Разработка методики молекулярного типирования штаммов Bacillus anthracis с использованием новых VNTR- и INDEL-маркеров

Полный текст

Введение

Bacillus anthracis — спорообразующая грамположительная палочка, возбудитель сибирской язвы, особо опасной инфекции с глобальным ареалом распространения. В ранних исследованиях попытки определить генетическую вариабельность B. anthracis не увенчались успехом, что говорило о высокой генетической мономорфности этого вида [1]. Первым генетическим маркером, пригодным для дифференциации штаммов B. anthracis, были тандемные повторы в хромосомном локусе vrrA — последовательно повторяющиеся идентичные фрагменты ДНК (variable number tandem repeats, VNTR) [2]. Аллельные варианты vrrA с числом повторов от 2 до 6 позволяли разделить все штаммы на 5 групп [2, 3]. Маркер вошёл в первую схему типирования методом мультилокусного VNTR-анализа MLVA8 (Multiple loci VNTR analysis, MLVA), состоящую из 6 хромосомных и 2 плазмидных VNTR-локусов. VNTR-локусы в целом отличаются от других вариабельных областей тем, что имеют бóльшую частоту изменчивости и большее количество вариантов, а также проявлением эффекта гомоплазии, т.е. независимыми или параллельными мутациями у разных генетических линий [4]. Поэтому при генотипировании на основе анализа VNTR-локусов затруднительно изучение внутривидовой эволюции, но при этом данный метод удобен в эпидемиологическом расследовании вспышек сибирской язвы. Активные поиски локусов B. anthracis с тандемными повторами привели к открытию 32 VNTR-маркеров в 6 схемах MLVA-генотипирования [5–10].

С целью исследования генетического разнообразия был разработан и апробирован на значительной выборке штаммов метод генотипирования на основе анализа «канонических» SNP (canSNP-типирование) с определением 12 основных генетических линий [8]. Канонические линии наиболее точно отражают эволюционные группы B. anthracis, поэтому лучше всего подходят для описания распределения штаммов возбудителя сибирской язвы в мире. В дальнейшем были выполнены масштабные филогенетические исследования с подробным описанием, созданием номенклатуры названий и связей генетических кластеров. Подкластерам канонических линий были присвоены номера или тривиальные имена [11, 12]. В частности, каноническая линия A.Br.008/009 включает в себя подгруппы Tsiankovskii и STI, широко представленные на территории Содружества Независимых Государств.

В 2019 г. в Республике Дагестан произошла вспышка сибирской язвы с изолятами, которые кластеризовались в отдельную филогенетическую группу A.Br.125, принадлежащую STI.

Каноническая линия B.Br.001/002 содержит кластеры Siberia и Europe, составляя B.Br.014, а также кластеры Asia и B.Br.018.

С учётом устоявшихся и вновь идентифицированных обозначений генетических линий и групп в последующем описании мы использовали следующий порядок. Сначала указывается каноническая линия, затем новая подгруппа или кластер в её пределах c устоявшимся обозначением, если таковые идентифицированы. Например, большинство штаммов основной линии A, выделенных на территории России, обозначаются как относящиеся к A.Br.008/009 (Tsiankovskii) или A.Br.008/009 (STI).

К молекулярным маркерам также относятся INDEL (insertion/deletion) — вариабельные области, не содержащие повторов, которые существуют преимущественно в виде двух генетических вариантов: c делецией или с инсерцией.

Для бактерии Francisella tularensis была разработана схема INDEL-типирования, включающая 38 INDEL-локусов. Исследование показало, что применение таких маркеров повышает точность типирования [13]. Методики генотипирования на основе анализа INDEL-локусов также созданы для Helicobacter pylori, Burkholderia pseudomallei, Vibrio cholerae, Yersinia pseudotuberculosis и доказали свою высокую разрешающую способность и надёжность в определении филогенетического положения штаммов [14–17]. В настоящее время система INDEL-генотипирования для B. anthracis не разработана.

Целями исследования были поиск, описание VNTR- и INDEL-локусов B. anthracis и разработка на их основе методики генотипирования посредством ПЦР с электрофоретической детекцией результатов.

Материалы и методы

Поиск маркеров и филогенетический анализ выполняли на выборке из 388 геномов штаммов B. anthracis: 322 — из коллекции GenBank (RefSeq), 66 — из коллекции геномов патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института, описанных ранее [12]. Номера геномов приведены в Приложении 1 на сайте журнала (https://doi.org/10.36233/0372-9311-487-s1). Геномные последовательности штаммов B. anthracis из коллекции Ставропольского противочумного института депонированы в «Национальный интерактивный каталог патогенных микроорганизмов и биотоксинов» (Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии).

Поиск маркеров осуществляли посредством алгоритма (пайплайна), состоящего из попарного выравнивания полных геномов на референсную последовательность с использованием программы «Mauve» и далее, с помощью авторских скриптов на языке Python, извлечения из выравниваний генетических вариантов, объединения и их анализа.

Верификацию маркеров и определение длин маркеров производили в программе «BLASTn» с помощью фланкирующих последовательностей или определённых праймеров.

С целью сопоставления филогенетических групп с генетическими маркерами выполняли построения филогенетической дендрограммы на основе SNP корового выравнивания с помощью программы «Parsnp» из пакета «Harvest suit» с референсным геномом B. anthracis Ames Ancestor (GCF_000008445.1). Из коровых SNP удаляли позиции, имеющие неизвестный нуклеотид «N». Далее SNP из файла VCF конвертировали в файл FASTA. Филогенетическое дерево строили в программе «MEGA XI» методом максимального правдоподобия с моделью замен Tamura-Nei [18].

Сопоставление длин генетических вариантов маркеров c филогенетической дендрограммой и визуализацию данных осуществляли в среде языка R с библиотеками ggtree и ggplot2.

Конструирование праймеров осуществляли с использованием программы «Primer-BLAST», их синтез проводили в Ставропольском противочумном институте.

Пробоподготовку культур B. anthracis проводили согласно c МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». Экстракцию ДНК B. anthracis осуществляли с применением набора «ДНК-сорб-B» («ИЛС»).

Для верификации данных в ПЦР с электрофоретической детекцией использовали представительную филогенетическую выборку из секвенированных штаммов. ПЦР выполняли с помощью набора «ScreenMix-HS» («Евроген»). Количество праймеров в реакции равнялось 0,3 мкM. Использовали следующий режим термоциклирования: первый этап (активация) — 95^оС, 5 мин — 1 цикл, второй этап — денатурация 95^оС, 20 с, отжиг 60^оС, 20 с, элонгация 72^оС, 60 с — 40 циклов, третий этап (финальная элонгация) — 72^оС, 5 мин — 1 цикл. Электрофорез проводили в 2% агарозном геле с применением стандарта молекулярных размеров 100 п. н. («СибЭнзайм»).

Кластеризацию данных, полученных по результатам ПЦР с электрофоретической детекцией, выполняли методом single (Nearest Point Algorithm) на языке Python с библиотекой scipy.

Результаты и обсуждение

Исследование включало два этапа. На первом этапе выполняли поиск и описание маркерных локусов, на втором — осуществляли экспериментальное подтверждение и апробацию методики типирования с использованием найденных маркеров.

В результате работы алгоритма были обнаружены следующие геномные вариации: SNP — 25 664, SNR — 14 387, VNTR — 693, INDEL — 14 667.

Поиск маркеров среди всех найденных вариаций производили поэтапно с фильтрацией по ряду критериев. Разница размеров вариантов вариабельных локусов должна быть не менее 15 п. н. Отбирали преимущественно такие локусы, у которых хотя бы один генетический вариант в наборе штаммов B. anthracis из коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института был отличен от вариантов остальных штаммов. Исключали уже описанные вариабельные локусы. С учётом критериев было найдено 537 вариабельных областей.

Вслед за этим исследовали частоту встречаемости аллельных вариантов локусов штаммов в определённых генетических линиях, для этого сопоставляли длины генетических вариантов маркеров с филогенетической дендрограммой, построенной на SNP корового генома (рис. 1). Большинство вариантов локусов встречались только у 1 штамма или минимального количества штаммов. Значительную группу составляли варианты, разделяющие основные генетические линии A, B, и C, в том числе ранее найденный INDEL indE1 размером 38 п. н. [19], что логично, т. к. это наиболее эволюционно далёкие генетические линии.

 

Рис. 1. Сопоставление филогенетической дендрограммы и выбранных маркеров B. anthracis (часть штаммов с повторяющимся паттернами маркеров были удалены).

Цветной вариант рисунка см. на сайте журнала.

Fig. 1. Comparison of the phylogenetic tree and selected markers B. anthracis (some strains with repeated marker patterns were removed).

For a color version of the picture, see the journal’s website.

 

Было отобрано 56 VNTR- и INDEL-локусов (табл. 1). Из них выбирали наиболее филогенетически значимые и оптимальные для проведения электрофореза. Таким образом, в итоге было выбрано 9 VNTR-маркеров и 6 INDEL-маркеров, наиболее подходящих для генотипирования (рис. 1). Особенность найденных INDEL заключается в повторах, фланкирующих INDEL, при этом один из повторов включается в делецию, а другой — нет. По этой причине можно предположить образование сложной структуры между цепями ДНК при репликации, из-за которой полимеразный комплекс может ошибочно удваивать цепь ДНК, вырезая часть последовательности. При этом невозможна обратная вставка INDEL, что, вероятно, уменьшает эффекты гомоплазии.

 

Таблица 1. Описание найденных молекулярных маркеров B. anthracis

Table 1. Description of the identified molecular B. anthracis markers

Маркер Marker	Координаты локуса в геноме по референсному штамму Ames Ancestor (GCF_000008445.1) Coordinates of the locus in the genome according to the Ames Ancestor reference strain (GCF_000008445.1)	Репликон Replicon	Номер аллельного варианта (длина генетического варианта, п. н.) The number of the allele variant (the length of the genetic variant, bp)
indS1	1276500–1276764	Хромосома | Сhromosome	1 (265, 266), 2 (241)
indS2	1904893–1905267	Хромосома | Сhromosome	1 (373–375), 2 (312)
indS3	1944246–1944531	Хромосома | Сhromosome	1 (286), 2 (253)
indS4	402388–402715	Хромосома | Сhromosome	1 (328), 2 (423–424)
indS5	655408–655662	Хромосома | Сhromosome	1 (255), 2 (272, 284–285)
indS6	4691499–4691775	Хромосома | Сhromosome	1 (277), 2 (388–389)
vrrS1	1721221–1721733	Хромосома | Сhromosome	1 (513), 2 (425)
vrrS2	4489063–4489484	Хромосома | Сhromosome	1 (422), 2 (381), 3 (299,307), 4 (217), 5 (258) 6 (338–340)
vrrS3	8316–8860	pXO2	1 (544–546), 2 (301–302), 3 (464), 4 (383)
vrrS4	8916–9269	pXO2	1 (354–355), 2 (263–264), 3 (444), 4 (534), 5 (174)
vrrS5	3155556–3155727	Хромосома | Сhromosome	1 (172), 2 (142)
vrrS6	1092722–1092959	Хромосома | Сhromosome	1 (238), 2 (198), 3 (318–319), 4 (398), 5 (278)
vrrS7	5088417–5088723	Хромосома | Сhromosome	1 (306–307), 2 (190), 3 (229), 4 (385), 5 (346), 6 (268) (385)
vrrS8	5031546–5031803	Хромосома | Сhromosome	1 (258, 263–265), 2 (354, 359–366)
vrrS9	3742896–3743541	Хромосома | Сhromosome	1 (646), 2 (450)
indNS1	130607–131099	pXO1	1 (454, 456), 2 (494–495)
indNS2	596340–596832	Хромосома | Сhromosome	1 (352), 2 (492–493)
indNS3	122138–122690	pXO1	1 (551–555), 2 (485, 487)
indNS4	77192–77540	pXO1	1 (330), 2 (349), 3 (619)
indNS5	482012–482157	Хромосома | Сhromosome	1 (146,149), 2 (504)
indNS6	385564–385837	Хромосома | Сhromosome	1 (271–276), 2 (305–308)
indNS7	1372136–1372298	Хромосома | Сhromosome	1 (163), 2 (181)
indNS8	2559203–2559485	Хромосома | Сhromosome	1 (282–284), 2 (335–336)
indNS9	3855034–3855252	Хромосома | Сhromosome	1 (219), 2 (231), 3 (239–241)
indNS10	4303573–4303825	Хромосома | Сhromosome	1 (253), 2 (310–311)
indNS11	4965875–4966088	Хромосома | Сhromosome	1 (214), 2 (321)
indNS12	1209302–1209701	Хромосома | Сhromosome	1 (253), 2 (399–401)
indNS13	2728738–2729257	Хромосома | Сhromosome	1 (229), 2 (519–520)
indNS14	486258–486638	Хромосома | Сhromosome	1 (285), 2 (381)
indNS15	1287411–1287701	Хромосома | Сhromosome	1 (201), 2 (291)
indNS16	910496–910796	Хромосома | Сhromosome	1 (301), 2 (490,491)
indNS17	2533966–2534193	Хромосома | Сhromosome	1 (228), 2 (634–636)
indNS18	2593388–2593616	Хромосома | Сhromosome	1 (228–230), 2 (283)
indNS19	3352013–3354229	Хромосома | Сhromosome	1 (193,194), 2 (2124), 3 (2207, 2215–2218, 2223)
indNS20	3829833–3830053	Хромосома | Сhromosome	1 (220–221), 2 (251)
indNS21	4811428–4811664	Хромосома | Сhromosome	1 (236–237), 2 (600, 602)
indNS22	29253–29436	pXO1	1 (184), 2 (269)
indNS24	1146673–1147101	Хромосома | Сhromosome	1 (256), 2 (270–272), 3 (427–430)
indNS25	2224848–2225376	Хромосома | Сhromosome	1 (270), 2 (418), 3 (529–530, 537)
indNS26	2687438–2687847	Хромосома | Сhromosome	1 (240–241), 2 (410,408–410), 3 (429) 4 (580)
indNS27	3304833–3305473	pXO1	1 (245, 257), 2 (640–641)
vrrNS1	226241–226786	Хромосома | Сhromosome	1 (545–547), 2 (694, 697–699), 3 (845–847), 4 (997–998), 5 (1146), 6 (1296–1298)
vrrNS2	1333990–1334961	Хромосома | Сhromosome	1 (343), 2 (554, 552), 3 (700), 4 (758, 762–763), 5 (779), 6 (971–974), 7 (1182–1183), 8 (1393)
vrrNS3	2014690–2015095	Хромосома | Сhromosome	1 (277), 2 (364), 3 (406, 409), 4 (535)
vrrNS4	4233686–4234066	Хромосома | Сhromosome	1 (237), 2 (273, 279), 3 (306, 309, 322), 4 (381), 5 (417), 6 (345)
vrrNS5	4351696–4351908	Хромосома | Сhromosome	1 (213), 2 (231)
vrrNS6	4598742–4598948	Хромосома | Сhromosome	1 (195, 207), 2 (171, 183)
vrrNS7	811781–812154	Хромосома | Сhromosome	1 (284), 2 (302), 3 (320), 4 (374), 5 (428), 6 (482)
vrrNS8	1395847–1396186	Хромосома | Сhromosome	1 (340), 2 (385)
vrrNS9	1238148–1238579	Хромосома | Сhromosome	1 (361, 366), 2 (398), 3 (430–433), 4 (465), 5 (498)
vrrNS10	2264930–2265251	Хромосома | Сhromosome	1 (244), 2 (283), 3 (322), 4 (361), 5 (439), 6 (517)
vrrNS11	4352078–4352327	Хромосома | Сhromosome	1 (220), 2 (235), 3 (250, 251), 4 (264–266), 5 (295), 6 (310)
vrrNS12	4927425–4927645	Хромосома | Сhromosome	1 (181), 2 (221)
vrrNS13	4769700–4770199	Хромосома | Сhromosome	1 (499–501), 2 (352–353)
vrrNS15	1151194–1151463	Хромосома | Сhromosome	1 (148), 2 (269–270), 3 (291), 4 (392–393, 396), 5 (514, 520)
vrrNS16	2006677–2007157	Хромосома | Сhromosome	1 (481), 2 (433, 435–436), 3 (526), 4 (301), 5 (345–347), 6 (390–391), 7 (255–257)

 

Инделы indS1 (ген FAD-binding oxidoreductase), indS2 (ген гипотетического протеина WP_000829051.1) и indS6 (ген cell surface protein), локализованные в кодирующих белки генах, являются геномными вариациями без сдвига рамки считывания. Индел indS4 локализуется в регионе между генами GBAA_RS02140 (ABC transporter ATP-binding protein) и GBAA_RS02145 (ABC-F family ATP-binding cassette domain-containing protein). IndS5 локализуется в регионе между генами GBAA_RS03470 (hypothetical protein) и GBAA_RS03475 (alanine:cation symporter family protein). Индел indS3 сдвигает рамку считывания гена, кодирующего белок SPFH/Band 7/PHB domain protein.

Генетический вариант индела indS1 с делецией характерен для кластера A.Br.008/009 (Tsiankovskii). Индел indS2 необычен тем, что существуют 3 генетических варианта данного локуса: инсерция и 2 варианта делеций. Разницей между двумя делециями является сдвиг в 9 пар нуклеотидов. Один вариант характерен для подгрупп Siberia и Europe canSNP группы B.Br.001/002, другой характерен для штаммов группы B.Br.Kruger. Вариант локуса indS3 с делецией встречается у штаммов группы A.Br.Aust94, за исключением штамма 9080-G, выделенного в Грузии, и штамма Kanchipuram из Индии. Варианты инделов с делецией indS4, indS5, indS6 встречаются у кластеров A.Br.004, A.Br.001 и группы A.Br.Ames соответственно.

Количество аллельных вариантов выбранных VNTR-маркеров варьируют от 2 до 6 c длиной повтора от 30 п. н. до 196 п. н. (рис. 1). Локус vrrS1 имеет вариант 425 п. н., встречающийся у A.Br.008/009 и A.Br.WNA, а также один уникальный вариант длиной 337 п. н., специфичный для штамма 228/269. Генетические варианты локуса vrrS2 встречаются у групп A.Br.008/009 и A.Br.Aust94. Два VNTR-маркера — vrrS3 и vrrS4 — были обнаружены на плазмиде pXO2. Отдельные генетические варианты vrrS3 встречаются у A.Br.008/009 (Tsiankovskii), B.Br.KrugerB и основной линии B соответственно. Локус vrrS4 разделяет штаммы на линии A и B. Аллельный вариант 142 п. н. vrrS5 встречается одновременно у штаммов линии B, групп A.Br.WNA и A.Br.003/004. Варианты vrrS6 характерны для части штаммов группы A.Br.008/009, кластера A.Br.004 и линии B. Генетический вариант vrrS7 307 п. н. специфичен для группы A.Br.Ames. Вариант 258 п. н. vrrS8 присущ группам A.Br.Ames и A.Br.001/002. Генетический вариант 646 п. н. vrrS9 специфичен для штаммов A.Br.Ames, выделенных в Северной Америке.

Вариабельные локусы могут быть сгруппированы по принадлежности к определённым генетическим кластерам. Так, схожей принадлежностью к группе A.Br.Aust94 обладают варианты инделов indS3, indNS27 и VNTR — vrrNS7. Инделы indS4 и indNS11 характерны для A.Br.004, indNS17 и vrrS9 — для штаммов A.Br.Ames, выделенных в Северной Америке. Варианты инделов indNS5, indNS9, indNS10 встречаются у штаммов групп A.Br.Ames и A.Br.001/002.

Для основной линии B характерными локусами являются indNS1, indNS12, indNS19, indNS2, indNS3, indNS13, indNS14 и vrrNS12. Характерными локусами как для линии B, так и линии С являются indNS18, indNS21, indNS4, indNS6, indNS7 и indNS8.

Часть из невыбранных маркеров также могли бы использоваться при типировании. Например, vrrNS1 имеет высокую вариабельность, но длинный повтор 150 п. н. и большую разницу по длине между минимальным и максимальным генетическим вариантом, что затруднительно для электрофоретической детекции при проведении ПЦР. VNTR vrrNS15 вариабелен в пределах группы A.Br.008/009. Тандемные повторы vrrNS16, vrrNS2, vrrNS4 не имеют строгой специфичности.

Для найденных маркеров были подобраны праймеры (табл. 2) и разработан протокол ПЦР c детекцией результатов методом электрофореза в агарозном геле (рис. 2, рис. 3). Отобранные маркеры имели длину нуклеотидной последовательности, достаточную для надёжного определения генетических вариантов локусов (табл. 3).

 

Таблица 2. Праймеры к VNTR- и INDEL-локусам B. anthracis

Table 2. Primers to VNTR and INDEL loci B. anthracis

Название | Name	Прямой праймер | Forward primer	Обратный праймер | Reverse prime
indS1	TATTGGGCAGCAGCATTTGG	ATGAGTTGTACGGGACGCAA
indS2	TGGAGGGGTTGTTCAAGCG	GCGTAACTCGGAGACCATGTA
indS3	AGCAACAGAAAAATGGGGCG	AATCGCTCTTGCTTCCCCTT
indS4	AGAAGGAACAAAAGGAAAAGTAGAG	CAACATGCTCGCCCTTCAAT
indS5	GGTCTATACGGCACACTCCA	GCTTCCAATATTCCCCCTCC
indS6	AGCCCCTTCTTTCGGTGTAT	CGATGAAGATGTAAGACAGCCC
vrrS1	TCGTCCTGGAGCATCTTTCA	CCAAATCGCCCCTAGACCAA
vrrS2	GTTGTTTCATACGTCTATCCCCTTC	GTCCTTTTGGACAGCCTCTCTT
vrrS3	ACTGTAGTTGTCCCTACCCTT	AGAAGTACAGGTGGGACAGGA
vrrS4	TTTCCTTGCGATGCTTCAGT	TGCTGGTATAGAGCCATCTGC
vrrS5	AGCAATGTTTAATTCACCATCAAGT	GTACGCTTTAGTCGGAGACGG
vrrS6	AGGAAGCAGGTTAGCGTTGT	GCGCTATGTGGCGTCTTTTC
vrrS7	AGGAACACTGGTTCAGCCTAT	AGCAGGATCGCTTGCTAGAT
vrrS8	CTGCAATTGCCTTCGCCTTT	GCGAAAAAGAGAAAGCGCTAC
vrrS9	ATGAAGGTGTGACATGCCGT	GTGAAGCTGTAATTGTGGCGT

 

Рис. 2. Результаты INDEL-типирования штаммов B. anthracis с электрофоретической детекцией.

Цвета шрифтов штаммов соответствуют каноническим линиям согласно рис. 1.

Цветной вариант рисунка см. на сайте журнала.

Fig. 2. Results of PCR reaction of INDEL loci with detection by electrophoresis.

The font colors of the strains correspond to the canonical lineages according to Fig. 1.

For a color version of the picture, see the journal’s website.

 

Рис. 3. Результаты VNTR- типирования штаммов B. anthracis с электрофоретической детекцией.

Цвета шрифтов штаммов соответствуют каноническим линиям согласно рис. 1.

Цветной вариант рисунка см. на сайте журнала.

Fig. 3. Results of PCR reaction of VNTR loci with detection by electrophoresis.

The font colors of the strains correspond to the canonical lineages according to Fig. 1. For a color version of the picture, see the journal’s website.

 

Таблица 3. Длины INDEL- и VNTR-локусов в соответствии с филогенетическими группами

Table 3. Lengths of INDEL and VNTR loci according to phylogenetic groups

Маркеры Markers	Филогенетические группы | Phylogenetic groups
	A.Br. Ames	A.Br. 001/002	A.Br. Aust94	A.Br. 005/006	A.Br. 008/00 (STI)	A.Br. 008/00 (A.Br.125)	A.Br. 008/00 Tsiankovskii	A.Br. 008/009 (228-269)	B.Br. 001/002	B.Br. 001/002 (B.Br.014)
indS1	265	265	265	265	265	241	241	265	265	265
indS2	375	375	375	375	375	375	375	375	375	312
indS3	286	286	253	286	286	286	286	286	286	286
indS4	328	328	328	424	424	424	424	424	424	424
indS5	255	255	285	285	285	285	285	285	285	285
indS6	277	388	388	388	388	388	388	388	388	388
vrrS1	513	513	513	513	425	425	425	337	513	513
vrrS2	422	422	340	422	422	422	422	422	299	299
vrrS3	545	545	545	545	545	545	464	464	383	383
vrrS4	354	354	354	354	354	354	354	354	444	444
vrrS5	172	172	172	172	172	172	172	172	142	142
vrrS6	238	238	238	318	318	318	318	318	278	278
vrrS7	307	346	346	346	346	346	346	346	346	346
vrrS8	258	258	360	360	360	264	360	360	360	360
vrrS9	450	450	450	450	450	450	450	450	450	450

 

Часть штаммов не имеют плазмиды pXO2, соответственно локусы vrrS3 и vrrS4 у них также отсутствуют.

В результате кластеризации при INDEL-типировании штаммы разделялись на 6 кластеров: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.008/009 (Tsiankovskii), B.Br.001/002 (B.Br.014), а также кластер, включающий представителей нескольких генетических групп: A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.005/006 и B.Br.001/002. Кластер выделяется в отдельную группу, т. к. для штаммов этих линий не определены специфические INDEL-маркеры (рис. 4).

 

Рис. 4. Кластеризация штаммов B. anthracis при INDEL- и VNTR-типировании.

Цветной вариант рисунка см. на сайте журнала.

Fig. 4. Clustering of B. anthracis strains based on VNTR and INDEL typing.

For a color version of the picture, see the journal’s website.

 

В результате кластеризация при VNTR-типировании штаммы разделялись на 9 кластеров: A.Br.Ames, A.Br.001/002, A.Br.Aust94, A.Br.005/006, A.Br.008/009 (Tsiankovskii), A.Br.008/009 (STI), A.Br.008/009 (A.Br.125), A.Br.008/009 (штамм 228/269), B.Br.001/002 (рис. 4). Штамм 228/269 входит в группу A.Br.008/009 (Tsiankovskii).

Дискриминирующая способность, определённая с использованием индекса разнообразия Hanter–Gaston [20], для canSNP-типирования составила 0,7, а для типирования на основе анализа новых VNTR- и INDEL-маркеров — 0,79 и 0,84 соответственно.

Заключение

В результате анализа геномов 388 штаммов B. anthracis были найдены и охарактеризованы вариабельные области. Найдены новые VNTR- и INDEL-маркеры и изучена их привязка к кластерам глобальной филогении. Разработанный протокол идентификации маркеров методом ПЦР с электрофоретической визуализацией результатов позволяет надёжно определять аллельные варианты маркеров. Найденные 9 VNTR-маркеров и 6 INDEL-маркеров позволяют разделить штаммы B. anthracis на 6 и 9 генетических групп при типировании с раздельным анализом этих маркеров и на 10 — при совместном. Методику генотипирования на основе анализа новых VNTR- и INDEL-маркеров рекомендуется использовать в совместном или раздельном варианте как дополнение к существующим схемам генотипирования. Использование разработанной методики идентификации вариабельных VNTR- и INDEL-локусов позволяет достоверно определять филогенетическое положение штаммов B. anthracis и перспективна для применения в процессе эпидемиологического расследования вспышек сибирской язвы.

Об авторах

Григорий Александрович Печковский

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7033-9972
SPIN-код: 8878-3299
Scopus Author ID: 57223328514
ResearcherId: Q-7273-2016

м.н.с., лаб. сибирской язвы 

Россия, Ставрополь

Евгений Иванович Еременко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8163-1300

д.м.н., проф., г.н.с., лаб. сибирской язвы 

Россия, Ставрополь

Алла Геннадьевна Рязанова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5196-784X

к.м.н., зав. лаб. сибирской язвы 

Россия, Ставрополь

Сергей Владимирович Писаренко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790

к.х.н., в.н.с., лаб. биохимии 

Россия, Ставрополь

Николай Андреевич Шапаков

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9152-4026

м.н.с., лаб. биохимии 

Россия, Ставрополь

Людмила Юрьевна Аксенова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7744-3112

к.м.н., с.н.с., лаб. сибирской язвы 

Россия, Ставрополь

Ольга Викторовна Семенова

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0274-898X

к.б.н., н.с., лаб. сибирской язвы 

Россия, Ставрополь

Людмила Дмитриевна Тимченко

Северо-Кавказский федеральный университет

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2011-880X

д.вет.н., проф., г.н.с. межкафедральной научно-образовательной лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии

Россия, Ставрополь

Александр Николаевич Куличенко

Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949

д.м.н., проф., академик РАН, директор

Россия, Ставрополь

Список литературы

Дополнительные файлы