Analysis of changes in the genome of Vibrio cholerae O1 El Tor genovariants during the current period of the cholera pandemic

Nina I. Smirnova; Смирнова Нина Ивановна; Darya A. Rybalchenko; Рыбальченко Дарья Александровна; Yulii V. Lozovskiy; Лозовский Юлий Владиславович; Yaroslav M. Krasnov; Краснов Ярослав Михайлович; Vladimir V. Kutyrev; Кутырев Владимир Викторович

doi:10.36233/0372-9311-389

Анализ изменения генома геновариантов Vibrio cholerae О1 El Tor в современный период пандемии холеры

Авторы: Смирнова Н.И.¹, Рыбальченко Д.А.¹, Лозовский Ю.В.¹, Краснов Я.М.¹, Кутырев В.В.¹
Учреждения:
1. Российский противочумный институт «Микроб»
Выпуск: Том 100, № 5 (2023)
Страницы: 346-357
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Дата подачи: 21.11.2023
Дата публикации: 22.11.2023
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18482
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-389
EDN: https://elibrary.ru/tuekup
ID: 18482

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. Вариабельность генома генетических вариантов возбудителя холеры El Tor обусловила появление штаммов, несущих мутации в различных генах патогенности и лекарственной устойчивости. Такая ситуация требует оценки направления этих измененений для прогнозирования патогенного потенциала ранее неизвестных вариантов и своевременной разработки новых средств диагностики и профилактики.

Цель работы — анализ динамики изменения генов патогенности и лекарственной устойчивости генетических вариантов Vibrio choleraе El Tor из эндемичных по холере стран и России.

Материалы и методы. Использовали секвенированные нуклеотидные последовательности полных геномов 104 штаммов V. cholerae El Tor, взятых из баз данных NCBI GenBank и European Nucleotide Archive, а также полногеномные сиквенсы, полученные нами. Анализ нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью программы UGEN v.45.1. Для построения дендрограммы по алгоритму максимальной экономии применяли программный пакет «BioNumerics v. 7.6» на основе множественного выравнивания, полученного с помощью программы «Snippy 4.6.0».

Результаты. Cопоставлены секвенированные геномы 103 штаммов геновариантов, выделенных на территории 9 эндемичных стран Азии и Африки, а также в России в 1991–2022 гг. Показано, что процесс изменения генома геновариантов был многоступенчатым и происходил за счет последовательного накопления точечных мутаций в ключевых (ctxB и tcpA) и дополнительных (rtxA) генах патогенности и коровых генах резистентности к антибиотикам (gyrA, parC и carR), а также делецией в мобильном элементе SXT. Наиболее важным стало изменение в гене ctxB и появление новых геновариантов с аллелем ctxB7, вытеснивших ранее сформированные штаммы. Анализ измененных участков генома 83 штаммов геновариантов из эндемичных регионов выявил 8 генотипов, тогда как штаммы (21 изолят), завезённые в Россию, относились лишь к 5 генотипам, включая высоковирулентные геноварианты с аллелем ctxB7 и утраченным биоварспецифическим свойством Pol^R за счёт мутации гена carR. Установленная тесная филогенетическая связь геновариантов, выявленных в России, со штаммами из эндемичных стран Азии подтверждает их завоз из этого региона.

Заключение. Показано последовательное возникновение и накопление новых мутаций в генах патогенности и лекарственной устойчивости в геноме геновариантов в эндемичных регионах, что приводит к изменению их эпидемически важных свойств. Установлен завоз в Россию новых геновариантов с высокой вирулентностью, что указывает на необходимость постоянной оценки изменений генома этого патогена для своевременной разработки адекватных средств генодиагностики и профилактики.

Ключевые слова

Vibrio cholerae, геноварианты, изменчивость, вирулентность, лекарственная устойчивость, филогенетические связи

Полный текст

Введение

Семь известных пандемий холеры были вызваны токсигенными штаммами Vibrio cholerae, относящимися к серогруппе О1 и двум биоварам — классическому и El Tor [1]. Среди них особый интерес представляют штаммы V. cholerae El Tor, вызвавшие текущую, 7-ю пандемию холеры, продолжающуюся более 60 лет (с 1961 г.). Постоянные эпидемии и вспышки холеры El Tor в эндемичных странах Азии, Африки и Америки обусловливают риск завоза этой инфекции на территорию России, не являющейся эндемичной по холере [2].

Установлено, что глобальное распространение холеры из первичного очага (Бенгальского залива) в другие страны мира происходило тремя независимыми, но перекрывающимися волнами [3]. Молекулярно-генетический анализ различных штаммов показал, что на протяжении 3 волн в геноме возбудителя происходили значительные изменения. Эпидемии холеры в 1961–1991 гг. (1-я волна) вызывали токсигенные штаммы с типичными для биовара El Tor свойствами, содержащие в составе профага СТХ^Eltφ гены ctxAB3, кодирующие, соответственно, A- и B-субьединицы холерного токсина — ключевого фактора патогенности [4]. Однако в 1991–1994 гг. (начало 2-й волны) в Бангладеш впервые были обнаружены генетически изменённые штаммы, несущие ген ctxB1 V. cholerae классического биовара — возбудителя предыдущих 6 пандемий азиатской холеры. Эти геноварианты возникли, видимо, в результате горизонтального переноса профага СТХφ классического типа (СТХ^classφ) с генами ctxAB1 от V. cholerae классического биовара типичным штаммам V. cholerae El Tor [5]. Вместе с тем геном геновариантов оказался нестабильным, и в последние два десятилетия в эндемичных регионах появились штаммы с новыми мутациями в мобильных генетических элементах, связанных с патогенностью (остров патогенности VPI-1, профаг CTXφ) или способностью к эпидемическому распространению (остров пандемичности VSP-II) [6, 7]. Возникла мутация в гене tcpA из острова патогенности VPI-1, кодирующем основной белок токсин-корегулируемых пилей или TCP — ключевого фактора колонизации. Новый аллель гена tcpA обозначили как tcpA^CIRS101 [8] или tcpA^CIRS. Затем появились штаммы с новым аллелем гена ctxB — ctxB7 [6]. Важным следствием таких мутаций стало усиление вирулентности возбудителя за счёт повышенной продукции холерного токсина [9, 10]. Кроме того, обнаружили вариабельность устойчивости к лекарственным препаратам, связанную с присутствием в геноме разных типов интегративного конъюгативного элемента (integrative conjugating element, ICE) SXT, несущих различный набор генов резистентности к антибиотикам [11]. Более того, у геновариантов появились мутации в коровой области хромосомы. Так, штаммы из 3-й волны в гене rtxA, кодирующем многофункциональный цитотоксин MARTX (multifunctional autoprocessing repeats-in toxin), имели null-мутацию (аллель rtxA4), которая привела к образованию стоп-кодона и утрате биосинтеза этого токсина [12]. Выявлены также 2 точечные мутации в генах gyrA(G248T) и parC(C254T), кодирующих топоизомеразы, которые обусловили формирование у патогена резистентности к налидиксовой кислоте [13]. Более того, недавно стало известно о возникновении геновавариантов с мутацией в регуляторном гене carR(G265A), ставшей причиной утраты их устойчивости к полимиксину B — одному из фенотипических маркеров вибрионов El Tor [14].

Появление и широкое распространение различных генетических вариантов возбудителя в эндемичных очагах холеры привело к их завозу на территорию России в период 2-й и 3-й волн пандемии. Изучением геновариантов занимались многие исследователи [15–18]. Особое внимание было уделено установлению филогенетических связей штаммов из разных эндемичных и неэндемичных регионов [19–23]. Однако многие вопросы о динамике изменений генома геновариантов в течение длительного периода изучены недостаточно. Так, не проведён сравнительный анализ изменчивости генотипов штаммов геновариантов, выделенных в эндемичных регионах и на территории России в течение длительного периода. Между тем поиск генетических особенностей штаммов, выделенных на различных территориях и в разные временны΄е периоды, представляет значительный интерес для понимания направления изменения вирулентных свойств возбудителя. Более того, сведения о вариабельности генов патогенности и лекарственной устойчивости новых геновариантов в случае их завоза в Россию необходимы для своевременной разработки адекватных генодиагностических и профилактических средств. Всё это определяет актуальность работы.

Цель работы — анализ динамики изменения генов патогенности и лекарственной устойчивости генетических вариантов V. choleraе El Tor из эндемичных стран и России.

Решение поставленных вопросов было основано на анализе сиквенсов полных геномов различных штаммов геновариантов, циркулирующих в последние годы в разных эндемичных регионах и завезённых в Россию. Выбранный подход позволяет получить более полную и достоверную информацию по сравнению с другими методами об изменении указанных генов, расположенных в разных участках хромосомы.

Материалы и методы

В работе использовали секвенированные нуклеотидные последовательности полных геномов 86 штаммов геновариантов V. cholerae El Tor (1991–2022 гг.), взятых из баз данных NCBI GenBank и European Nucleotide Archive, а также полученные нами сиквенсы 14 штаммов геновариантов, завезённых в Россию в 1993–2014 гг., и 4 штаммов, выделенных во время вспышки холеры в 2011 г. на Украине [24] (таблица).

Штаммы V. cholerae биовара El Tor, полногеномные нуклеотидные последовательности которых использованы в работе

Strains of Vibrio cholerae biovar El Tor, the whole genome nucleotide sequences of which were used in the study

№ \| No.	Место и год выделения The site and year of isolation	Аллель генов Allele of genes			Структура генов Genes structure			Номер доступа в Gen Bank/ENA Gen Bank/ENA access number
№ \| No.	Место и год выделения The site and year of isolation	ctxB	tcpA	rtxA	gyrA	parC	carR	Номер доступа в Gen Bank/ENA Gen Bank/ENA access number
Штаммы из эндемичных стран Азии и Африки \| Strains from endemic Asian and African countries
N16961	Бангладеш, 1975 \| Bangladesh, 1975	ctxB3	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	AE003852, AE003853
V212-1	Индия, 1991 \| India, 1992	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	ERR018125
VC51	Индия, 1992 \| India, 1992	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	ERR018124
MJ-1236	Бангладеш, 1994 \| Bangladesh, 1994	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	CP001485
CIRS101	Бангладеш, 2002 \| Bangladesh, 2002	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	ACVW01000000
4519	Индия, 2005 \| India, 2005	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	ERR025374
4656	Индия, 2006 \| India, 2006	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	ERS013258
4488	Индия, 2006 \| India, 2006	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	ERS013234
4551	Индия, 2007 \| India, 2007	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	ERR025357
4623	Индия, 2007 \| India, 2007	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	ERS013267
4646	Индия, 2007 \| India, 2007	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	ERS013237
VN243P07	Вьетнам, 2007 \| Vietnam, 2007	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SRR6027863
IND031	Индия, 2009 \| India, 2009	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX062980
IND033	Индия, 2009 \| India, 2009	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX062982
IND041	Индия, 2009 \| India, 2009	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX062990
IND048	Индия, 2009 \| India, 2009	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX062997
VC-6	Непал, 2010 \| Nepal, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	SRR308703
VC-14	Непал, 2010 \| Nepal, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	SRR308715
VC-19	Непал, 2010 \| Nepal, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	SRR308722
VC-16	Непал, 2010 \| Nepal, 2010	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SRR308717
VC-8	Непал, 2010 \| Nepal, 2010	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SRR308705
BGD043	Бангладеш, 2010 \| Bangladesh, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179812
BGD113	Бангладеш, 2010 \| Bangladesh, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179747
NHCM-053	Бангладеш, 2011 \| Bangladesh, 2011	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	GCA001187105
BGD117	Бангладеш, 2011 \| Bangladesh, 2011	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179750
BGD056	Бангладеш, 2011 \| Bangladesh, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179776
IND051	Индия, 2011 \| India, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063000
IDH-04808	Индия, 2012 \| India, 2012	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX063018
BGD060	Бангладеш, 2012 \| Bangladesh, 2012	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179773
BGD065	Бангладеш, 2012 \| Bangladesh, 2012	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179774
BGD067	Бангладеш, 2012 \| Bangladesh, 2012	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179777
BGD119	Бангладеш, 2012 \| Bangladesh, 2012	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179752
BGD120	Бангладеш, 2012 \| Bangladesh, 2012	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179753
BGD122	Бангладеш, 2013 \| Bangladesh, 2013	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179755
BGD082	Бангладеш, 2013 \| Bangladesh, 2013	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	DRX179791
IND071	Индия, 2013 \| India, 2013	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063020
IDH-05298	Индия, 2013 \| India, 2013	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063023
IND079	Индия, 2013 \| India, 2013	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063028
IND082	Индия, 2014 \| India, 2014	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063031
IND090	Индия, 2014 \| India, 2014	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX063039
BGD095	Бангладеш, 2014 \| Bangladesh, 2014	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179793
BGD089	Бангладеш, 2014 \| Bangladesh, 2014	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179789
BGD128	Бангладеш, 2015 \| Bangladesh, 2015	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179758
BGD132	Бангладеш, 2015 \| Bangladesh, 2015	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179760
Tanz 14	Танзания, 2015 \| Tanzania, 2015	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERS2318685
UG026	Уганда, 2015 \| Uganda, 2015	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMN08744332
4621STDY- 6714750	Кения, 2015 \| Kenya, 2015	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERS1572785
4621STDY- 6714749	Кения, 2015 \| Kenya, 2015	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERS1572784
UG020	Уганда, 2016 \| Uganda, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMN08744331
UG010	Уганда, 2016 \| Uganda, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMN08744330
4621STDY- 6714780	Кения, 2016 \| Kenya, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERS1572815
BGD143	Бангладеш, 2016 \| Bangladesh, 2016	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179768
BGD140	Бангладеш, 2016 \| Bangladesh, 2016	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	DRX179766
IND220	Индия, 2016 \| India, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX179803
IND231	Индия, 2016 \| India, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX179808
BGD137	Бангладеш, 2016 \| Bangladesh, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	DRX179763
CNRVC170168	Йемен, 2016 \| Yemen, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2265674
CNRVC170175	Йемен, 2016 \| Yemen, 2016	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2269613
NALMLE36	Бангладеш, 2017 \| Bangladesh, 2017	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SIVL00000000
NALMLE34	Бангладеш, 2017 \| Bangladesh, 2017	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SIVJ00000000
NALMLE37	Бангладеш, 2017 \| Bangladesh, 2017	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA1	G248T	C254T	int.	SIVM00000000
THSTI_56695	Индия, 2017 \| India, 2017	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2270661
THSTI_56712	Индия, 2017 \| India, 2017	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2270662
CNRVC170179	Йемен, 2017 \| Yemen, 2017	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2269617
CNRVC170208	Йемен, 2017 \| Yemen, 2017	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2269811
CNRVC170197	Йемен, 2017 \| Yemen, 2017	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	ERR2269710
NALMLE05	Бангладеш, 2018 \| Bangladesh, 2018	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	SIUG00000000
NALMLE01	Бангладеш, 2018 \| Bangladesh, 2018	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SIUC00000000
NALMLE03	Бангладеш, 2018 \| Bangladesh, 2018	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SIUE00000000
NALMLE31	Бангладеш, 2018 \| Bangladesh, 2018	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SIVG00000000
KDCP136	Бангладеш, 2018 \| Bangladesh, 2018	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297670
KDCP183	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	SRR14297546
CMR50	Камерун, 2019 \| Cameroon, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMN16213389
CMR44	Камерун, 2019 \| Cameroon, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMN16213387
KDCP208	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297682
KDCP245	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297553
KDCP262	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297555
KMCP107	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297699
KMCP145	Бангладеш, 2019 \| Bangladesh, 2019	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SRR14297701
DMAVC-20	Бангладеш, 2021 \| Bangladesh, 2021	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMD00514837
DMAVC-1	Бангладеш, 2022 \| Bangladesh, 2022	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMD00514672
DMAVC-16	Бангладеш, 2022 \| Bangladesh, 2022	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMD00514833
DMAVC-19	Бангладеш, 2022 \| Bangladesh, 2022	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	SAMD00514836
Штаммы из Российской Федерации \| Strains isolated in the Russian Federation
*М-1275	Россия, Каспийск, 1993 Russia, Kaspiysk, 1993	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	LRAF00000000
*М-1270	Россия, Набережные Челны, 1993 Russia, Naberezhnye Chelny, 1993	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	VXCC0000000
*М-1293	Россия, Республика Дагестан, 1994 Russia, Dagestan Republic, 1994	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	JFFW00000000
I-1181	Россия, Новосибирская область, 1994 Russia, Novosibirsk region, 1994	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	UCN00000000
I-1263	Россия, Иркутск, 1997 Russia, Irkutsk, 1997	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	G248T	int.	int.	JPLT00000000
*Р-17644	Россия, Ачинск, 1997 Russia, Achinsk, 1997	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	G248T	int.	int.	JRTW00000000
*М-1327	Россия, Дагестан, 1998 Russia, Dagestan, 1998	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	LRFE00000000
I-1300	Россия, Южно-Сахалинск, 1999 Russia, Yuzhno-Sakhalinsk, 1999	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	int.	int.	int.	JZCC00000000
*М-1344	Россия, Казань, 2001 Russia, Kazan, 2001	ctxB1	tcpA^Elt	rtxA1	G248T	int.	int.	NEDY00000000
*М-1429	Россия, Белорецк, 2004 Russia, Beloretsk, 2004	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	LAEM00000000
*М1430	Россия, Тверь, 2005 \| Russia, Tver, 2005	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	AYOM00000000
*Р-18899	Россия, Мурманск, 2006 Russia, Murmansk, 2006	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	LAKM00000000
*81	Россия, Ростов-на-Дону, 2014 Russia, Rostov-on-Don, 2014	ctxB1	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	JRQM00000000
*L-3226	Россия, Москва, 2010 \| Russia, Moscow, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	JDVX00000000
*L-4150	Россия, Москва, 2010 \| Russia, Moscow, 2010	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	JNGT00000000
*76	Украина, Мариуполь, 2011 Ukraine, Mariupol, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	MPVL00000000
*153	Украина, Мариуполь, 2011 Ukraine, Mariupol, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	MWRE00000000
*39	Украина, Мариуполь, 2011 Ukraine, Mariupol, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	MWRC00000000
*186	Украина, Мариуполь, 2011 Ukraine, Mariupol, 2011	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	int.	PYBQ00000000
*M1509	Россия, Москва, 2012 \| Russia, Moscow, 2012	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	AYNL00000000
*3265/80	Россия, Москва, 2014 \| Russia, Moscow, 2014	ctxB7	tcpA^CIRS	rtxA4	G248T	C254T	G265A	JRQL00000000

Примечание. *Штаммы, нуклеотидные последовательности геномов которых секвенированы нами; int. — интактный.

Note. *Nucleotide sequences of strains sequenced by us; int. — intact.

Для проведения исследований штаммы получали из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофилизированном состоянии. Бактерии культивировали в бульоне и агаре LB при 37ºС.

Чувствительность 18 штаммов к 2 антибиотикам определяли общепринятым диско-диффузионным методом с использованием полимиксина B (50 мкг) и налидиксовой кислоты (30 мкг) фирм «HiMedia Laboratories Pvt. Ltd» и «Oxoid».

Для проведения секенирования выполняли выделение и очистку геномной ДНК из бактериальной суспензии с использованием набора «Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» («Axygen»). Клетки предварительно обрабатывали мертиолятом натрия до конечной концентрации 1 : 10 000 (0,01%) и прогревали при 56ºC в течение 30 мин. Полные геномы холерных вибрионов секвенировали на генетическом анализаторе «Ion PGM» («Thermo Fisher Scientific») с использованием стандартных протоколов подготовки проб и программного обеспечения. Для картирования и поиска единичных нуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP) в полученных прочтениях использовали программный пакет «Snippy v. 4.6.0». Прочтения картировались на геном референсного штамма V. сholerae N16961, и затем формировалось множественное выравнивание, содержащее SNP в областях, присутствующих во всех исследуемых геномах. Для построения дендрограммы по алгоритму максимальной экономии применяли программный пакет «BioNumerics v. 7.6».

Результаты

Динамика изменения генов патогенности и лекарственной устойчивости геновариантов V. cholerae El Tor, циркулирующих в Азии и Африке

Для анализа измененений генов патогенности и лекарственной устойчивости мы провели биоинформационный анализ участков генома, содержащих ключевые (ctxB и tcpA) и дополнительные (rtxA) гены патогенности, а также гены резистентности к антибиотикам, локализованные в SXT-элементе и коровой области хромосомы (гены gyrA, parC и carR), 83 сиквенсов клинических штаммов V. cholerae El Tor из эндемичных регионов, взятых из международных баз данных. Проведённый анализ штаммов, изолированных на территории Индии, Бангладеш, Непала, Йемена, Вьетнама, Танзании, Кении, Уганды и Камеруна в 1991–2022 гг., позволил выявить заметные различия в их структуре у изолятов, выделенных в разные периоды. Сравнение структуры этих генов у различных вариантов говорит о том, что процесс их изменения происходил на протяжении относительно короткого периода времени и был многоступенчатым.

Из анализа полученных нами данных динамика изменения изучаемых свойств генетических вариантов возбудителя холеры El Tor представляется следующей (рис. 1, а). Первый этап — приобретение исходными геновариантами (ctxB1) различных типов SXT-элемента через горизонтальный перенос генов (1993–2001 гг.). Это событие привело к формированию штаммов 2 генотипов, различающихся набором генов резистентности к антибиотикам, — ctxB1ICEVchBan9, содержащих 7 генов (floR, strAB, sul2, dfrA1 и tetAR), кодирующих резистентность к хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаниламиду, триметоприму и тетрациклину соответственно, и ctxB1ICEVcInd5, имеющих лишь 5 генов (floR, strAB, sul2 и dfrA1) при отсутствии генов tetAR. Все последующие этапы были связаны с мутациями генов патогенности и коровых генов резистентности к антибиотикам.

Рис. 1. Динамика изменения свойств штаммов генетических вариантов V. cholerae О1 биовара El Tor, выделенных на территории эндемичных по холере стран Азии и Африки (а) и России (б). Вертикальные пунктирные линии указывают генотипы штаммов, завезённых на территорию России из эндемичных стран.

Одно из важнейших событий на следующем этапе микроэволюции — появление геновариантов с новыми аллелями ключевых (tcpA^CIRS) и дополнительных (rtxA4) генов патогенности, возникших за счёт несинонимичных однонуклеотидных замен в генах tcpA(A266G) и rtxA1(G13602A). Более того, одновременно возникли две точечные мутации в генах gyrA(G248T) и parC(C254T), кодирующих топоизомеразу II (ДНК-гиразу) и топоизомеразу IV, что обеспечило формирование у патогена резистентности к налидиксовой кислоте. Такие геноварианты c генотипом ctxB1tcpA^CIRSrtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)ICEVchInd5, впервые обнаруженные в 2002 г. в Индии, были повсеместно распространены в эндемичных регионах Юго-Восточной Азии в 2002–2007 гг. (рис. 1, а). Тем не менее, наряду с ними, в эндемичных регионах Азии продолжали циркулировать штаммы с интактными генами ctxB1 и rtxA1, но с мутациями в генах tcpA, gyrA, parC. Среди них в Индии (2006–2010 гг.) и Бангладеш (2009–2019 гг.) преобладали штаммы с новым типом SXT — SXT^TET, в составе которого были гены tetAR, strAB, sul2 и dfrA1, но, в отличие от других SXT,отсутствовал ген floR. Генотип таких штаммов был обозначен как ctxB1tcpA^CIRSrtxA1gyrA(G248T)parC(С254T)SXT^TET. Вместе с тем распространения таких геновариантов на других территориях не отмечено. Самым существенным изменением генома возбудителя, повлекшим за собой стремительное распространение современных геновариантов, стала мутация в другом ключевом гене патогенности — ctxB1. Однонуклеотидная замена цитозина (С) на аденин (А) в позиции 58 привела к возникновению нового аллеля ctxB7 и появлению ранее неизвестных геновариантов с мутациями в указанных генах патогенности и устойчивости к антибиотикам (генотип ctxB7tcpA^CIRSrtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)ICEVchInd5). Тем не менее их геном продолжал изменяться.

Значимое изменение, имеющее диагностическое значение, — возникновение дополнительной точечной мутации в регуляторном гене carR — замена гуанина на аденин в позиции 265(G265A). Такая мутация привела к утрате устойчивости к полимиксину у штаммов V. cholerae El Tor — специфического маркера вибрионов этого биовара [10] и появлению популяции с генотипом ctxB7tcpA^CIRSrtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)carR(G265A)ICEVchInd5, повсеместно распространившейся в странах Азии и Африки. Последующая мутация в этих штаммах затронула геном ICEVchInd5. Возникла делеция размером около 10 т.п.н., при которой были утрачены 4 гена резистентности к антибиотикам (floR, strA, strB и sul2). Cохранился лишь ген dfrA1, определяющий устойчивость к триметоприму. Такие новые геноварианты с генотипом ctxB7tcpA^CIRSrtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)carR(G265A)ICEVchInd5ΔVRIII стали широко распространёнными в 2009–2019 гг. в Кении, Танзании, Уганде, а также Бангладеш, Индии, Йемене (рис. 1, а).

Таким образом, cреди исследованных штаммов выявлены 8 типов генетических вариантов, различающихся набором изменённых генов патогенности и резистентности к антибиотикам.

Анализ изменения генов патогенности и лекарственной устойчивости геновариантов возбудителя холеры, выделенных в России

Для выявления изменений в геноме геновариантов, завезённых в Россию в 1993–2014 гг., получили полногеномные сиквенсы 18 токсигенных штаммов, изолированных от больных (15 изолятов) и из водной среды (1 штамм) на территории России и во время вспышки холеры в 2011 г. на Украине, в Мариуполе (таблица) [24]. Затем провели анализ нуклеотидных последовательностей указанных выше генов патогенности и лекарственной устойчивости этих штаммов и 3 клинических изолятов, сиквенсы которых были получены ранее.

Установлено, что изученные штаммы в зависимости от времени завоза несли в геноме разные аллели ключевых и дополнительных генов патогенности ctxB, tcpA и rtxA1, а также различные типы SXT-элемента. К тому же штаммы различались наличием мутации в генах gyrA, parC и carR, кодирующих резистентность к антибиотикам. На рис. 1, б представлены 5 выявленных генотипов завезённых вариантов возбудителя в Россию (1993–2014 гг.) и на Украину (2011 г.) и показано время их появления на этих территориях. На ранних этапах формирования геновариантов (1994–1999 гг.) в Республику Дагестан, Южно-Сахалинск и Новосибирск из Пакистана, Саудовской Аравии, Китая и Индии соответственно [25] были завезены штаммы c ctxB1, в геноме которых присутствовал ICEVchBan9 (таблица). Практически одновременно (1994–2001 гг.) в другие регионы России (Иркутск, Ачинск, Казань) из Казахстана [18] были занесены геноварианты ctxB1 c другим типом SXT — ICEVcInd5. Дальнейшие изменения генома привели к появлению в России других вариантов возбудителя с дополнительными мутациями в генах патогенности и коровых генах антибиотикоустойчивости. В 2004–2014 гг. в Белорецке, Твери, Мурманске и Ростове-на Дону от больных и из водной среды были выделены завезённые в основном из Индии штаммы [17] с новыми аллелями генов tcpA и rtxA1 — tcpA^CIRSи rtxA4 соответственно (таблица). Более того, эти варианты возбудителя содержали ещё мутации в генах gyrA и parС, которые привели к резистентности к налидиксовой кислоте. Такие мутации в геноме оказались весьма устойчивыми, поскольку они сохранялись у всех вариантов, выявленных впоследствии. Изолированные в более поздний период штаммы (Москва, Мариуполь; 2010–2014 гг.), отличаясь от предшествующих аллелем ctxB7, относились к новым генетическим вариантам с повышенным патогенным и эпидемическим потенциалом [6, 7]. Более того, при анализе сиквенсов среди новых вариантов возбудителя с геном ctxB7 были обнаружены два штамма (Москва, 2010, 2014 гг.) c дополнительной мутацией в гене carR(C254T), повлекшей за собой утрату резистентности к полимиксину B — диагностического маркера вибрионов El Tor (таблица).

Фенотипический анализ 18 штаммов показал, что 12 штаммов (М-1429, М1430, P-18899, 81, L-3226, L-44150, 76, 153, 39, 186, M1509, 3265/80), выделенных в 2004–2012 гг. и имеющих мутации в генах gyrA и parС, были устойчивы к налидиксовой кислоте, тогда как 6 штаммов (М-1275, М-1270, М-1293, P-17644, М-1327, М-1344), изолированных ранее (1993–2001 гг.) и сохранивших эти гены интактными, были чувствительны к данному антибиотику. Кроме того, 2 штамма (M1509 и 3265/80) c обнаруженной мутацией в гене carR действительно утратили резистентность к полимиксину B (таблица).

Филогенетические связи геновариантов возбудителя холеры из эндемичных стран и России

На рис. 2 представлены филогенетические связи 98 штаммов из Азии, Африки и России, установленные на основе их SNP-анализа. При сравнении полных геномов этих штаммов с референсной последовательностью штамма N16961 выявили 1606 SNP в коровых генах. Построенное филогенетическое дерево и его анализ показали, что исследуемые генетические варианты возбудителя образуют 7 кластеров, в каждый из которых входили штаммы с определённым генотипом (рис. 2). Так, кластеры I и II состояли из геновариантов, изолированных в начальный период их образования (1993–1998 и 1997–2001 гг. cоответственно) и различающихся присутствием в геноме разных типов SXT-элемента. Последующие поэтапные изменения генома возбудителя в процессе эволюции привели к формированию различных групп геноварианов, различающихся новыми мутациями генов патогенности и лекарственной устойчивости и вошедших в состав других 5 кластеров (III–VII), что отражает их геномное разнообразие. Наиболее удалённые от референсного штамма кластеры VI и VII образовали геноварианты, возникшие в последнее десятилетие и несущие сочетание последних наиболее существенных изменений в геноме (ctxB7, carR(C254T) и ctxB7, carR(C254T), ICEVchInd5ΔVRIII) с ранее возникшими мутациями в генах tcpA, rtxA1, gyrA и parС (рис. 2). Тем не менее, несмотря на геномное разнообразие, представленные варианты возбудителя, изолированные в разных эндемичных и неэндемичных регионах, филогенетически связаны друг с другом. Следует особо отметить тесную филогенетическую связь геновариантов из России c изолятами из эндемичных стран Юго-Восточной Азии. В частности, такая связь была выявлена между геновариантами, завезёнными в Россию в 2004–2014 гг., и штаммами, циркулирующими в Индии в тот же период.

Рис. 2. Филогенетическое дерево штаммов из кластеров I–VII генетических вариантов V. cholerae О1 биовара El Tor, построенное на основе полногеномного SNP-анализа. Использована программа «BioNumerics v. 7.6», метод — maximum parsimony tree. Красным обозначены гены патогенности, синим — гены лекарственной устойчивости.

Обсуждение

Одним из важнейших событий в эволюции возбудителя холеры El Tor является образование первых генетических вариантов (1991 г.) за счёт приобретения им генетического материала от V. cho- leraе классического биовара — гена ctxB1. Однако их геном оказался нестабильным, и возникли новые варианты возбудителя с неизвестными ранее свойствами. В нашей работе впервые проведён сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ключевых и дополнительных генов патогенности, а также генов лекарственной устойчивости 104 токсигенных штаммов, циркулирующих в 9 эндемичных регионах и занесённых на территории России на протяжении длительного периода (1991–2022 гг.). Cреди 83 исследованных штаммов, изолированных в эндемичных регионах Азии и Африки в 1991–2022 гг., нами выявлены 8 основных типов генетических вариантов, различающихся набором мутантных генов патогенности (точечные мутации в генах ctxB, tcpA и rtxA1) и резистентности к антибиотикам (разные типы SXT, точечные мутации в генах gyrA, parC и carR и делеция в ICEVchInd5).

Анализ динамики изменения их генома на протяжении почти 30 лет показал, что происходило последовательное накопление мутаций в генах, кодирующих эпидемически важные свойства. Следствием этих мутаций, по данным других исследователей, стало усиление вирулентности патогена за счёт повышенной продукции XT [9, 10], утрата Pol^R — диагностически значимого признака [14], и изменение спектра резистентности к антибиотикам. При этом каждые последующие мутации обеспечивали селективное преимущество новых геновариантов, выражающееся в большой скорости распространения и вытеснении ими ранее сформированных штаммов [1]. Наиболее существенной стала мутация в гене ctxB1, обусловившая появление штаммов с аллелем ctxB7 в дополнение к другим мутациям в генах патогенности и лекарственной устойчивости. Согласно показанной нами динамике изменения генома именно эти варианты, возникшие в современный период пандемии, широко распространены в странах Азии (Индии, Бангладеш, Йемен) и Африки (Танзания, Уганда, Кения), что полностью согласуется с данными других исследователей [1, 9]. Такая ситуация позволяет прогнозировать их появление на территории России в случае завоза возбудителя холеры в результате расширения экономических и туристических связей с указанными регионами. Однако вопрос о том, какой из известных вариантов станет доминирующим в ближайшие годы, остаётся открытым, поскольку продолжающиеся изменения генома являются, видимо, одним из основных механизмов реализации стратегии выживания патогена как в организме хозяина, так и в меняющейся окружающей среде.

Поскольку возможность таких событий подтверждена выявлением в России различных генетически изменённых штаммов, встал вопрос о динамике изменения их генотипа. Получены сиквенсы геномов 18 штаммов, изолированных в России и на Укриане (Мариуполь). Среднее значение покрытия полных последовательностей геномов составило 66,5. Проведённый нами анализ этих сиквенсов, а также 3 сиквенсов, полученных ранее, показал, что динамика изменения генов патогенности и лекарственной устойчивости этих изолятов на протяжении более 20 лет (1993–2014 гг.) полностью соответствовала таковой штаммов, циркулирующих в эндемичных регионах в разные периоды. Важен установленный нами факт, что в последнее десятилетие были завезены новые геноварианты с высокой вирулентностью и изменённым диагностическим свойством за счёт мутаций в генах ctxB1 и carR. Однако, cогласно нашим данным, уровень геномного разнообразия вариантов возбудителя из России был несколько ниже, чем в эндемичных регионах. Так, пока не обнаружены штаммы с утраченными генами резистентности к 4 антибиотикам (floR, strA, strB и sul2) за счёт протяжённой делеции SXT-элемента.

При проведении филогенетического анализа установлено не только геномное разнообразие геновариантов, но и доминирование в настоящее время в эндемичных регионах недавно возникших вариантов с дополнительными мутациями в генах вирулентности и лекарственной устойчивости, которые усилили их патогенный потенциал. Показанные изменения генома возбудителя в эндемичных регионах указывают на необходимость постоянной их оценки для своевременной разработки адекватных средств генодиагностики и профилактики. Обнаружение в России новых геновариантов с ранее неизвестными мутациями и возможные новые их завозы требует разработки быстрых способов их идентификации, что будет способствовать повышению эффективности эпидемиологического надзора за холерой. В частности, полученные данные были использованы нами для разработки быстрых способов идентификациии новых геновариантов с изменёнными генами патогенности и утраченным биовар-специфическим свойством методом мультилокусной полимеразной цепной реакции, что существенно ускорит их генодиагностику.