодирующая полученный нами рекомбинантный белок, может быть применена в качестве молекулярной платформы для создания химерных вирусоподобных частиц на основе VP1 НВ.

Заключение

Полученный нами рекомбинантный VP1 НВ, экспрессированный в E. coli, способен формировать вирусоподобные частицы, проявляет иммуногенность у мышей в отсутствие и в присутствии адъюванта и распознается АТ человека классов IgG, IgM, IgA. Результаты работы свидетельствуют о возможности использования рекомбинантного VP1 в качестве антигена при конструировании вакцины для профилактики инфекции НВ, основанной на вирусоподобных частицах.

 

¹ URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/

Об авторах

Владислав Александрович Лапин

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5905-5722

м. н. с. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Дмитрий Викторович Новиков

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

к. б. н., в. н. с. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Екатерина Валерьевна Мохонова

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9742-7646

н. с. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Дмитрий Александрович Мелентьев

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2441-6874

м. н. с. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Мария Игоревна Цыганова

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2811-6844

к. б. н., в. н. с. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Дмитрий Евгеньевич Зайцев

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7663-6924

старший лаборант лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Виктор Владимирович Новиков

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной

Автор, ответственный за переписку.
Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2449-7213

д. б. н., проф., зав. лаб. иммунохимии

Россия, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы