Накопленный опыт и перспективы исследования вируса гепатита B in vivo

Полный текст

Введение

Вирус гепатита B (HBV) представляет собой небольшой покрытый оболочкой гепатотропный ДНК-вирус. HBV имеет релаксированный частично двухцепочечный кольцевой ДНК-геном длиной около 3200 оснований с 4 основными перекрывающимися открытыми рамками трансляции: pre-S/S, pre-C/C, X и P [1, 2]. Открытая рамка трансляции pre-S/S кодирует 3 структурных белка оболочки: большой (L), средний (M) и малый (S). Белок S, известный как HBsAg, состоит из 226 аминокислот. Открытая рамка трансляции pre-C/C кодирует 2 белка: Core, или коровый белок, образует белковую оболочку нуклеокапсида, также носит название «коровый антиген гепатита В» (HBcAg); pre-Core, или прекоровый белок, образуется при инициации трансляции с альтернативных сайтов внутри открытой рамки трансляции pre-C/C HBV. Открытая рамка трансляции X кодирует небольшой регуляторный белок X, который необходим для репликации вируса. Наконец, открытая рамка трансляции P кодирует вирусную ДНК-полимеразу [3], которая также является специализированной обратной транскриптазой, необходимой для репликации геномной ДНК HBV через промежуточную РНК [4].

HBsAg является поверхностным антигеном и основным маркером HBV. При остром гепатите HBsAg может быть выявлен в крови обследуемых уже в инкубационный период в первые 4–6 нед от начала клинического периода. Присутствие HBsAg более 6 мес рассматривается как фактор перехода болезни в хроническую стадию. Следует отметить, что только часть HBsAg, образующегося при размножении вируса, используется для построения новых вирусных частиц, основное же его количество поступает в кровь инфицированных лиц [5].

HBcAg — коровый антиген, выявляемый только в ядрах гепатоцитов, но отсутствующий в крови. Большое диагностическое значение имеет определение в крови антител класса М к этому антигену. Эти антитела при остром гепатите выявляются раньше, чем антитела к другим вирусным антигенам. Анти-HBc-IgM обнаруживают у 100% больных острым гепатитом В, а суммарные анти-HBc антитела могут быть единственным маркером HBV в фазу так называемого «окна», когда в крови не удаётся выявить ни HBsAg, ни антитела к нему. Именно поэтому их определяют на станциях переливания крови при тестировании донорской крови и плазмы [6].

HBcAg и HBsAg являются основными структурными антигенами HBV. Оба антигена представляют собой мощные иммуногены для экспериментальных животных, а также для людей, инфицированных HBV [7].

Белок X HBV (HBx) представляет собой плейо- тропный регуляторный белок [8]. Его роль в репликации вируса была продемонстрирована в ряде исследований in vitro и in vivo. HBx был впервые идентифицирован как трансактиватор экспрессии генов. HBx не связывает элементы ДНК напрямую, но соединяется с белками, которые связывают ДНК. HBx умеренно стимулирует транскрипцию, управляемую широким спектром промоторов, включая собственный энхансер в контексте всего вирусного генома [9]. Однако роль HBx и индуцированной им транскрипции генов, а также её влияние на цитоплазматические сигнальные пути при естественном инфицировании HBV, остаётся открытой [10].

После проникновения вируса в клетку капсид HBV транспортируется в ядро, где он высвобождает вирусную ДНК. В ядре неполный геном вирусной ДНК «восстанавливается» клеточными ферментами в кольцевую ковалентно-замкнутую ДНК (ккзДНК), служащую затем матрицей для транскрипции генов HBV [11]. Заболевание сопровождается образованием инфекционных вирионов, а также высоких концентраций вирусных белков.

HBV обладает строгим тропизмом к хозяину и органу. Он присоединяется к гепарансульфат протеогликанам и поглощается при связывании с натрий-таурохолат котранспортным полипептидом (NTCP). NTCP является специфичным для гепатоцитов переносчиком желчных кислот и идентифицирован как истинный рецептор HBV.

Экспрессия человеческого NTCP (hNTCP) ex vivo в гепатоцитах мыши, крысы и собаки обеспечивает проникновение HBV в клетки, но затем вирус блокируется на одном или нескольких этапах жизненного цикла [12]. В свою очередь, экспрессия hNTCP в гепатоцитах свиней, макак-крабоедов (Macaca fascicularis) и макак-резусов (Macaca mulatta) позволяет HBV пройти полный цикл репликации. Скорее всего, дополнительные факторы организма-хозяина необходимы для импорта неполных геномов HBV в ядро или их «восстановления» до персистирующей формы ккзДНК [13].

HBV является одним из представителей семейства Hepadnaviridae, включающего другие гепатотропные оболочечные ДНК-вирусы, такие как вирус гепатита B уток (Duck hepatitis B virus, DHBV), вирус гепатита сурка (Woodchuck hepatitis virus, WHV) и вирус гепатита B шерстистых обезьян (Woolly monkey hepatitis B virus, WMHBV). DHBV, WHV и WMHBV активно используются в качестве суррогатных моделей инфекции HBV. Гепаднавирусы млекопитающих, в том числе HBV, являются представителями рода Orthohepadnavirus и приводят к развитию патологий печени, в то время как DHBV — к роду Avihepadnavirus, инфицирование которым не приводит к развитию гепатопатий.

Суррогатные животные модели HBV

Утки

В 1980 г. DHBV был обнаружен в сыворотке домашних уток и стал инструментальной моделью для понимания жизненного цикла гепаднавирусов [14]. На культурах клеток гепатоцитов уток эта модель сыграла ключевую роль в выяснении механизмов репликации вируса, включая сборку вирусного капсида, инициацию обратной транскрипции и, наконец, образование двухцепочечной релаксированной кольцевой ДНК [15–19]. С помощью этой модели были исследованы этапы формирования ккзДНК [20–22]. Модели уток с персистирующей инфекцией DHBV также широко использовались для оценки противовирусных препаратов, ингибиторов сборки нуклеокапсида и комбинированных терапевтических подходов (рис. 1) [23–25].

 

Рис. 1. Патогенез, иммунологические и патологические характеристики животных моделей инфекции HBV, основанных на суррогатных вирусах.

Fig. 1. Pathogenesis, immunological and pathological characteristics of animal models of HBV infection based on surrogate viruses.

 

Тем не менее утиные модели на основе DHBV по-прежнему сильно отличаются от HBV у людей в следующих аспектах: DHBV только на 40% гомологичен человеческому HBV [26], DHBV использует карбоксипептидазу D в качестве входного рецептора [27], кроме того, токсичность лекарственных препаратов может проявляться по-разному у людей и уток [28, 29]. Таким образом, скрининг кандидатных лекарственных препаратов, а также исследования механизмов с помощью этой системы могут потребовать дальнейшей проверки из-за существующих различий между вирусами и хозяевами.

Сурки

Открытие WHV, который инфицировал лесных сурков (Marmota monax) в зоопарке Филадельфии [30], предоставило новые возможности для изучения реакции хозяина на гепаднавирусы in vivo. WHV схож с HBV не только по таким вирусологическим характеристикам, как размер, организация и нуклеотидная последовательность генома (сходство достигает 60–70%), но и по врождённым и адаптивным иммунным реакциям хозяина, которые возникают при вирусной инфекции [31].

В настоящее время в качестве животных моделей для исследований, связанных с HBV, используются два вида сурков: Marmota monax [32, 33] и Marmota himalayana [34]. Течение инфекции, патогенез и прогрессирование заболевания у сурков, инфицированных WHV, сходно с инфекцией HBV у людей. Следовательно, модель сурка широко используется для доклинических исследований противовирусных препаратов, а также исследований гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), вызванной HBV. В качестве доклинических моделей инфицированные сурки были протестированы на восприимчивость к таким противовирусным препаратам, как аналоги нуклеоз(т)идов, включая ламивудин [35], энтекавир [36] и тенофовир [37]. Заражение новорождённых сурков обычно приводит к хронической инфекции, тогда как у взрослых сурков обычно развивается острый гепатит, что указывает на аналогичный иммунный ответ против вирусной инфекции HBV у человека. Благодаря этому стало возможным применение сурков в качестве животной модели HBV для разработки профилактических вакцин и скрининга иммунотерапевтических подходов к борьбе с HBV [15, 16, 32, 33]. В частности, на модели Marmota himalayana показано, что применение аналогов нуклеозидов отдельно или в сочетании с ДНК-вакциной способно индуцировать частичный или полный иммунный ответ, предотвращая виремию после инфицирования WHV [38].

Тем не менее следует отметить, что при проведении исследований на модели сурка существуют некоторые ограничения. Во-первых, сурок — крупное животное, и в ходе проведения экспериментальных процедур с ним бывает трудно работать. Во-вторых, существует мало реагентов для исследования иммунного ответа сурков на вирусную инфекцию. Кроме того, различен HBV- и WHV-опосредованный канцерогенез, поскольку ДНК WHV часто интегрируется в протоонкоген Myc, в результате чего почти у всех неонатально инфицированных сурков развивается ГЦК, тогда как HBV предпочитает интегрироваться в гены TERT, MLL4 и CTNNB1 [39]. Таким образом, различия между вирусами HBV и WHV, а также их влиянием на хозяев необходимо принимать во внимание для оценки эффективности потенциальных терапевтических препаратов и вакцин, направленных против HBV.

Летучие мыши

Метагеномный анализ образцов тканей популяций летучих мышей выявил множество гепаднавирус-подобных последовательностей, демонстрирующих более 70% гомологии с последовательностями геномов WHV и HBV [40]. Полногеномное секвенирование образцов тканей летучих мышей, обитающих в Панаме и Габоне, также установило наличие в этих популяциях гепаднавирусов, однако зоонозный потенциал был подтверждён лишь у летучих мышей Нового Света. Этот вирус обладал способностью инфицировать гепатоциты человека посредством hNTCP и вступал в перекрёстную реакцию с моноклональными антителами против S-домена HBsAg. Гистопатологическое исследование продемонстрировало незначительные или умеренные лимфоцитарные, а также скудные нейтрофильно-эозинофильные инфильтраты в портальных триадах инфицированных животных [41]. Наличие HBx позволяет предположить потенциал развития ГЦК у инфицированных летучих мышей. Однако обнаружение антитело-позитивных и ДНК-отрицательных летучих мышей в сочетании с высокой серопревалентностью в рамках этого же исследования указывает на то, что летучие мыши, вероятно, способны избавляться от инфекции.

Использование летучих мышей в качестве модельного организма для изучения HBV является дорогостоящим и трудоёмким в связи с необходимостью организации ухода и содержания животных в условиях изолированного вивария. Кроме того, сами гепаднавирусы летучих мышей изучены недостаточно. Однако вопрос моделирования инфекции HBV на рукокрылых открыт с учётом миграционного характера существования этих животных.

Нечеловекообразные приматы

Другой HBV-подобный вирус — WMHBV — инфицирует своего естественного хозяина — шерстистую обезьяну (Lagothrix lagotricha) [42]. WMHBV успешно использовался в различных исследованиях на паукообразных (Ateles geoffroyi) и беличьих (Saimiri sciureus) обезьянах. Инфекционный клон WMHBV был разработан для исследования на моделях паукообразных обезьян, что привело к умеренной виремии (10⁴–10⁵ геномного эквивалента на 1 мл) через 8 нед после инокуляции с последующим иммуноопосредованным клиренсом [28]. Шерстистые и паукообразные обезьяны находятся под угрозой исчезновения и по этическим причинам не доступны для исследований, связанных с HBV [43, 44]. Тем не менее модели HBV на основе нечеловекообразных приматов могут оказаться многообещающими. Так, у беличьих обезьян, инфицированных WMHBV, наблюдались острые инфекции, а в некоторых случаях и хронические инфекции при доставке геномов WMHBV с помощью аденоассоциированных вирусов [45]. Показано, что у беличьих обезьян, инфицированных WMHBV, виремия длится 6–8 мес, что более чем в 2 раза превышает продолжительность виремии у других нечеловекообразных приматов. Этот факт позволяет рассматривать их в качестве суррогатной модели для разработки терапевтических подходов для лечения HBV [45].

В 2013 г. в популяции яванских макак на острове Маврикий (mcHBV) был обнаружен один природный трансмиссивный штамм HBV, на 99% идентичный штамму генотипа D (ayw) вируса гепатита В, что породило некоторые надежды на создание модели HBV на основе маленькой обезьяны Старого Света [46]. Однако до сих пор получить продуктивной инфекции яванских макак mcHBV не удалось, несмотря даже на то, что их заражали высокими дозами [47].

После того как hNTCP был идентифицирован как функциональный рецептор HBV, исследователи обнаружили, что он является ключевым фактором хозяина, ограничивающим инфекцию HBV у яванских макак и макак-резусов [13]. hNTCP отличается от NTCP приматов только пятью аминокислотными остатками в области связывания HBV. Однако отличие по одному из таких отличающихся аминокислотных остатков (G158R) приводит к неспособности связывания HBV с NTCP приматов. Внесение соответствующей мутации в ген NTCP приматов привело к возникновению восприимчивости к HBV [48]. Чтобы создать новую модель HBV, обеспечивающую восприимчивость к HBV, можно было бы ввести в NTCP макак мутацию R158G с помощью системы направленного редактирования генома CRISPR/Cas.

Кроме того, на основе макак-резусов, трансдуцированных вирусным вектором для экспрессии hNTCP in vivo, была создана модель HBV [47]. Введение вирусного вектора с последующим заражением HBV приводило к устойчивой виремии HBV в течение как минимум 6 нед. В организме модельных животных формируется гуморальный и противовирусный клеточный иммунитет, а в гепатоцитах макак-резусов в ходе инфекции — ккзДНК. Однако уровень экспрессии hNTCP у макак-резусов остаётся низким, в связи с чем эта модель инфекции HBV не признана эффективной (лишь 0,5–1,0% гепатоцитов являются HBcAg-положительными, в то время как в крови HBsAg не обнаружен) [47].

Перечисленные данные весьма обнадеживают и вдохновляют на разработку других моделей HBV на основе нечеловекообразных приматов, которые смогут продемонстрировать более высокую эффективность заражения вирусом гепатита В.

Иммунотолерантные животные модели HBV

Трансгенные мыши

Начиная с 1985 г. были созданы модели трансгенных мышей, экспрессирующих белки HBV (такие, как HBsAg [49], HBeAg [50] или HBx [51]) для изучения их роли в патогенезе либо полноразмерные геномы HBV, которые могут продуцировать инфекционные вирионы HBV в гепатоцитах мышей [52–55]. Эти модели внесли особенно важный вклад в идентификацию онкогенных функций HBsAg и белка HBx, которые вызывают воспаление, изменяют экспрессию генов хозяина и, в конечном итоге, приводят к развитию ГЦК [51, 56].

Трансгенные мыши, экспрессирующие HBeAg, иммунологически толерантны не только к HBeAg, но и к HBcAg, однако способны к трансплацентарной передаче HBeAg. Показано, что нехимерное потомство таких животных после рождения демонстрирует сниженный Т-клеточный ответ на HBcAg. Всё перечисленное указывает на то, что на ранней стадии инфекции HBeAg играет решающую роль в ограничении T-клеточного ответа на HBcAg и способствует переходу процесса в хроническое течение. В то время как экспрессия HBcAg не вызывает очевидных патоморфологических изменений у этих мышей, усиленная экспрессия HBeAg ингибирует его высвобождение, что приводит к образованию ацидофильных включений в цитоплазме и способствует развитию фокальной нодулярной гиперплазии печени. Клетки с ацидофильными включениями, в свою очередь, напоминают матовостекловидные гепатоциты у носителей HBV [57].

Трансгенные мыши, экспрессирующие HBxAg в тканях печени под контролем своего нативного промотора, были использованы для установления онкогенного потенциала HBxAg. Из-за того, что HBxAg экспрессируется не во всех гепатоцитах, не у всех животных развивается ГЦК. У некоторых мышей появляется лишь умеренный ядерный плеоморфизм и повышается митотическая гепатоцитарная активность невоспалительного характера, а также возникает мультифокальный гепатолипидоз (рис. 2). Примечательно, что прогрессирование заболевания и гибель наблюдаются у самцов гораздо раньше, чем у самок [58].

 

Рис. 2. Патогенез, иммунологические и патологические характеристики иммунотолерантных животных моделей инфекции HBV.

Fig. 2. Pathogenesis, immunological and pathological characteristics of immunotolerant animal models of HBV infection.

 

Трансгенные мыши с интегрированными полноразмерными геномами HBV, способные продуцировать вирионы HBV в периферическую кровь, также использовались для проверки эффективности противовирусных препаратов, таких как ламивудин и энтекавир, а также для оценки противовирусных эффектов терапевтических препаратов на основе малых интерферирующих РНК [59, 60].

Трансгенные мыши являются иммунотолерантными в отношении HBV, поскольку геном HBV интегрирован в геном мыши [61]. Тем не менее трансгенные мыши использовались для изучения противовирусного эффекта индуктора интерферонов [62] и агониста толл-подобного рецептора 7/8 [54]. Кроме того, трансплантация иммунных клеток от наивных мышей трансгенным может спровоцировать развитие иммунного ответа на HBV [63–65].

Трансдуцированные мыши

Основным методом трансдукции гепатоцитов мыши in vivo является гидродинамическая инъекция, заключающийся в быстром (6–8 с) введении большого количества генетических конструкций, содержащих геном HBV, в хвостовую вену под высоким давлением [66]. При этом происходит повреждение гепатоцитов, что влечёт за собой постинъекционное повышение уровня аланинтрансаминазы до огромных значений, но после трансдукции репликация HBV носит временный характер [67]. Трансдукция гепатоцитов in vivo осуществляется с помощью плазмидных ДНК, аденовирусных (Adv) или аденоассоциированных вирусных векторов (AAV). Показано, что трансдукция с помощью высоких доз Adv вызывает транзиторную антигенемию [68] и репликацию HBV на протяжении 3 мес. После этого возникает сильный иммунный ответ против самого аденовируса [67]. Трансдукция с помощью AAV приводит к иммунотолерантному фенотипу с длительной антигенемией, минимальным воспалением и фиброзом печени [69].

Использование плазмидных ДНК снижает риски возникновения сильных иммунных ответов против вирусных носителей [70]. У иммунокомпетентных животных образование антигенов, вирусных транскриптов и синтез ДНК длится в течение 14 дней. Это связано с развитием Т-клеточного иммунного ответа, направленного на уничтожение инфицированных гепатоцитов. Важно отметить, что у иммунодефицитных мышей NOD/SCID тот же процесс длится в течение 81 дня после трансдукции [70].

Оптимизация носителя, содержащего геном HBV, позволила увеличить продолжительность антигенемии у иммунокомпетентных мышей до 6 мес. При этом HBsAg-положительные мыши-носители продуцировали антитела против HBcAg, но не против HBsAg, что напоминает картину иммунотолерантной фазы инфекции у людей-носителей. Перенос иммунных клеток, специфичных к HBcAg, способствовал элиминации HBsAg из сыворотки крови мышей-носителей, что демонстрирует решающее значение иммунного ответа против HBcAg в устранении персистенции HBV [71].

Решающее значение в персистенции HBV in vivo играет ккзДНК, которая отвечает за рецидив вирусной активности у хронически инфицированных пациентов. Необходимо отметить, что ккзДНК не способна внедряться в ядра гепатоцитов немодифицированных мышей. С помощью Adv, не способного к репликации, рекомбинантная ккзДНК (рккзДНК) HBV была успешно доставлена в печень трансгенных мышей Alb-Cre и оставалась стабильной более 62 нед, что привело к персистенции HBV. Устойчивая некровоспалительная реакция и фиброз печени, обнаруженные на поздней стадии персистенции вируса, были аналогичны повреждениям при прогрессирующем течении хронического гепатита B (ХГB) у человека [72]. На этой же линии мышей посредством аденоассоциированного вируса 8 была создана похожая гепатотропная модель рккзДНК. Модель характеризовалась продолжающейся более 72 недель антигенемией и персистенцией ккзДНК более 51 недели. В отличие от предыдущей модели, в печени отмечалось незначительное паренхиматозное воспаление и очаговый фиброз [73].

Таким образом, подход к трансдукции мышей HBV, опосредованной вирусными векторами и плазмидными ДНК, пригоден для дальнейшего использования в исследованиях иммунотолерантности к HBV. Более того, доставка AAV-HBV мышам вызвала гистопатологические проявления, соответствующие фиброзу печени, характерному для инфекции HBV [74]. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.

Химерные мыши с гуманизированной печенью

Трансгенные и трансдуцированные мыши не поддерживают полноценного инфицирования из-за отсутствия рецептора hNTCP. Модель «Trimera» является результатом самых ранних попыток в направлении совершенствования существующих мышиных моделей HBV. Для создания такой модели иммунодефицитным мышам под капсулу почки трансплантировались фрагменты инфицированной печени человека. После приживления трансплантата вирусная ДНК и антигены обнаруживались в течение 2 мес [75]. Эта модель использовалась для оценки противовирусных препаратов, несмотря на ограничение применимости для прочих задач исследования HBV из-за относительно короткого временнóго окна для инфекции и транзиторного характера виремии. В другой простой модели мышам Nude, обладающим частичным иммунодефицитом, подкожно трансплантировали клетки линии HepAD38, способные к индуцируемой продукции HBV. Устойчивая виремия развивалась через 21 день после формирования подкожного новообразования и сохранялась на протяжении 30 дней [76].

Альтернативой модели «Trimera» считается применение мышей со специфической для печени экспрессией активатора плазминогена урокиназного типа (uPA). Таким животным свойственны повышенная концентрация uPA, гипофибриногенемия и неонатальные кровоизлияния. Экспрессия гена uPA индуцирует некроз гепатоцитов у молодых мышей и через 9 нед обеспечивает выраженную репопуляцию около 87% паренхимы печени [77]. Несмотря на устойчивую виремию, матовостекловидные гепатоциты у таких животных не обнаруживаются [78]. Модель hu-uPA/SCID широко используется для оценки противовирусных препаратов и разрабатываемых схем иммунной терапии, а также для изучения механизма врождённого иммунного ответа против HBV. Основным недостатком этой модели является неконтролируемая экспрессия гена uPA, требующая проведения ксенотрансплантации гепатоцитов в неонатальный период, а также повышенный риск возникновения обширных кровоизлияний у модельных животных [79].

В 2018 г. G. Dalton и соавт. представили мышей с нокаутом гена Fah. Эти животные в значительной степени решили проблему модели hu-uPA/SCID. Потеря гена Fah вызывает накопление токсичных метаболических промежуточных продуктов катаболизма фенилаланина в тирозин, а индукция печёночной недостаточности регулируется введением 2-(2-нитро-4-флюорометилбензоил)-1,3-циклогександиона [80]. На основании этой особенности было создано несколько моделей, среди которых — мыши FRG, несущие генотип с нокаутом генов Fah, Rag2 и IL-2ry. Животные этой линии достигли 95% репопуляции печени гепатоцитами человека [81, 82]. После инфицирования HBV у мышей hu-HEP/FRG наблюдалось повышение уровней ккзДНК, вРНК и промежуточных продуктов репликации вирусной ДНК. Модель hu-HEP/FRG успешно используется для исследования патогенеза HBV [82] и оценки эффективности противовирусных препаратов и терапевтических схем [83].

Иммунокомпетентные животные модели HBV

Тупайя

Тупайя (Tupaia belangeri) — это небольшие млекопитающие, которые генетически более тесно связаны с приматами, чем с грызунами [84]. Тупайи экспериментально восприимчивы к HBV и вирусу гепатита С (HCV), что привело к тому, что они стали моделью животных, не относящихся к приматам, которая была изучена в последние десятилетия [85, 86]. Подобно другим видам, тупайи имеют большую склонность к хроническому развитию заболевания при заражении в новорождённом возрасте и демонстрируют такие же гистопатологические изменения в печени, как и у людей, инфицированных HBV [83]. Первичные гепатоциты тупайи широко доступны и используются при инфекциях HBV и WMHBV [87, 88].

Именно благодаря первичной культуре гепатоцитов тупайи стало возможным точное картирование сайта связывания HBV, а NTCP был идентифицирован как его функциональный рецептор [12]. Внутрибрюшинная инокуляция HBV новорождённым животным приводит к персистенции HBсAg в печени, сопровождающейся непродолжительной HBsAg- и HBeAg-антигенемией, а внутрипечёночная трансдукция рекомбинантной вирусной ДНК — к появлению сывороточных антител против HBsAg и HBсAg и развитию хронического гепатита, заканчивающегося фиброзом у некоторых особей [89]. У взрослых тупай внутривенное или внутрибрюшинное инфицирование приводит к быстрому нарастанию титров антител против HBcAg, HBsAg и HBeAg в течение 2–3 нед. Гистопатологические изменения печени у хронически инфицированных животных аналогичны наблюдаемым при ХГB человека [89], включая образование ГЦК на поздней стадии жизни у 30% животных (рис. 3). При этом повышения уровней сывороточных трансаминаз у тупай не происходит [90].

 

Рис. 3. Патогенез, иммунологические и патологические характеристики иммунокомпетентных животных моделей инфекции HBV.

Fig. 3. Pathogenesis, immunological and pathological characteristics of immunocompetent animal models of HBV infection.

 

На сегодняшний день существует ряд предостережений, которые ограничивают применимость тупайи в качестве животной модели HBV. Во-первых, тупайи как беспородный вид обладают генетической гетерогенностью, которая может быть полезна для изучения реальных ситуаций, но не приемлема для крупномасштабных исследований, проводимых на животных. Во-вторых, у тупай обнаруживаются лишь низкие титры вируса in vivo. И, наконец, существует острая нехватка инструментов и материалов для исследования HBV у этого вида.

Химерные мыши с гуманизированными иммунной системой и печенью

Значительным недостатком химерных мышей с гуманизированной печенью является их высокий иммунодефицитный фон. Для того чтобы обеспечить возможность анализа иммунного ответа человека на HBV, вирусиндуцированного иммунопатогенеза и тестирования иммуномодуляторов для лечения ХГB, постоянно совершенствуются протоколы совместного приживления мышам гепатоцитов человека и клеток иммунной системы человека.

Восстановление иммунной системы человека достигается посредством внутрипечёночной инъекции новорождённым мышам NSG, несущим аллель HLA-A2, гематопоэтических стволовых клеток CD34⁺ человека (hCD34⁺). hCD34⁺ совместно с клетками-предшественниками печени человека заселяют печень мыши, повреждённую агонистическими антителами против CD95. Эта модель позволяет достичь 25% гуманизации клетками человека, персистенции HBV с низкой вирусной нагрузкой (< 5 × 10⁵ копий/мл) и развития специфического для HBV hCD8⁺-Т-клеточного ответа. Накопление М2-подобных макрофагов, способствующих у пациентов с ХГB ускоренному фиброзу печени, приводит к развитию тяжёлого гепатита и фиброза у мышей [91].

Другая модель — HIS/hu-HEP — создаётся путём приживления клеток hCD34⁺ и гепатоцитов взрослого человека мышам BALB/c Rag2^–/–IL2ry^–/– Sirpa NOD Alb-uPA^tg/tg. HIS/hu-HEP характеризуется более высоким уровнем продукции антигенов HBV, а также развитием и поддержанием продуктивной инфекции на протяжении 16–20 нед. Инфицирование животных этой модели приводит к инфильтрации воспалительных клеток в области, содержащие антиген-положительные гепатоциты, без последующего формирования очагов фиброза. При этом воздействие небольшими дозами антигенов HBsAg и HBcAg индуцирует более сильный иммунный ответ [92].

Линия мышей FRGS (Fah^–/–Rag2^–/–IL-2Rγc^–/– SCID) также применяется для создания химерных мышей с гуманизированными иммунной системой и печенью. Для этого проводят интраспленальную трансплантацию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека. В результате через 12 нед мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека дифференцируются в функциональные гепатоциты непосредственно в печени мышей. Кроме того, hCD45⁺-клетки в различной степени заселяют костный мозг, тимус, лимфатические узлы, печень и обнаруживаются в периферической крови модельных животных. После инфицирования развивается персистирующая инфекция HBV с высокой вирусной нагрузкой и антигенемией, привлекающей в паренхиму печени большое количество воспалительных клеток. Патоморфологическая картина острого лобулярного гепатита с образованием лимфоидных агрегатов и поражением протоков проявляется через 12 нед после инфицирования, а характерная для ХГB портальная и перипортальная лимфоцитарная инфильтрация обнаруживается с 24-й недели. Образование в печени диффузных рубцов и областей фокальной нодулярной гиперплазии, а также повышенные уровни сывороточных γ-глутамилтранспептидазы и гиалуроновой кислоты сохраняются на протяжении 36 нед после инфицирования. В совокупности такие изменения печени у животных подобны некоторым патоморфологическим признакам, характерным для течения ХГВ у человека. Более того, у 10% инфицированных животных развивается цирроз, что напоминает картину ХГB у человека [92].

Химерные мыши с гуманизированными иммунной системой и печенью представляют собой новый тип животных моделей HBV. Такие модели успешно воспроизводят естественное развитие инфекции HBV и, таким образом, открывают возможности для понимания патофизиологии вирусного иммунитета и улучшения стратегий вмешательства при заболеваниях печени, связанных с HBV.

Приматы

Шимпанзе — единственная известная иммунокомпетентная модель, которая полностью восприимчива к HBV и может довольно точно воспроизводить картину патогенеза и прогрессирования заболевания. Показано, что даже 1 геномного эквивалента ДНК HBV достаточно для успешного заражения шимпанзе [93]. После инъекции HBV, полученного от пациентов с ХГB, у шимпанзе может развиться острая и хроническая инфекция с профилями иммунного ответа и воспаления, очень похожими на таковые у пациентов, инфицированных HBV [94].

На ранних этапах исследований HBV модель шимпанзе сыграла важную роль в оценке безопасности и эффективности разрабатываемых вакцин против HBV. Исследования на шимпанзе использовались для проверки эффективности вакцины против гепатита В первого поколения (полученной из плазмы крови) и разработанной позже рекомбинантной вакцины, содержащей HBsAg, полученный в клетках дрожжей [94, 95]. В последние годы эффективность модифицированных рекомбинантных вакцин, вакцин против устойчивых к противовирусным препаратам мутантных форм HBV и некоторых исследований по терапевтической вакцинации также была проверена с использованием модели шимпанзе [96–98].

Шимпанзе кажутся незаменимыми в качестве модели иммунокомпетентных животных в исследованиях иммунитета в связи с тем, что могут воспроизводить такое же воспаление печени и клеточные иммунные реакции, как и у пациентов, инфицированных HBV. Исследования на шимпанзе показали, что нецитопатические противовирусные механизмы, опосредованные провоспалительными цитокинами, могут способствовать клиренсу вируса во время острого вирусного гепатита [99]. Совсем недавно исследования на моделях шимпанзе с ХГВ показали, что иммунная модуляция может повысить противовирусный иммунитет и подавить репликацию HBV (например, посредством активации TLR-7 агонистом) [100]. Хотя шимпанзе исторически были наиболее релевантным видом животных для исследований HBV, ограниченность доступности, высокие затраты и серьёзные этические проблемы ограничили их использование в качестве экспериментальной модели.

Кроме шимпанзе, применялись и другие модели приматов для изучения HBV. Например, у маготов (Macaca sylvanus), трансдуцированных плазмидной ДНК, содержащей геном HBV, развиваются виремия и ранний портальный фиброз печени, что также характерно для течения заболевания у человека. В то же время уровни сывороточных трансаминаз у инфицированных маготов остаются в пределах значений физиологической нормы [101]. У макак-резусов, экспрессирующих hNTCP в гепатоцитах, также может быть установлена временная умеренная виремия [47].

Модели, созданные на основе приматов, являются крайне важными в изучении HBV, не имеют широкого распространения не только по этическим причинам, но и ввиду их высокой стоимости, а также отсутствия необходимых инструментов (реагентов) для проведения подобных исследований.

Модели социально значимых коинфекций HBV

Инфекция HBV является социально обусловленным хроническим заболеванием и может сочетаться с другими инфекциями, вызываемыми HCV и вирусом гепатита D (HDV), вирусом иммунодефицита человека (HIV) или туберкулёзом. При этом патофизиологические, иммунологические и патоморфологические особенности этих сочетанных заболеваний существенно отличаются от характеристик моноинфекции. Поэтому при разработке терапевтических подходов целесообразно разрабатывать в том числе животные модели, способные отражать особенности сочетанных инфекций.

Коинфекции HBV/HCV и HBV/HDV

Гепатит С широко распространён. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, в мире около 3% населения инфицировано HCV, при этом ежегодно происходит около 1,5 млн новых случаев инфицирования. От последствий гепатита С (главным образом, от цирроза и рака печени) ежегодно умирает более 250 тыс. человек.

Гепатит D относится к воспалительным поражениям печени, вызванным HDV. Для репликации HDV необходимо присутствие HBV (без HBV даже заражение гепатитом D невозможно). Коинфекция HBV/HDV считается наиболее тяжёлой формой ХГB ввиду более стремительного развития ГЦК, которая приводит к летальному исходу.

Благодаря способности к контролируемому апоптозу гепатоцитов трансгенные гуманизированные мыши hu-uPA/SCID/beige и AFC8-hu-HSC/Hep могут быть использованы для имитации сочетанных коинфекций HBV/HCV или HBV/HDV. Титры вирусов у этих моделей достигают обнаруживаемых в сыворотке крови значений через 3 нед после инфицирования HBV/HDV. При этом виремия HBV несколько ниже HDV-виремии, т.к. коинфекция HBV/HDV связана с индукцией экспрессии интерферонов I типа человека, в отличие от моноинфекции HBV [102]. Мыши линий FRG и Alb-uPA также успешно использовались для ксенотрансплантации гепатоцитов человека и последующего инфицирования HCV. Интересно, что в ходе проделанных работ был подтверждён трансмиссивный характер заболевания [103, 104].

Y. Amako и соавт. продемонстрировали возможность инфицирования наивных животных сывороткой серопозитивных тупай с последующим развитием острого гепатита и виремии. Инфицирование тупай сывороткой HCV-позитивного человека приводило к повышению уровня сывороточной аланинаминотрансферазы в 2–5 раз и возникновению продолжительной транзиторной виремии. При этом у инфицированных животных отмечался гепатолипидоз. В течение последующих 2 лет вокруг портальных областей и синусоидов печени формировались лимфоцитарные инфильтраты, характерные для хронической патологии. Еще 1 год спустя воспаление приводило к развитию умеренного и даже тяжёлого фиброза с элементами цирроза печени [105].

Как и для HBV, функциональным рецептором для HDV является NTCP. При этом для высвобождения из инфицированных гепатоцитов и продолжения инфекционного процесса HDV необходимы оболочечные белки HBV [106], хотя известно, что HDV может персистировать в покоящихся (неделящихся) гепатоцитах сурка как минимум в течение 42 дней, независимо от HBV [103]. Проведённые in vivo исследования на сурках, инфицированных как WHV, так и HDV, помогли в разработке стратегий иммунизации. Хотя J.L. Gerin утверждал, что одним из препятствий для многостороннего использования данной модели являлось раннее развитие WHV-индуцированной ГЦК [107].

Коинфекция HBV/HIV

На конец 2022 г. в мире, по разным оценкам, насчитывалось 33,1–45,7 млн человек, живущих с HIV-инфекцией. Около 1% людей, живущих с HBV-инфекцией (2,7 млн человек), также инфицированы HIV. Известно, что у HIV-позитивных пациентов с ХГB риск смертности при осложнении гепатопатии в 8 раз выше из-за применения высокоактивной антиретровирусной терапии. Помимо этого HIV-инфекция ускоряет прогрессирование HBV-инфекции, значительно увеличивая риск развития цирроза печени или ГЦК. При этом инфицирование HBV не приводит к ускоренному сокращению количества CD4⁺-T-клеток [108].

Учитывая аналогичные факторы передачи, случаи коинфекции HBV/HIV нередки. Поэтому для изучения сочетанной инфекции HBV/HIV используются дважды гуманизированные мышиные модели. Такой моделью могли бы стать мыши AFC8-hu-HSC/Hep, полученные из линии иммунодефицитных мышей. Животным AFC8-hu-HSC/Hep свойственен индуцируемый апоптоз гепатоцитов благодаря введённому в геном трансгену (AFC8 — FK506-связывающий белок и каспаза 8 под контролем альбуминового промотора). Инфицирование этих мышей HBV приводит к экспрессии фиброгенных белков человека, которые обусловливают развитие воспаления и фиброза печени, коррелирующих с активацией звёздчатых клеток в гуманизированной части печени [109]. Сходным образом возможно использовать модели гуманизированных мышей HIS/hu-HEP [91] или TK-NOG-hu-HSC/Hep [110]. Однако основным препятствием для создания этих моделей является необходимость использования для трансплантации тканей, полученных от одного донора.

Более проста в исполнении мышиная модель HIL, получаемая путём трансплантации в паренхиму печени иммунодефицитных мышей эмбриональных hCD34⁺-клеток. Таким образом удаётся получить мышей с двойной гуманизацией и минимизированным риском развития реакции «трансплантат против хозяина». После инфицирования у мышей HIL наблюдался узелковый фиброз печени, прогрессирующий до разлитого фиброза с многочисленными перегородками. Разлитой фиброз приводил в результате воспаления и активации звёздчатых клеток печени к развитию сильного рубцевания и нодулярного цирроза. При этом в паренхиме печени животных отмечалось трёхкратное увеличение количества hCD45⁺-лейкоцитов и усиление регуляции как человеческих, так и мышиных фиброгенных генов [111].

Коинфекция HBV/Mycobacterium tuberculosis

Туберкулёз, как и инфекции, вызываемые вирусами HCV и HDV, и HIV, является социально значимым заболеванием. В 2021 г., согласно оценкам, туберкулёзом во всем мире заболели 10,6 млн человек. Нередко встречаются коинфекции HBV и Mycobacterium tuberculosis (MTB).

Известно, что при терапии сочетанной инфекции HBV и MTB в первую очередь применяются противотуберкулёзные препараты, что на фоне туберкулёза печени может нести огромный риск повреждения печени [112]. Макаки-резусы и макаки-крабоеды восприимчивы к инфицированию MTB при естественном пути инфицирования, и у них образуются гранулёмы, в том числе в печени, имеющие высокоупорядоченную архитектуру с центральным некрозом, окружённым периферическим ободком [113].

Разработка аэрозольного способа инфицирования мышей позволила повысить вирулентность микобактерий относительно внутривенного способа [114]. Модель BLT, получаемая путём трансплантации под капсулу почки иммунодефицитных мышей фетальных тканей костного мозга, печени и тимуса человека, восприимчива к инфицированию микобактериями. Через 3–4 нед после инокуляции MTB развивалось мультифокальное воспаление паренхимы печени. При этом бактерии локализованы в областях воспаления, но спустя 4 нед после инфицирования в печени не было отмечено обструкции протоков [115]. Основная сложность модели BLT заключается именно в процедуре ксенотрансплантации, требующей выполнения манипуляций с ювелирной точностью. Кроме того, в модели BLT развивающаяся человеческая ткань печени не воссоздаёт полноценную структуру органа.

Универсальной моделью для некоторых инфекций могут стать высокоиммунодефицитные мыши TK-NOG, пригодные для ксенотрансплантации как тканей печени, так и гематопоэтических стволовых клеток. Их гуманизация может позволить имитировать не только HBV-инфекцию, сочетанную с HIV [110], но и сделает этих мышей перспективной моделью для будущих исследований коинфекции HBV/MTB.

L. Zhan и соавт. сообщали о восприимчивости тупай к экспериментальному внутривенному инфицированию высокими и низкими дозами MTB. Учитывая, что тупайи аутбредны, наблюдаемые клинические признаки заболевания разнились среди животных даже внутри одной экспериментальной группы. Патоморфологическое исследование показало наличие в лёгких и селезёнке туберкулёзных гранулём с казеозным некрозом в центре и большим количеством воспалительных клеток на периферии. Очаговый некроз с воспалительными клетками был распространён в коре и капсуле надпочечников и мозжечке. Инфильтрированные воспалительными клетками очаги поражения, содержащие MTB, были обнаружены в печени, почках и обширных некротических очагах в мышцах. Важно отметить, что к 11-й неделе животные достигали гуманных конечных точек [116]. Учитывая вышеизложенное, тупайи также могут считаться перспективной моделью для будущих исследований коинфекции HBV/MTB.

Заключение

DHBV только на 40% гомологичен HBV [26] и в качестве входного рецептора использует карбоксипептидазу D [27]. Поэтому утки обладают низкой релевантностью в качестве моделей для оценки эффективности противовирусной терапии [117]. Как и утки, сурки, летучие мыши и приматы не инбредны, а иммунологические реагенты для всестороннего исследования гепаднавирусных инфекций недоступны. Кроме того, многие естественные модели инфекции просто находятся под угрозой исчезновения.

Иммунотолерантные мыши могут только поддерживать репликацию HBV в контексте анатомо-физиологических особенностей мыши. При этом жизненный цикл вируса является неполным из-за отсутствия этапов проникновения, образования ккзДНК и распространения. Релевантность результатов, полученных на химерных мышах, обладающих гуманизированной печенью, невозможно транслировать на человека вследствие их иммунодефицитности и, соответственно, отсутствия патоморфологических изменений, обусловленных иммунным ответом против инфицированных клеток.

Тупайи могут быть инфицированы HBV, но они также аутбредны, и использование их in vivo в качестве моделей требует предварительных исследований. Подвергшиеся двойной гуманизации мыши представляют перспективное направление для дальнейших исследований. Однако стабильность виремии напрямую зависит от степени гуманизации печени мыши введёнными гепатоцитами человека [102]. Кроме того, трансплантация (приживление) ксеногенной иммунной системы и печени индуцирует несоответствия в системе главного комплекса гистосовместимости, что оставляет открытым вопрос о релевантности механизмов распознавания и иммунных реакций против вируса в таких моделях.

Учитывая недоступность шимпанзе для исследования HBV, а также сходство иммунной системы и относительную доступность некоторых реагентов, нечеловекообразные приматы, вероятно, предоставляют самые надёжные данные об иммунитете для трансляционных исследований [46]. Однако эти результаты необходимо тщательно интерпретировать, перепроверяя в других биологических системах.

Новым витком является разработка животных моделей сочетанных с HBV социально значимых инфекций. При этом иммунодефицитность некоторых моделей может стать их преимуществом, как в случае имитации коинфекции HBV/HIV. С другой стороны, одновременное инфицирование двумя патогенами несёт риск существенного снижения качества жизни животного. Поэтому планирование подобных исследований должно рассматриваться этическими комитетами самым строгим образом.

При исследовании такого патогена, как HBV, не существует «бесполезных» моделей. Поэтому модели, способные демонстрировать как долгосрочное развитие гепатопатии, так и иммунологические особенности инфекционного процесса in vivo, в дальнейшем получат большее распространение в изучении как гепатотропных вирусов, так и сочетанных с ними инфекций. Кроме того, выявление новых естественных резервуаров гепаднавирусных инфекций с целью расширения возможной модельной базы позволит пролить свет на происхождение и эволюцию HBV.

Об авторах

Алексей Михайлович Нагорных

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: nagornih@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-8320-2999

к.вет.н., с.н.с. научной группы разработки экспериментальных моделей лаборатории экспериментальной фармакологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Марина Алексеевна Тюменцева

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: tyumentseva@cmd.su
ORCID iD: 0000-0002-3145-3702

к.б.н., зав. лабораторией геномного редактирования отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Александр Игоревич Тюменцев

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: tymencev@cmd.su
ORCID iD: 0000-0003-0537-2586

к.б.н., зав. лабораторией экспериментальной фармакологии отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии

Россия, Москва

Василий Геннадьевич Акимкин

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: vgakimkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4228-9044

д.м.н., профессор, академик РАН, директор

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы