Анализ уровня продукции факторов инвазии InlA и InlB у изолятов Listeria monocytogenes, выделенных на территории Российской Федерации

Полный текст

Введение

Listeria monocytogenes вызывает опасную пищевую инфекцию с высокой (около 30%) летальностью у людей, находящихся в группе риска, а также у домашних и диких животных [1, 2]. Генетическую структуру вида L. monocytogenes подразделяют на 4 филогенетические линии [3].

I филогенетическая линия включает клональные комплексы (СС) CC1, CC2, СС4 и СС6, наиболее часто ассоциированные с листериозом у человека [4]. Штаммы CC1 и СС2 были разными методами отнесены к эпидемическим клонам ECII и ECIV соответственно, вызвавшим крупные вспышки листериоза в разных странах, в том числе в России. В Европе и США среди изолятов, выделенных из клинических случаев, преобладают штаммы СС1, на долю которых приходится 11,4% [5].

На территории России до 1980 г. доминировали штаммы II линии, выделяемые как из случаев листериоза у людей и животных, так и из природных источников, бóльшая часть которых относилась к СС7 (также известному как эпидемический клон ECVII) [6]. Штаммы CC7 и до настоящего времени преобладают в природных очагах на территории европейской части России, а также их часто выделяют при спорадических случаях листериоза у людей и животных [7]. Штаммы относящегося ко II линии СС9 часто выделяют из пищевых продуктов и объектов окружающей среды, в том числе на территории России [7]. В структуре инфекционной патологии стран Европы и Северной Америки штаммы СС7 относят к штаммам средней вирулентности, а клональный комплекс СС9 считают низковирулентным [8]. Разницу в частоте встречаемости среди клинических изолятов и, соответственно, в потенциальной вирулентности штаммов, относящихся к разным СС и/или филогенетическим линиям, разные авторы связывают с наличием дополнительных факторов вирулентности [9], аллельным разнообразием факторов вирулентности [10], а также уровнем их экспрессии [11].

Начальным этапом инфекции является взаимодействие листерий с непрофессиональными фагоцитами при помощи белков, относящихся к семейству интерналинов, — InlA и InlB, которые позволяют L. monocytogenes проникать в энтероциты кишечника и эпителиальные клетки через взаимодействие c целевыми рецепторами. Специфическим рецептором InlA является Е-кадгерин. InlB специфически взаимодействует с двумя рецепторами: c-Met и gС1q-R [12]. Для инвазии в энтероциты достаточно наличия функционального InlA [13], в гепатоциты — только InlB [14], а совместное действие InlA и InlB опосредует пересечение плацентарного барьера [15].

Для установления аллельного разнообразия генов inlA и inlB проводят их секвенирование. Результаты этих исследований показывают, что клинические штаммы и, что наиболее важно, штаммы, вызывающие внутриутробные и неонатальные инфекции, экспрессируют полноразмерный InlA чаще, чем штаммы пищевого происхождения. Укороченный InlA был обнаружен в большинстве гиповирулентных изолятов CC9 и CC121 [16] и в других клональных комплексах филогенетической линии II (например, CC331, CC199 и CC321) [4].

Ранее было показано, что клинические и пищевые изоляты отличаются уровнем экспрессии генов inlA и inlB [11]. Экспрессия ключевых факторов патогенности активируется во время клеточной инфекции и зависит от регулятора транскрипции PrfA. L. monocytogenes имеет сложную систему перекрёстных взаимодействий между регуляторными цепями σ^B и PrfA, чтобы обеспечить оптимальную реализацию генов, необходимых во внешней среде, включая репрессию генов, связанных с вирулентностью. И наоборот, внутри организма эта регуляторная сеть обеспечивает повышенную экспрессию генов, связанных с вирулентностью, для успешной инвазии [17]. Активность PrfA снижается при культивировании L. monocytogenes на богатой питательной среде. Гидрофобные адсорбенты, включённые в состав среды культивирования, активируют PrfA и индуцируют повышенную активность генов факторов вирулентности [18]. Однако механизмы, контролирующие уровень продукции соответствующих белков-факторов патогенности, остаются неисследованными.

Для оценки уровня экспрессии белков используют разнообразные методы, такие как ферментативная активность целевого образца и иммуноблотинг. Оценку ферментативной активности невозможно использовать, если белки не являются биокатализаторами. Применение иммуноблотинга является трудоёмким процессом, в котором анализ невозможно провести с большим числом образцов. В качестве альтернативного метода для качественной и количественной идентификации InlA и InlB была разработана тест-система на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Используя данную ИФА-тест-систему, мы проанализировали изоляты L. monocytogenes из коллекции НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи на предмет уровня экспрессии InlA и InlB и его корреляции с филогенетическим положением штаммов.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия культивирования бактерий

В работе использованы штаммы Listeria spp. из коллекции НИЦЭМ им. Гамалеи (табл. 1). Культивирование микроорганизмов осуществляли в жидкой питательной среде BHI («Becton Dickinson») при 37ºС в режиме постоянного встряхивания при 180 об/мин. Для активации PrfA в бульон BHI добавляли 1% (мас/об.) гидрофобного адсорбента Amberlite XAD 4 («Sigma-Aldrich»).

 

Таблица 1. Используемые штаммы Listeria spp.

Table 1. Listeria spp. strains used in the study

Штамм | Strain	Характеристика | Characteristics	Источник | Source	Ссылка | Reference
L. monocytogenes
EGDe	CC9	Типовой штамм | Type strain	BIGSdb ID = 1
EGDeΔinlB	inlB deletion	Предоставлен профессором J. Vazquez Boland Kindly provided by Prof. J. Vazquez-Boland
EGDeΔinlA	inlA deletion
VIMHA004	CC2	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3449
VIMHA007	CC2	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3450
VIMHA006	СС2	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3606
VIMHA009	CC1	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3452
VIMHA011	CC1	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3454
VIMHA010	CC1	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3453
VIMHA012	CC1	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3607
VIMHA017	CC1	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3609
L.mo25	CC1	Курица | Chicken	BIGSdb ID = 79358
L.mo70	CC8	Курица | Chicken	BIGSdb ID = 78808
L.mo78	CC37	Курица | Chicken	BIGSdb ID = 79363
VIMPH006	CC7	Носитель | Carrier	BIGSdb ID = 3464
L.mo71	CC59	Курица | Chicken	BIGSdb ID = 78809
GIMC2010:LmcUH8	СС7	Носитель | Carrier	BIGSdb ID = 42978
GIMC2032:LmcINH-1	СС7	Носитель | Carrier	BIGSdb ID = 45728
GIMC2007:LmcIH1_3	СС7	Носитель | Carrier	BIGSdb ID = 42975
766	СС7	Свинья | Swine	BIGSdb ID = 5803
VIMPR134	CC7	Грызун | Rodent	BIGSdb ID = 3459
VIMPR422	CC7	Грызун | Rodent	BIGSdb ID = 3460
VIMPA064	CC7	Новорождённый | Newborn	BIGSdb ID = 3455
L.mo84	СС37	Мясо | Meat	BIGSdb ID = 79367
L.mo49	CC9	Курица | Chicken	BIGSdb ID = 79359
L.mo129/3	CC9	Молочные продукты | Dairy products	BIGSdb ID = 78797
L.mo75	CC9		BIGSdb ID = 79362
GIMC2035:Lmc7218	CC9	Рыба | Fish	BIGSdb ID = 45731
GIMC2017: Lmc921	CC9	Мясо | Meat	BIGSdb ID = 42987
L.mo98-20	CC9	Молочные продукты | Dairy products	BIGSdb ID = 78795
LO28	CC9	Типовой штамм | Type strain	BIGSdb ID = 3364
L. ivanovii
ATCC 19119		Типовой штамм | Type strain	Американская коллекция типовых культур American Type Culture Collection

 

ПЦР-анализ

Коллекционные изоляты L. monocytogenes лизировали лизоцимом в концентрации 20 мкг/мл в течение 1 ч при 37ºС, далее лизаты обрабатывали протеиназой К в концентрации 25 мкг/мл при 56ºС в течение 1 ч. Полученные образцы кипятили на водяной бане в течение 10 мин. Амплификацию генов inlA и inlB осуществляли в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология») по следующей программе с использованием TransStartTaq-ДНК-полимеразы («TransGen»): 1-й этап (1 цикл): 94ºС — 4 мин; 2-й этап (30 циклов): 94ºС — 30 с, 52ºС — 30 с, 72ºС — 2 мин; 3-й этап (1 цикл): 72ºС — 10 мин. Праймеры подбирали в программе «Ugene v. 40.1» и синтезировали в компании «Синтол». Для гена inlA использовали праймеры: InlA1 5’-ggttgaaaagtatactagtagc-3’; InlA2 5’-ggaagatattagcccaatttc-3’, для гена InlB: InlBF 5’-gcttatggatcctataattcaaaagaag, InlBR 5’-gaaaagctgcagaaaatccgccttc. Продукты амплификации выявляли методом гель-электрофореза. Целевые фрагменты ДНК очищали из геля с использованием набора «Dia-gene» («Диа-М»).

Секвенирование

Подготовку проб к секвенированию проводили согласно рекомендациям Центра коллективного пользования «Геном». Секвенирование ДНК выполняли с помощью набора реактивов «ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1» с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе «Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer». Для определения последовательностей генов были использованы праймеры: InlA1 5’-ggttgaaaagtatactagtagc-3’, InlA2 5’-ggaagatattagcccaatttc-3’, InlA-R 5’-cttcttttgaattata-ggatccataagc-3’, InlA3 5’-ccaatatcccgggaaaagctat-3’, 5’-gcttatggatcctataattcaaaagaag-3’, InlBR 5’-gaaaagctgcagaaaatccgccttc-3’, InlB1 5’-gaagcaggatcccggataac-tgcac-3’, InlB2 5’-atagcgggttaagttgactgc-3’. Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали программу «Ugene v. 40.1» и базу данных BigSdb-Pasteur¹.

Получение поликлональных моноспецифичных антител против InlA и InlB

Кроликов иммунизировали препаратами очищенных рекомбинантных белков InlA и InlB, как было описано ранее [19]. Работа с лабораторными животными проводилась с соблюдением этических принципов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (протокол № 54 от 24.07.2023).

Глобулиновую фракцию гипериммунных сывороток осаждали, добавляя насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄ («Русхим»). Выпавший осадок, содержащий IgG, растворяли в 0,01 М Na-фосфатном буфере pH 6,5 и диализовали против этого же буфера. Полученный раствор пропускали через колонку с ДЭАЭ-сефадексом А-50 и собирали фракцию IgG, выходящую в свободном объёме буфера. Аффинные антитела выделяли на колонке против соответствующих рекомбинантных белков InlA и InlB, иммобилизованных на активированной BrCN-сефарозе («GE Healthcare»). Фракцию, полученную после ДЭАЭ-хроматографии, промывали 0,3 М NaCl и элюировали 4,5 М MgCl₂ («Русхим»). Полученные образцы диализовали против фосфатно-солевого буфера («Sigma-Aldrich»), концентрировали, смешивали с глицерином до концентрации 50% и хранили при –20ºС.

Вестерн-блот-анализ лизатов L. monocytogenes

Белки клеточной стенки получали из ночной культуры, выращенной в BHI-бульоне с добавлением 1% Amberlite XAD 4. Лизаты разделяли в 10% SDS-PAGE в денатурирующих условиях по Леммли и переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad») с диаметром по 0,45 мкм. Нитроцеллюлозные мембраны инкубировали с полученными антителами против InlA или InlB соответственно

в разведении 1 : 10 000 в течение 1 ч. Далее мембрану отмывали 3 раза ТТBS буфером («Bio-Rad») и добавляли вторичные антитела против IgG кролика (в разведении 1 : 20 000). Визуализацию целевых белков InlA и InlB на мембране осуществляли добавлением TMБ-субстрата («Thermo Fisher Scientific»). Для контроля нагрузки белков использовали антитела к GAPDH (в разведении 1: 1000 («Thermo Fisher Scientific»).

Непрямой иммуноферментный анализ

Бактериальные клетки культивировали в течение 24 ч на среде BHI, а затем центрифугировали и промывали трижды фосфатно-солевым буфером. Полученные образцы доводили до оптической плотности OD₆₀₀ = 0,2. Чтобы проверить, что количество клеток совпадает, культуры высевали на агаризованную питательную среду. Лунки 96-луночного планшета покрывали аликвотами по 100 мкл соответствующих тестируемых штаммов L. monocytogenes. Планшеты инкубировали при 37ºC в течение 1 ч, далее трижды отмывали трис-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 (TTBS) («Русхим»), а затем блокировали незанятые участки добавлением в лунки 200 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина («Диа-М»), разведённого в фосфатно-солевом буфере в течение 30 мин. По окончании времени инкубации буфер для блокировки удаляли и добавляли 100 мкл анти-InlB или анти-InlA антител в разведении 1 : 4000 в TTBS и инкубировали 1 ч при комнатной температуре в режиме постоянного встряхивания при 140 об/мин. Далее лунки трижды промывали TTBS и добавляли 100 мкл вторичных антител (козьи антитела против IgG кролика, меченные пероксидазой хрена, «Bio-Rad»), в TTBS. После отмывали 6 раз TTBS по 250 мкл и проявляли добавлением 100 мкл ТМВ-субстрата. Для остановки реакции использовали 100 мкл 2 М H₂SO₄ («Русхим»). Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на планшетном фотометре «iMark» («Bio-Rad»). Концентрацию InlA и InlB определяли по калибровочной кривой (рис. 1).

 

Рис. 1. 96-луночный планшет с результатами анализа.

 

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее 3 раз. Статистический анализ включал однофакторный ANOVA с тестом Тьюки. Значения p < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

Анализ частоты встречаемости изолятов, депонированных в базе данных BigSdb-Pasteur, в зависимости от филогенетического положения и региона выделения

В совокупности в базе данных BigSdb-Pasteur депонировано 111 изолятов, выделенных на территории России от сельскохозяйственных животных и человека, инфицированных L. monocytogenes. Из них 83 изолята были выделены в 1958–2019 гг. сотрудниками НИИЭМ им. Г.П. Сомова, ФИЦВиМ, НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и ГНЦ ПМБ из клинического материала, полученного от мертворождённых в результате перинатального листериоза детей, а также от беременных женщин без клинических признаков инфекции, и из образцов, забранных у пациентов с нейролистериозом и поражениями тканей лёгкого. Анализ базы данных показал, что в случаях листериоза человека преобладали изоляты, принадлежащие к СС7 (II филогенетическая линия), СС1 и СС2 (I филогенетическая линия) по 16, 11 и 8% соответственно. Изоляты, относящиеся к СС9 (II филогенетическая линия), составили 2% (рис. 2).

 

Рис. 2. Частота встречаемости СС среди штаммов L. monocytogenes, информация о которых хранится в базе данных ListiList (Institute Pasteur, Франция), для России и стран Европы и Северной Америки.

 

Далее мы проанализировали распределение в соответствии с СС для изолятов, выделенных на территории Европы (исключая страны, входившие в состав СССР) из клинического материала пациентов с листериозом. Всего в базе депонировано 747 изолятов. При этом 723 изолята представлены теми же клональными комплексами, что и на территории России. Однако процентное соотношение представленности отдельных СС среди клинических изолятов, выделенных на территории Европы, отличалось от российских. Среди европейских изолятов преобладали СС1, СС6 и СС2 (23, 15 и 14% соответственно).

Определение разнообразия inlA и inlB среди изолятов L. monocytogenes, выделенных на территории России, из коллекции НИЦЭМ им. Гамалеи

Анализ базы данных показал, что среди штаммов II филогенетической линии, преобладающих на территории России, штаммы, относящиеся к СС7, чаще встречаются среди клинических изолятов, по сравнению со штаммами, относящимися к СС9. Для понимания потенциальных механизмов, обеспечивающих эти различия, мы просеквенировали гены inlA и inlB 32 штаммов, принадлежащих к данным СС, которые были выделены на территории России.

Среди штаммов, принадлежащих к СС7, выявлены 3 аллельных варианта inlA, в том числе 15 штаммов обладали аллелем 2 гена inlA, представленным в базе данных BigSdb-Pasteur. Однако у 2 штаммов inlA отличался от аллелей, депонированных в этой базе данных. Выявленные мутации были несинонимическими, что указывало на потенциальное функциональное значение замен. Изолят VIMРA064 содержал 1 несинонимическую замену, приводящую к замене глутамина в 364-м положении на пролин в области интерналинового домена, вовлечённого в белок-белковое взаимодействие с эукариотическим рецептором Е-кадгерином. VIMPH006 содержал 3 несинонимические замены в положениях 618, 620 и 621 (пролин, лизин и глутамин вместо аланина, глутамина и серина) вне области интерналинового домена. Ни один из аллелей штаммов, относящихся к СС7, не содержал преждевременных стоп-кодонов.

Из 9 штаммов, принадлежащих к СС9, у 1 штамма выявили наличие стоп-кодона в гене inlA. Стоп-кодон находился вне области интерналинового домена, однако препятствовал формированию полноразмерного белка, в частности, связыванию белка с поверхностью бактерии, что необходимо для функциональной активности InlA как фактора инвазии. Остальные 8 штаммов СС9 кодировали полноразмерный вариант inlA относящийся к аллелю 1. Данные о последовательностях генов inlA доступны в базе данных GenBank под номерами OQ865090–OQ865119.

Секвенирование гена inlB у 32 штаммов не выявило особенностей в пределах клональных комплексов. Для штаммов, относящихся к СС7, был выявлен аллель 2, к СС9 — аллель 1.

Таким образом, анализируя последовательности inlA и inlB, у штаммов, относящихся к СС7 и СС9, установлена внутриклональная вариабельность inlA, в то время как inlB был консервативен для всех штаммов, относящихся к определённому клону. Аллели, выявленные среди штаммов высоковирулентного CC7, кодировали различные изоформы InlA, что может указывать на различия в их взаимодействии с таргетным рецептором на поверхности клеток человека. Вариант, кодируемый альтернативным аллелем inlA, выявленным среди штаммов, относящихся к редко встречающемуся среди клинических изолятов СС9, кодировал нефункциональный укороченный белок.

Уровень экспрессии фактора патогенности L. monocytogenes InlB в штаммах СС1, СС2, СС7 и СС9

Для оценки корреляции между уровнем продукции факторов инвазии InlA и InlB и частотой встречаемости штаммов данного СС среди клинических изолятов были сконструированы 2 тест-системы, основанные на ИФА. Концентрацию белков определяли по калибровочным кривым от 5 до 1000 нг/мл. В качестве стандартов использовали рекомбинантные InlA и InlB (рис. 3).

 

Рис. 3. Иммуноблот клеточных лизатов бактерий Listeria spp. а — моноспецифичные антитела против InlA; б — моноспецифичные антитела против InlB. 1 — L. monocytogenes EGDe ΔinlA; 2 — L. ivanovii ATCC 19119; 3 — L. monocytogenes EGDe (CC9); 4 — L. monocytogenes EGDe ΔinlB; 5 — L. monocytogenes L.mo49 (CC9).

 

Транскрипция обоих генов, кодирующих белки InlA и InlB, находится под контролем регулятора PrfA [12]. При культивировании L. monocytogenes на питательных средах активность PrfA увеличивается в присутствии гидрофобных адсорбентов (активированный уголь или Amberlite XAD4), достигая уровней, характерных для бактерий в процессе инфекции [18]. С целью изучения изменений в концентрации инвазинов в зависимости от состояния PrfA были измерены уровни InlA и InlB без активации и при активации PrfA регулона в зависимости от наличия в питательной среде адсорбента Amberlite XAD4. Без активации PrfA уровень InlA у штаммов L. monocytogenes варьировал от 5 до 65 нг/мл (рис. 4). При этом штаммы, относящиеся к СС1, СС2 и СС7, показывали в среднем более высокий уровень InlA в сравнении со штаммами, относящимися к СС9 (53,5 ± 5,3 нг/мл против 21,1 ± 3,2 нг/мл; p < 0,05). Исключение составил 1 штамм СС9 L.mo129-3, имеющий уровень, сравнимый со штаммами СС1, СС2, СС7 (59,1 ± 1,5 нг/мл).

 

Рис. 4. Уровни InlA изолятов, относящихся к разным СС. Концентрацию InlA измеряли при помощи разработанной ИФА-тест-системы. Бактерии выращивали в среде BHI без и с добавлением 1% Amberlite XAD4.

 

Комплементация питательной среды адсорбентом Amberlite XAD4 и соответствующая активация PrfA приводила к увеличению концентрации InlA у всех штаммов в среднем на 31%. При этом у отдельных штаммов концентрация достигала максимума: VIMHA017 (СС1) — 99 нг/мл, VIMHA007 (CC2) — 93 нг/мл, L.mo71 — 107 нг/мл (CC7), L.mo129-3 (CC9) — 90 нг/мл.

Уровень InlB между штаммами варьировал от 15 до 958 нг/мл без активации PrfA регулона (рис. 5). При этом в среднем концентрация у штаммов CC1 и CC2 составляла 740,5 нг/мл, что было существенно выше, чем у штаммов СС7 и СС9 (209,5 и 177,9 нг/мл соответственно). Но в сравнении с InlA уровень InlB у штамма L.mo129-3 не достигал значений, характерных для штаммов СС1 и СС2, и был меньше в 2 раза (p < 0,05).

 

Рис. 5. Уровни InlB изолятов, относящихся к разным СС. Концентрацию InlA измеряли при помощи разработанной ИФА-тест-системы. Бактерии выращивали в среде BHI без и с добавлением 1% Amberlite XAD4.

 

При активации PrfA концентрация InlB достигала максимальных значений 1353 нг/мл для штаммов СС1 и СС2, 917 нг/мл — для СС7, 835 нг/мл — для СС9. При этом наибольшего увеличения уровня InlB достигала у штаммов СС7 (в 3,29 раза в сравнении с уровнем без активации). Для штаммов СС9 и I филогенетической линии (СС1, СС2) увеличение уровня InlB в присутствии адсорбента составило 2,93 и 1,54 раза соответственно.

Обсуждение

У L. monocytogenes, как и у большинства других патогенных бактерий, клональные группы и линии различаются по вирулентному потенциалу [20, 21]. Например, штаммы II филогенетической линии чаще связаны с пищевыми продуктами, в то время как штаммы I филогенетической линии чаще обнаруживают в клинических изолятах. Однако даже внутри филогенетических линий распределение среди источников различное. Например, штаммы II филогенетической линии, принадлежащие к СС7, чаще, чем штаммы, относящиеся к СС9, выделяют из клинических образцов [20]. Установление природы такой гетерогенности необходимо для понимания механизмов эволюции и формирования высоковирулентных штаммов.

Для ряда патогенных бактерий, например для энтеропатогенных иерсиний, различия в вирулентности связаны с наличием дополнительных факторов патогенности, которые могут присутствовать на плазмидах и мобильных генетических элементах [22]. При поиске дополнительных факторов патогенности у штаммов L. monocytogenes, относящихся к клональному комплексу СС1, был обнаружен бактериоцин LLS, который, предположительно, позволяет листериям дольше выживать в присутствии нормальной микробиоты, однако не является полноценным фактором патогенности и отсутствует у других высоковирулентных штаммов, относящихся к другим СС [23].

Нами была предложена альтернативная гипотеза о роли вариабельности основных факторов патогенности как основного механизма формирования высоковирулентных штаммов L. monocytogenes и других возбудителей сапронозов [24]. Природные изоформы InlB отличаются между собой и по кинетике активации внутриклеточных сигнальных путей, и по константе связывания со своими целевыми рецепторами c-Met и gC1qR [25, 26]. Штаммы, отличающиеся только изоформой InlB, различались в способности поддерживать гастроинтестинальную инфекцию у мышевидных грызунов, а изоформы InlB обусловливали различную инвазию данных штаммов в эпителиальные клетки животных (клетки почки овцы, shKEC) [10]. В данной работе продемонстрирована вариабельность другого фактора инвазии — белка InlA среди штаммов, относящихся к СС II филогенетической линии: СС7 и СС9. Среди проанализированных штаммов выявлен один с нефункциональным белком InlA, что соответствует относительно низкой роли СС9 в клиническом распространении листериоза и совпадает с данными других авторов [27].

Ещё одним механизмом, определяющим вирулентный потенциал штамма, может быть уровень продукции основных факторов патогенности [11]. Ранее было установлено, что уровень продукции InlB влияет на взаимодействие L. monocytogenes с макрофагами [28]. У L. monocytogenes продукция факторов патогенности происходит под положительным контролем белка PrfA, который неактивен в условиях роста, свидетельствующих о пребывании вне организма хозяина (низкая температура, наличие растительных сахаров и гидрофобных пептидов) [22]. Данный механизм регуляции является оправданным, поскольку позволяет исключить избыточность синтеза факторов патогенности для возбудителей сапронозов, когда они обитают в абиотических условиях окружающей среды. Вместе с тем высокий уровень продукции факторов, необходимых для пересечения эпителиального барьера кишечника, должен положительно влиять на вирулентность бактерий. В соответствии с этой гипотезой в данном исследовании показано, что уровень продукции фактора инвазии InlB без активации PrfA был выше в 4 раза у штаммов I филогенетической линии (СС1 и СС2) в сравнении со штаммами II филогенетической линии (СС7, СС9). Уровень продукции InlA без активации PrfA и в условиях активации PrfA у изолятов, относящихся к СС1, СС2, СС7, был выше, чем у изолятов, относящихся к СС9. Это согласуется с тем, что наиболее часто на территории России в клинических образцах встречаются именно СС1, СС2, СС7. При этом у штаммов, относящихся к СС9, которые чаще выделяют из продуктов питания, уровень InlA был ниже в 2,5 раза, за исключением штамма L.mo129-3, который показал схожую с СС1 и СС2 концентрацию.

Таким образом, в нашем исследовании было показано, что высоковирулентные штаммы для человека характеризуются не только определёнными изоформами, но и повышенной продукцией InlA и InlB. Наши данные подтверждают результаты других исследователей, которые установили, что клинические изоляты отличаются от пищевых изолятов уровнем экспрессии inlA [11].

Заключение

В совокупности полученные нами данные согласуются с эпидемиологическими наблюдениями и раскрывают возможные механизмы формирования СС L. monocytogenes с различными вирулентными потенциалами. Полученные результаты имеют фундаментальное значение, но также могут послужить основой для классификации вновь выделенных изолятов на вирулентные и гиповирулентные клоны.

 

¹ URL: https://bigsdb.pasteur.fr/listeria

Об авторах

Егор Валерьевич Калинин

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Email: kalinin.egor@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4478-3225

н.с. лаб. экологии возбудителей инфекций НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, Москва

Ярослава Михайловна Чаленко

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Email: kalinin.egor@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-7901-5226

к.м.н., с.н.с., лаб. экологии возбудителей инфекций НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, Москва

Полина Вагифовна Сафарова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Email: kalinin.egor@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-9051-2664

лаборант-исследователь, лаб. экологии возбудителей инфекций НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, Москва

Виктория Алексеевна Федорова

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Автор, ответственный за переписку.
Email: kalinin.egor@bk.ru
ORCID iD: 0009-0000-9228-3818

лаборант-исследователь, лаб.экологии возбудителей инфекций НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, Москва

Светлана Александровна Ермолаева

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи

Email: kalinin.egor@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-3396-6816

д.б.н., зав. лаб. экологии возбудителей инфекций НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы