Сравнительная оценка эффективности воздействия дезинфицирующих веществ на микроорганизмы в биоплёнке

Полный текст

Введение

Способность микроорганизмов к биоплёнкообразованию практически на любых поверхностях является большой проблемой в медицинской практике и других областях человеческой жизнедеятельности [1–3]. Биологическая плёнка (БП) образуется в результате адгезии бактерий к поверхностям объектов окружающей среды, что особенно выражено в условиях высокой влажности [3]. БП состоит из непрерывного мультислоя бактериальных клеток, прикреплённых к поверхности и/или друг к другу, заключённых во внеклеточный полимерный матрикс, состоящий в основном из полисахаридов, белков и нуклеиновых кислот [3, 4]. Матрикс обеспечивает структуру БП, стабильность и защиту микробных клеток внутри БП от обезвоживания и других неблагоприятных для них воздействий окружающей среды [4–7]. Микроорганизмы в БП составляют около 10% от сухой массы, матрикс — до 90% [8].

Исследования [9–12] показали, что бактерии в составе БП более устойчивы к воздействию дезинфицирующих веществ (ДВ), чем их планктонные формы. Это во многом обусловлено затруднением проникновения химических соединений (ДВ) через внеклеточный матрикс, а также снижением метаболизма и скорости деления бактерий в БП [5, 7]. В результате режимы дезинфекции объектов внутрибольничной среды, разработанные с использованием планктонных клеток, неэффективны в отношении микроорганизмов в составе БП, а официальные методы оценки эффективности ДВ в отношении микроорганизмов в составе БП отсутствуют.

Вместе с тем в многочисленных исследованиях продемонстрировано присутствие сухих микробных БП на многих поверхностях в медицинских учреждениях [13–15]. Патогенные микроорганизмы, включённые в БП, на сухих поверхностях могут выживать в течение длительного времени и периодически высвобождаться в виде свободноживущих планктонных клеток в окружающую среду. БП, будучи резервуаром патогенных микроорганизмов, функционируют как источник распространения патогенных бактерий во внутрибольничной среде [16]. Исследованиями [17–19] подтверждена важная роль микробных БП, обнаруживаемых на эпидемиологически значимых объектах в медицинских учреждениях, в распространении и передаче госпитальных штаммов микроорганизмов и возникновении инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

В настоящее время отсутствуют комплексные системные исследования по изучению воздействия биоцидов на микроорганизмы в составе БП и способности существующих рецептур моющих и дезинфицирующих средств разрушать БП.

В связи с этим была поставлена цель — определить антимикробную активность и разрушающее действие основных ДВ дезинфицирующих средств — хлорактивных и кислородактивных соединений, катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), спиртов и альдегидов — в отношении тест-микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 и Staphylococcus aureus ATCC 6538-P в составе БП.

Материалы и методы

Для дезинфекции поверхностей в помещениях медицинских учреждений рекомендуется использовать ДВ на основе катионных ПАВ, спирта, перекись водорода и средства на основе хлора. Для исследования отобраны химические соединения — наиболее типичные представители основных ДВ, используемых в качестве активного вещества в рецептурах дезинфицирующих средств:

• из группы катионных ПАВ — алкилдиметилбензиламмоний хлорид (АДБАХ) в концентрациях 0,1–1,0%, полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ) — 0,02–0,05%, третичный алкиламин (ТА) — 0,1–1,0%;
• из группы кислородактивных — перекись водорода (ПВ) в концентрациях рабочего раствора 3–6%;
• из группы хлорактивных — средство дезинфицирующее Хлорамин (ХА) в концентрациях рабочего раствора 0,5–1,0% по препарату; натриевая соль дихлоризоциануровой кислоты (Na-ДХЦК) 0,03–0,10% по активному хлору (АХ), гипохлорит натрия (ГХ) — 0,5–1,0% по АХ;
• из группы спиртов — этиловый спирт (ЭС) — 40–70%;
• из группы альдегидов — глутаровый альдегид (ГА) — 0,25–1,00%.

Средства на основе хлора и перекиси водорода при дезинфекции поверхностей наиболее часто используются с добавлением 0,5% моющего средства в целях придания дополнительно моющих свойств. В связи с этим изучена эффективность химических соединений Na-ДХЦК, ГХ и ПВ с добавлением 0,5% сульфонола, который является анионным ПАВ.

В качестве тест-микроорганизмов использованы референс-штаммы из коллекции американских типовых культур (АТСС) — P. aeruginosa ATCC 15442 и S. aureus ATCC 6538-P. Данные референс-штаммы используются для оценки бактерицидной активности в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий в соответствии с Р 4.2.3676-20 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности» [20].

Культивирование БП бактерий осуществляли статическим методом в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах для микротитрования согласно G.A. O'Toole и соавт. [21]. Суточные культуры штаммов бактерий стандартизировали до 2,0 по McFarland и разводили 1 : 100 в триптон-соевом бульоне. В лунки 96-луночного плоскодонного планшета вносили по 100 мкл бульонных культур бактерий и закрытые планшеты выдерживали статически в термостате при 37ºС в течение 24 ч для формирования БП. После этого лунки планшетов трехкратно промывали фосфатно-буферной средой с целью удаления планктонных клеток. Затем в опытную часть лунок вносили 100 мкл ДВ в различных концентрациях, в контрольные лунки — физиологический раствор (0,9% NaCl), далее выдерживали 30 мин, после чего добавляли 100 мкл нейтрализатора, содержащего Твин 80 (3%), сапонин (0,3–3,0%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%), тиосульфат натрия (0,1%).

Эффективность воздействия на сформированные БП ДВ оценивали путём определения относительной оптической плотности красителя — кристаллического фиолетового, который связывался с матриксом БП. Для этого в лунки вносили 200 мкл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового и выдерживали 30 мин. Биомассу БП оценивали по уровню экстракции этанолом красителя, который измеряли на микропланшетном ридере «ТЕCAN DESKTOP-4A7U9AL\Infinite M Plex» при длине волны 580 нм в единицах оптической плотности (OD).

Для оценки жизнеспособности клеток в БП в лунки вносили 100 мкл фосфатно-буферной среды и обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшеты в ультразвуковую ванну «Elma Ultrasonic 30S» («Elma»). Жизнеспособность клеток оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) после высева на плотную питательную среду (триптон-соевый агар) и подсчетом КОЕ/мл после инкубации при 37ºС 24 ч.

Для достоверного обсчёта результатов использовали 6 лунок на 1 опытный образец и рассчитывали среднюю величину оптической плотности опытного образца и логарифмическое число КОЕ. Далее сравнивали усреднённые показатели оптической плотности элюата из БП и КОЕ/мл, обработанных ДВ, с аналогичными в контроле. Сравнения проводили по t-критерию Стьюдента [22]. Данные обрабатывали с использованием пакета статистических программ «MS Excel для Windows». Значение p < 0,05 принимали статистически значимым.

ДВ считали эффективным в отношении тест-микроорганизмов в БП, если количество жизнеспособных клеток в составе БП после воздействия ДВ снизилось на 4 порядка и более. Если показатель оптической плотности после экспозиции снизился более чем на 70% по сравнению с контролем, считали, что ДВ обладает высокой эффективностью, снижение на 30–70% — средней, менее 30% — низкой.

Результаты

Исследуемые культуры микроорганизмов P. aeruginosa ATCC 15442 и S. aureus ATCC 6538-Р через 24 ч образовывали БП плотностью OD₅₈₀ = 1,50 ± 0,19. Среднее количество жизнеспособных клеток в БП составило 6,2 ± 0,7 lg.

Воздействие на сформированные БП 0,1% и 1,0% растворов АДБАХ приводило к снижению плотности БП по сравнению с контролем (первичной БП) на 48,6 ± 9,5 и 51,2 ± 8,1% (рис. 1) и снижению количества жизнеспособных клеток в БП на 2 и 3 lg (рис. 2) соответственно.

 

Рис. 1. Сравнительная оценка воздействия ДВ на плотность сформированных БП P. aeruginosa ATCC 15442 и S. aureus ATCC 6538-Р.

 

Рис. 2. Сравнительная оценка воздействия ДВ на выживаемость клеток P. aeruginosa ATCC 15442 и S. aureus ATCC 6538-Р в БП.

 

При действии растворов ТА на БП наблюдалась прямая зависимость между повышением концентрации ДВ и разрушением матрикса БП. После воздействия на сформированные БП 0,1% и 1,0% растворов ТА плотность БП снижалась на 58,2 ± 5,5 и 72,5 ± 8,2%, а количество жизнеспособных клеток уменьшалось на 3 и 4 lg соответственно.

При воздействии на БП P. aeruginosa АТСС 15442 и S. aureus АТСС 6538-P 0,02 и 0,05% растворами ПГМГ наблюдали значительное снижение её плотности — на 78,1 ± 9,3 и 87,5 ± 5,9% и снижение количества жизнеспособных клеток на 5 lg и более.

При воздействии растворами ГА в концентрациях 0,25 и 1,0% наблюдалось слабое снижение плотности БП — на 24,66 ± 9,6 и 10,75 ± 4,5% и незначительное уменьшение количества микроорганизмов.

ЭС в концентрациях 40 и 70% также оказывал слабое разрушающее действие на БП. С увеличением концентрации ЭС наблюдалось снижение эффективности воздействия. Под влиянием 40% ЭС плотность БП снизилась на 20–25%, а 70% — на 10–12,5% (рис. 1).

Рабочие растворы ПВ в концентрации 3% снижали плотность БП P. aeruginosa АТСС 15442 и S. aureus АТСС 6538-P на 46,55 ± 9,45 и 54,45 ± 7,5%, а количество жизнеспособных клеток — на 2,8 и 3 lg соответственно (рис. 1, 2). При увеличении концентрации ПВ до 6% эффективность воздействия возрастала и наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток — на 4,0–4,5 lg.

При воздействии хлорактивных соединений на БП наблюдалась зависимость эффективности от концентрации ДВ. Более эффективными были 1,0% раствор ХА (по препарату), 0,1% раствор Na-ДХЦК (по АХ) и 1,0% раствор ГХ (по АХ) в сравнении с более низкими концентрациями этих ДВ (рис. 1, 2).

При добавлении в рабочие растворы 3% ПВ, 0,03% Na-ДХЦК (по АХ) и 0,5% ГХ (по АХ) моющего компонента сульфонола в концентрации 0,5% эффективность антимикробного воздействия на микроорганизмы в составе БП увеличилась на 40–52% (рис. 3).

 

Рис. 3. Сравнительная оценка ДВ с добавлением моющего средства на плотность БП (а) и выживаемость (б) P. aeruginosa АТСС 15442 и S. aureus АТСС 6538-P.

 

Обсуждение

Результаты действия дезинфицирующих растворов на БП не однозначны. Действие ДВ обычно ограничивается взаимодействием только с поверхностным слоем БП, поскольку матрикс не позволяет молекулам ДВ свободно диффундировать в глубинные слои. Также известен тот факт, что некоторые из них способны вызвать обратный эффект, проявляющийся в стимуляции роста БП. Это связано с их разрушающим действием только на поверхностные структуры, что облегчает поступление питательных веществ внутрь БП [9, 10].

Эффективность коммерческих дезинфицирующих средств изучена лишь в отношении планктонных форм микроорганизмов, данные об их биоцидной активности в отношении микроорганизмов, растущих в составе БП, отсутствуют. Несмотря на большое количество работ по стратегии борьбы с БП, до сих пор не найдены ДВ, которые могли бы специфически подавлять образование БП и убивать бактерии внутри БП, вызывая при этом их деградацию, разрушая матрикс. Системное исследование основных ДВ в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов в БП проведено впервые. В результате выполненных исследований показано, что ПВ в концентрации 6%, раствор Na-ДХЦК — 0,1% (по АХ), ГХ — 1,0% (по АХ), ХА — 1,0% (по препарату), ПГМГ — 0,05%, ТА — 1,0% снижают количество микроорганизмов в БП на 4 lg и более, а плотность БП — на 70% и более. Необходимость применения биоцидов из группы окислителей в более высоких эффективных концентрациях, вероятнее всего, связана с частичной их инактивацией биополимерами в поверхностных слоях БП. Матрикс БП ограничивает диффузию через поверхность БП вглубь и нейтрализует часть ДВ, обеспечивая устойчивость микробной БП к действию этих соединений. Поскольку для придания моющих свойств хлорактивным соединениям в условиях практического использования к ним добавляют моющие вещества, изучено действие растворов этих соединений при добавлении 0,5% сульфонола. Установлено повышение эффективности воздействия хлорактивных соединений и ПВ, что, возможно, связано с повышением проницаемости матрикса БП под воздействием анионного ПАВ — сульфонола, способствовавшего повышению диффузии ДВ в БП из-за снижения поверхностного натяжения раствора и, следовательно, улучшения смачивания поверхности БП.

Из группы катионных ПАВ наименее активным в отношении бактерий в БП был АДБАХ. Это связано с тем, что отрицательно заряженные полисахариды БП способны связывать положительно заряженные молекулы АДБАХ и тем самым защищать БП от деструкции [23]. Вместе с тем имеются данные литературы о возможности применения четвертичных аммониевых соединений для борьбы с микробными БП при усилении их действия синергистами или ферментами в композиционных средствах [24].

ТА проявлял достаточное действие в концентрации 1%. Особенностью ТА является сочетание антимикробных и моющих свойств. За счёт наличия свободных аминогрупп и атома третичного азота формируется щелочная среда, что способствует повышению антимикробной активности [24].

ПГМГ продемонстрировал бактерицидные преимущества по сравнению с АДБАХ и ТА. Высокие показатели снижения плотности БП и выраженного антимикробного действия свидетельствует о существенном нарушении целостности структуры БП в результате разрушения полисахаридного матрикса и воздействии на бактерии. Механизм действия этого эффекта пока не раскрыт и требует более глубокого изучения.

Растворы ГА (0,25–1,00%) и ЭС (40–70%) на деструкцию БП и гибель микроорганизмов в БП влияли очень слабо. В исследованиях [25] было обнаружено, что ГА реагирует с аминогруппами БП, поперечно сшивая длинные молекулы биополимеров, чем вызывает лишь набухание или коагуляцию поверхностного слоя БП, делая невозможным дальнейшую диффузию ГА вглубь микробной БП. Низкая эффективность ЭС связана с наличием фиксирующего действия и плохим проникновением молекул спирта в богатые белком материалы [26]. С повышением концентрации спирта плотность БП повышалась.

Заключение

Для борьбы с микробными БП перспективны дезинфицирующие вещества из группы окислителей (хлорактивные и кислородсодержащие), ТА и ПГМГ; применение четвертичных аммониевых соединений как индивидуального соединения не эффективно; альдегиды и спирты для разрушения БП и уничтожения в ней микроорганизмов не пригодны. Применённая для оценки эффективности биоцидов методика может быть рекомендована для исследования и оценки дезинфицирующей активности средств для борьбы с микробными БП на этапе первичного отбора.

Об авторах

Людмила Самуиловна Федорова

Научно-исследовательский институт системной биологии и медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: fedorova-ls@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2663-0273

д.м.н., профессор, заведующий лабораторией преодоления микробной резистентности НИИ системной биологии и медицины

Россия, Москва

Анастасия Васильевна Ильякова

Научно-исследовательский институт системной биологии и медицины

Email: fedorova-ls@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1867-3495

н.с. лаб. преодоления микробной резистентности НИИ системной биологии и медицины

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы