Double-stranded RNAs are promising adjuvants for enhancing immunogenicity of vaccines

Full Text

Введение

Поиск природных веществ, усиливающих иммунный ответ организма на введение вакцин, разработка и получение синтетических соединений с адъювантыми свойствами имеют огромное значение для обеспечения эффективной вакцинации населения против вирусных агентов разной природы, в том числе особо опасных. Среди перспективных иммунобиологических препаратов, усиливающих иммунный ответ организма на введение вакцин, можно выделить цитокины (интерфероны (ИФН), интерлейкины, колониестимулирующие факторы), а также индукторы ИФН. На экспериментальных моделях с использованием разных видов животных показано, что такие цитокины, как ИФН-α, ИФН-γ, фактор некроза опухоли-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, обладают адъювантной активностью при вакцинации против широкого спектра инфекций: ВИЧ, бешенства, гриппа, гепатита, герпеса, клещевого энцефалита [1–7].

Индукторы ИФН — двуспиральные рибонуклеиновые кислоты (дсРНК) в силу своей структуры, близкой к структуре промежуточных продуктов вирусной репликации, способны взаимодействовать с клеточными рецепторами и инициировать внутриклеточные сигнальные каскады, ведущие к продукции ИФН-α/ИФН-β [8–10]. ИФН активируют множественные ИФН-зависимые механизмы, необходимые для ингибирования репликации вирусов [9, 11–13]. Помимо индукции противовирусных реакций, дсРНК обладают широким спектром иммуномодулирующей активности. Так, они вызывают повышение поглотительной, метаболической и бактерицидной активности клеток-фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы), активности натуральных киллеров, созревание и активацию дендритных клеток, что, в свою очередь, приводит к активации CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток [14]. Всё это позволяет говорить о том, что дсРНК играют роль своеобразных функциональных линкеров между системами врождённого и приобретённого иммунитета.

На основе синтетических и природных дсРНК создан ряд препаратов для лечения вирусных заболеваний: Ampligen, Hiltonol (США), Полиаденур (Франция), RGC100 (Германия), Ридостин, Полудан (Россия), Ларифан (Латвия). Способность дсРНК, как правило, синтетических, таких как Poly(I:C) и её производные, усиливать иммуногенность вакцин продемонстрирована в экспериментальных условиях при вакцинации против гриппа, в том числе птичьего [15], лихорадок Эбола [16], денге [17], ортопоксвирусных инфекций [18]. Эти данные свидетельствуют о перспективности использования препаратов дсРНК в качестве универсальных адъювантов для усиления иммунного ответа организма на введение вакцин.

Цель исследования — изучение адъювантной активности природных дсРНК, полученных из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием разных моделей индукции специфического иммунного ответа.

Материалы и методы

Препараты

В экспериментах использовали субстанцию препарата ридостин, полученную в отделе разработки технологии и пилотного производства биопрепаратов ИМБТ ГНЦ ВБ «Вектор». Субстанция ридостина (натриевая соль дсРНК, ФСП Р№ 002021/01 — 07 04 20090769-08) представляла собой смесь дрожжевых одноцепочечных и дсРНК с содержанием дсРНК 21,7%.

Для моделирования специфической иммунной реакции были выбраны следующие препараты:

• овальбумин (ОВА; Albumin from chicken egg white lyophilized powder, ≥ 98% (agarose gel electrophoresis), кат. № А5503-5G, «Sigma»);
• субстанция вакцины «ЭпиВакКорона» (ЭВК; ООО «Эпивак», р.п. Кольцово, Россия), содержащая пептидные иммуногены, ковалентно связанные с белком-носителем, без добавления адъюванта гидроокиси алюминия [19, 20]. Концентрация белка в субстанции ЭВК составляла 2,5 мг/мл.

Животные

Исследование проведено на 200 самках мышей линии BALB/c в возрасте 6 нед с массой тела 18–22 г, полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные были разделены случайным образом на группы по 6 особей. Содержание и манипуляции с животными осуществляли с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным согласно Приложению А к Европейской конвенции об охране позвоночных животных, используемых для экспериментов и в других научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986). Эксперименты были одобрены Биоэтической комиссией ГНЦ ВБ «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор»/10-09.2020, утверждён протоколом Биоэтической комиссии № 5 от 01.10.2020).

Способ моделирования иммунного ответа

Для индукции иммунного ответа в I серии экспериментов мышам опытных групп вводили внутримышечно с интервалом 28 сут ОВА в дозах 1, 5, 10 и 20 мкг/мышь и субстанцию дсРНК в дозах 50, 100 или 200 мкг/мышь одновременно с антигеном в суммарном объёме 200 мкл/мышь. На каждую дозу ОВА использовали 3 дозы субстанции дсРНК. Мыши группы сравнения получали инъекции ОВА в тех же дозах в объёме 200 мкл/мышь по аналогичной схеме. Суммарный объём препаратов 200 мкл вводили по 100 мкл в левую и правую задние лапы.

Во II серии экспериментов субстанцию ЭВК вводили животным в дозах, соответствующих 0,25, 0,5, 1,0, и 2,0 человеческой дозы/мышь (1 человеческая доза — 225 ± 45 мкг белка/0,5 мл). Схема введения вакцины, схема и дозы введения субстанции дсРНК соответствовали описанному для экспериментов с ОВА.

Забор крови, получение сывороток крови

Процедура выполнялась на анестезированных с помощью углекислого газа животных [21]. Забор крови у мышей проводили на 10-й день после 2-й иммунизации пастеровской пипеткой из ретроорбитального синуса в объёме 0,5 мл в чистые пробирки типа Эппендорф. Для формирования сгустка и отделения сыворотки кровь оставляли при комнатной температуре на 1 ч, затем выдерживали в холодильнике при 4 ± 2°С в течение 2 ч. Центрифугирование проводили на центрифуге 5810R («Eppendorf») при температуре 6 ± 2°С со скоростью 1800 об/мин в течение 20 мин. Сыворотки крови хранили при температуре 6 ± 2°С не более 7 дней. Для более длительного хранения сыворотки замораживали при –20°С.

Эвтаназия животных

После забора крови мышей подвергали эвтаназии путём цервикальной дислокации [22].

Метод определения титра специфических антител

Для оценки уровня специфических антител в сыворотках иммунизированных мышей методом иммуноферментного анализа в лунки 96-луночных планшетов («Grainer Bio-One») вносили по 100 мкл/лунку раствора антигена (ОВА или субстанцию ЭВК) с концентрацией 5 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4. Антигены сорбировали, инкубируя содержимое лунок планшетов в течение 2 ч при 37°С и 16 ч при 4°С. Раствор с несвязавшимся антигеном удаляли, в лунки вносили по 200 мкл блокирующего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ, рН 7,4). Планшеты инкубировали 2 ч при 37°С, затем лунки планшета трехкратно промывали ФСБ с 0,05% Твин-20 по 350 мкл/лунку.

В лунки ряда А вносили по 200 мкл ФСБ, а в лунки рядов В–Н — по 100 мкл ФСБ с 0,05% Твин-20 и 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина. В лунки ряда А с 1 по 12 стрип вносили 12 образцов суммарных сывороток иммунизированных животных (сыворотки от 6 животных каждой группы объединяли в один пул для анализа). Далее проводили титрование в вертикальных рядах планшета. Из ряда А в ряд В и далее последовательно переносили по 25 мкл раствора, содержащего анализируемые сыворотки (5-кратное титрование), с 10-кратным перемешиванием (пипетированием) раствора в лунках каждого ряда перед переносом в следующий ряд. Из ряда Н по 25 мкл раствора отбрасывали. Для контроля конъюгата в 2 лунки (Н11 и Н12) без образцов сывороток вносили буферный раствор для разведения (однократный ФСБ, рН 7,4, с 0,05% Твин-20 и 0,5% раствором БСА). Планшеты инкубировали на горизонтальном термошейкере PST-60HL-4 («BioSan») 1,5 ч при перемешивании со скоростью 310 об/мин и температуре 37°С. После инкубации лунки планшета пятикратно промывали, как описано выше.

Раствор конъюгата антител козы против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma») в разведении 1 : 4000 в буферном растворе для разведения вносили в лунки по 100 мкл, инкубировали 1 ч на термошейкере (310 об/мин, 37°С). После инкубации четырехкратно промывали, как описано выше. Для проявления цветной реакции в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора хромогена — 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (однокомпонентный готовый раствор, «Sigma-Aldrich»), инкубировали 30 мин при комнатной температуре в защищённом от прямых солнечных лучей месте. Остановку реакции проводили, добавляя в каждую лунку по 50 мкл «стоп-реагента» (1 М раствор серной кислоты). Величину оптической плотности растворов регистрировали при длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера «Varioskan Lux» («Thermoscientific»).

За титр антител анализируемого образца принимали наибольшее разведение исследуемой сыворотки, значение оптической плотности (ОП) которой превышает значение критической (пограничной) оптической плотности (ОП_Кр), которое рассчитывали по формуле:

ОП_Кр = ОП_Ср К_К × 2,

где ОП_Ср К_К — среднее значение ОП контроля конъюгата в лунках Н11 и Н12.

Результаты теста считали положительными, если ОП анализируемой сыворотки превышала ОП_Кр, отрицательными — если ОП сыворотки меньше или равно ОП_Кр.

Расчёт среднегеометрического титра (СГТ) для каждой группы проводили с помощью программы «Microsoft Excel» по формуле:

СГТ = $\sqrt[n]{Х1 \times Х2 \times Х3/3}$,

где Х1, Х2, Х3 — титры суммарной сыворотки для каждой группы мышей в 3 повторах.

Результаты

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что двукратное введение ОВА в диапазоне доз 1–20 мкг/мышь приводило к появлению в крови животных специфических антител в титрах от 100 до 387 298 в зависимости от дозы вводимого ОВА.

 

Таблица 1. Показатели СГТ специфических антител к ОВА в сыворотке крови мышей после двукратной иммунизации ОВА или совместно ОВА и дсРНК / Table 1. Аverage geometric titers of specific antibodies against OVA in the blood serum of mice after a two-time immunization with OVA, or OVA plus dsRNA

ОВА, мкг/мышь OVA, µg/mouse	СГТ после введения ОВА AGT after administration of OVA	СГТ после введения ОВА и дсРНК (мкг/мышь) AGT after administration of OVA and dsRNA (µg/mouse)
		50		100		200
		СГТ | AGT	N	СГТ | AGT	N	СГТ | AGT	N
1	100	689 731	6897	1 678 033	16 780	717 879	7179
5	75 000	2 363 331	32	3 881 968	52	2 791 385	37
10	387 298	2 281 771	6	2 727 026	7	3 096 840	8
20	134 164	5 417 841	40	4 454 890	33	3 807 556	28

Примечание. Здесь и в табл. 2: N — кратность нарастания титров антител к ОВА в сыворотке крови мышей, иммунизированных ОВА в сочетании с дсРНК, по сравнению с показателем после введения только ОВА.

Note. Here and in the Table 2: AGT — average geometric titer of specific antibodies against OVA; N — multiplicity of titers of antibodies against OVA in the blood serum of mice immunized with OVA combined with dsRNA compared to administration of OVA alone.

 

Одновременная иммунизация мышей ОВА и дсРНК в дозах 50, 100 или 200 мкг/мышь приводила к усилению иммунного ответа на антиген. Наибольший прирост титров антител наблюдался при введении дсРНК мышам, иммунизированным наименьшей дозой ОВА — 1 мкг/мышь (табл. 1). Эффект стимуляции возрастал при увеличении дозы дсРНК с 50 до 100 мкг/мышь: среднегеометрические титры повышались с 689 731 до 1 678 033. Дальнейшее повышение дозы препарата дсРНК к увеличению показателя не приводило.

Результаты оценки уровня гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных субстанцией вакцины ЭВК без адъюванта гидроокиси алюминия индивидуально или в сочетании с препаратом дсРНК, представлены в табл. 2. Иммунизация мышей субстанцией ЭВК в интервале от 0,25 до 2 человеческих доз (56,25–450 мкг белка на мышь) вызывала дозозависимую наработку специфических антител со среднегеометрическими титрами от 14 421 до 776 808. Совместное введение субстанции ЭВК и дсРНК приводило к увеличению интенсивности иммунного ответа. Наиболее высоким стимулирующий эффект дсРНК был в наименьшей из исследованных доз (50 мкг/мышь) при введении мышам, иммунизированным наименьшей дозой субстанции ЭВК (0,25 человеческой дозы/мышь).

 

Таблица 2. Показатели СГТ специфических антител к субстанции ЭВК в сыворотке крови мышей после двукратной иммунизации субстанцией ЭВК или совместно субстанцией ЭВК и дсРНК / Table 2. Аverage geometric titers of specific antibodies against EVC substance in the blood serum of mice after a two-time immunization with EVC substance, or EVC substance plus dsRNA

Доза ЭВК, мкг/мышь Dose of EVC, µg/mouse	СГТ после введения ЭВК AGT after administration of EVC	СГТ после введения ЭВК и дсРНК (мкг/мышь) AGT after administration of EVC and dsRNA (µg/mouse)
		50		100		200
		СГТ | AGT	N	СГТ | AGT	N	СГТ | AGT	N
56,25	14 421	7 540 406	523	6 192 898	429	6 641 096	461
112,5	73 294	4 933 246	67	3 142 056	43	6 402 895	87
225	238 110	3 455 211	15	6 052 490	25	7 768 081	33
450	776 808	4 817 368	6	3 236 631	4	7 802 453	10

 

Обсуждение

Эффективность вакцинного адъюванта в значительной степени зависит от типа вакцины, особенностей специфической иммунной реакции, которая формируется под её воздействием, и механизма действия самого адъюванта [23, 24]. Несмотря на то что любая иммунизация стимулирует развитие как гуморальной, так и клеточной иммунной реакции, существуют вакцины, которые воздействуют преимущественно на тот или иной тип иммунного ответа. И успех в выборе адъюванта в значительной степени определяется тем, способно ли данное вещество модулировать именно это критическое звено иммунитета.

В настоящее время получен значительный пул данных, описывающих особенности иммуномодулирующего действия дсРНК — как синтетических, так и природных [25]. Предпринимались неоднократные и вполне успешные попытки использования синтетической дсРНК Poly(I:C) и её производных для усиления иммуногенности разного типа вакцин [26, 27]. При этом мало что известно относительно адъювантных свойств дсРНК, полученных биотехнологическими методами [25].

Одной из моделей, которые в настоящее время используются для изучения адъювантных свойств препаратов, является модель специфической иммунной реакции, индуцированной введением антигена ОВА. W. Zhang и соавт. использовали эту модель для подтверждения усиления гуморального иммунного ответа под действием фукоидана, полученного из морских водорослей Macrocystis pyrifera [28]. Повышение специфического иммунного ответа животных на ОВА, сопоставимое с эффектом гидроокиси алюминия, при включении в состав иммунных композиций экзополисахаридов морских бактерий описано Т.А. Кузнецовой и соавт. [29]. Полученные результаты позволили авторам обеих публикаций сделать вывод о том, что исследованные препараты могут быть перспективными в качестве эффективных вакцинных адъювантов [28, 29].

Результаты нашего исследования подтверждают тот факт, что препарат дсРНК способен многократно усиливать гуморальный иммунный ответ на ОВА и, следовательно, может быть использован для снижения прививочной дозы пептидных вакцин, основным механизмом действия которых является стимуляция Th2-иммунного ответа.

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была разработана вакцина на основе пептидных антигенов для профилактики COVID-19 «ЭпиВакКорона», в которой использован классический адъювант гидроксид алюминия [19]. Известно, что данный адъювант, несмотря на его широкое распространение, имеет ряд существенных недостатков. К ним можно отнести, в частности, то, что гидроксид алюминия стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета и оказывает слабое воздействие на клеточный ответ, а также может вызывать развитие местной кожной реакции разной степени выраженности [23].

Для того чтобы выяснить возможность обеспечения высокой иммуногенности вакцины без побочных реакций за счёт использования в качестве адъюванта дсРНК, была использована мышиная модель, где вместо антигена ОВА использовали субстанцию (полупродукт) вакцины «ЭпиВакКорона». Исследование показало, что иммуногенные свойства субстанции ЭВК были выше по сравнению с иммуногенными свойствами ОВА, но как в том, так и другом случае наблюдался эффект усиления иммунного ответа под действием дсРНК. Общей закономерностью являлось также то, что в обоих случаях стимулирующий эффект был тем более выраженным, чем ниже была доза антигена. Аналогичные дозовые зависимости наблюдали авторы работ [30, 31], показавшие, что наиболее демонстративно иммуноадъювантное действие препаратов рекомбинантных цитокинов человека на интенсивность иммунного ответа при вакцинации в случае использования малых доз антигена. Меньшие дозы антигена, используемые в сочетании с адъювантами, вызывали иммунный ответ, сопоставимый с ответом на большие дозы антигена, вводимые без иммуноадъювантов. Важно подчеркнуть, что на основании этих данных можно заключить, что введение адъювантов, аналогичных дсРНК, позволит существенным образом снизить эффективную прививочную дозу вакцин.

Полученные данные являются основанием для заключения о том, что включение препарата дсРНК в состав вакцинных композиций либо сочетанное их использование позволит снизить эффективную дозу вакцин на основе белковых и пептидных антигенов, одним из основных механизмов действия которых является стимуляция гуморального звена иммунного ответа.

Заключение

Результаты проведённого исследования свидетельствуют о наличии у препарата дрожжевой дсРНК адъювантных свойств, что позволяет рассматривать данный препарат в качестве потенциального адъюванта при создании пептидных вакцин.

About the authors

Olga N. Kaplina

Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Author for correspondence.
Email: kaplina_on@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8624-4767

senior researcher, Department of biological studies

Russian Federation, Berdsk

Svetlana G. Gamaley

Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: gamaley_sg@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7441-333X

Head, Department of biological studies

Russian Federation, Berdsk

Olga S. Ivanova

Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ivanova_os@vector.nsc.ru

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department of development and pilot production of biologicals

Russian Federation, Berdsk

Elena D. Danilenko

Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: danilenko_ed@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5026-1602

Cand. Sci. (Biol.), director

Russian Federation, Berdsk

References

Supplementary files