Сравнительный анализ структуры и экспрессии регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae

Полный текст

Введение

Возбудителями холеры — особо опасной инфекционной болезни с диарейным синдромом — являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae, содержащие гены ctxАВ и tcpA-F, кодирующие основные факторы патогенности: соответственно, холерный токсин, вызывающий развитие профузной диареи, и токсин-корегулируемые пили адгезии, необходимые для первого этапа инфекционного процесса — прикрепления вибрионов к эпителиоцитам кишечника [1]. С 1961 г. продолжается седьмая пандемия холеры, вызванная типичными токсигенными штаммами V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара. Постоянно происходящие эволюционные преобразования El Tor вибрионов привели к появлению в 1990-х гг. генетически изменённых штаммов (геновариантов) V. cholerae О1 El Tor биовара с повышенной вирулентностью [2]. Геноварианты быстро вытеснили на эндемичной территории типичные штаммы и явились причиной ряда крупных вспышек холеры в разных странах [3–5]. Типичные штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара неоднократно завозились и на территорию России, а с 1993 г. все единичные случаи и вспышки холеры были вызваны геновариантами [6, 7].

Механизмы быстрого распространения геновариантов и замещения типичных штаммов до конца не установлены. В ряде работ показано, что геноварианты не только являются гипервирулентными, но и способны быстро адаптироваться при смене среды обитания [8–10]. Как известно, важная роль в повышении вирулентных и адаптационных свойств холерного вибриона принадлежит недавно обнаруженной системе секреции 6-го типа (Т6SS, от англ. Type 6 secretion system) [11]. Т6SS представляет собой контактзависимую макромолекулярную структуру, напоминающую шприц, с помощью которой грамотрицательные бактерии, включая V. cholerae, транслоцируют внутрь соседних клеток-мишеней токсичные белки-эффекторы. Холерный вибрион использует Т6SS для уничтожения прокариотических и эукариотических клеток: бактерий разных видов, макрофагов, фагоцитирующих амёб, инфузорий, нематод. Активная экспрессия белков-эффекторов повышает выживаемость V. cholerae как in vivo, так и in vitro и даёт ему возможность эффективно конкурировать с бактериями, составляющими микробиом кишечника человека, а также с постоянными обитателями открытых водоёмов при его нахождении в составе биоплёнки во внешней среде [12, 13].

Первые сведения о Т6SS V. cholerae получены при изучении штамма V52 O37 серогруппы, у которого данная система активна в лабораторных условиях [11]. В дальнейшем была исследована структура и функция генов Т6SS у некоторых типичных токсигенных штаммов (N16961, C6706, A1552) V. cholerae О1 El Tor биовара, холерных вибрионов О139 серогруппы, ряда нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара и вибрионов nonО1/nonО139 серогруппы. В то же время функционирование Т6SS у геновариантов V. cholerae О1 El Tor биовара изучено на единичных модельных штаммах [13–21].

Согласно данным литературы, гены, кодирующие белки Т6SS V. cholerae, входят в состав одного большого и нескольких дополнительных (Aux-1, Aux-2, Aux-3, Aux-4, Aux-5) кластеров, расположенных на первой и второй хромосомах V. cholerae [11, 15, 19, 21]. При этом токсигенные штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп содержат одинаковый набор — большой кластер и три дополнительных (Aux-1, Aux-2, Aux-3). У нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара и штаммов nonО1/nonО139 серогруппы состав и структура генов Т6SS являются вариабельными [19, 22].

На большом кластере находятся гены, кодирующие структурные компоненты Т6SS системы, а также ген vasH (VCA0117), ответственный за биосинтез регуляторного белка VasH, который непосредственно контролирует транскрипцию генов, кодирующих эффекторные белки, расположенные на дополнительных кластерах [11, 23]. В штаммах V. cholerae, лишённых гена vasH, Т6SS является неактивной [23, 24]. Учитывая важную роль белка VasH в функционировании Т6SS, цель нашей работы состояла в проведении сравнительного анализа структуры регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа и его экспрессии в токсигенных и нетоксигенных штаммах V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара.

Материалы и методы

Штаммы бактерий

В работе использовали 35 штаммов V. cholerae О1 серогруппы El Tor биовара: токсигенные типичные и геноварианты, содержащие гены ctxA и tcpA (генотип ctxA+tcpA+); нетоксигенные, не имеющие ген ctxA, но включающие ген tcpA (ctxA-tcpA+), и нетоксигенные, лишённые гена tcpA (ctxA–tcpA–). Штаммы выделены от больных и из внешней среды с 1970 по 2017 г. на территории России и Украины. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол № 16 от 21.02.2022). Штаммы хранились в лиофильно высушенном состоянии в «Государственной коллекции патогенных бактерий» (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов). Для работы бактерии выращивали на пластинах LB агара при 37^оС в течение 18–24 ч.

Анализ структуры гена vasH и аминокислотной последовательности белка VasH

Изучение структуры регуляторного гена vasH проводили путём сравнения нуклеотидных последовательностей полных геномов исследуемых штаммов, представленных в NCBI GenBank, с последовательностью референс-штамма V. cholerae N16961 О1 серогруппы El Tor биовара с использованием программ «UGENE v. 1.32» и «MEGA X» («Megasoftware»). Аминокислотную последовательность белка VasH устанавливали с применением freeware-программы «BioEdit v. 7.0.9.0» («BioEdit»).

Изучение экспрессии гена vasH

Для изучения экспрессии гена vasH штаммы выращивали 4 ч с аэрацией в LB-бульоне при 37^оС. Относительный уровень экспрессии гена vasH определяли методом 2^–ΔΔCt с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени [25]. Для выделения тотальной РНК применяли набор «SV Promega Total RNA Isolation System» («Promega»), для синтеза кДНК на матрице РНК — набор реагентов «Реверта-L» («АмплиСенс»). Для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени c интеркалирующим красителем использовали комплект реагентов «Thermo Scientific Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix» («Thermo Fisher Scientific») согласно инструкции производителя. Нормализацию полученных данных осуществляли относительно гена домашнего хозяйства recA (VC0543). Последовательности олигонуклеотидных праймеров к гену recA рассчитаны ранее [26], к гену vasH взяты из литературных источников [23]. В качестве штамма-калибратора, значение экспрессии целевого гена vasH которого было принято за единицу, был произвольно выбран штамм V. cholerae M818. Эксперимент проводили в 3 повторах.

Статистический анализ

Статистический анализ полученных экспериментальных данных осуществляли при помощи программ «Microsoft Excel» (стандартный пакет программ «Microsoft Office 2010») и «Statistica 6.0» («Statsoft») путём вычисления среднего арифметического, стандартной ошибки среднего арифметического и доверительного интервала. Достоверность различия между средними величинами оценивали при помощи критерия Стьюдента, различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Изучение структуры гена vasH

На первом этапе работы было проведено сравнительное исследование нуклеотидной последовательности гена vasH у токсигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара. Произвольно были выбраны 5 типичных штаммов (М1062, М888, М893, 818, М1011) и 13 геновариантов (М1270, М1275, М1293, Р17644, М1327, М1344, М1429, RND18826, Р-18899, L3226, 89, М1509, 3265/80), выделенных, соответственно, в 1970–1972 и 1993–2014 гг. В результате анализа установлено, что у всех взятых в исследование токсигенных штаммов структура гена vasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара (таблица).

Далее были изучены нетоксигенные штаммы V. cholerae, изолированные с 1981 по 2017 г. от больных, а также из открытых водоёмов при проведении мониторинговых исследований на холеру. Нетоксигенные штаммы включали две группы: изоляты первой содержали ген tcpА, кодирующий токсин-корегулируемые пили адгезии (ctxA–tcpА+), у второй данный ген отсутствовал (ctxA–tcpА–). Наличие и структура мобильных элементов с генами патогенности и эпидемичности в данных штаммах изучена ранее [27]. При анализе нетоксигенных штаммов установлено, что клинические и водные ctxA–tcpА+ изоляты, как и токсигенные штаммы, имели интактный ген vasH. Исключение составил штамм V. cholerae 866 (Ялта, 1996), у которого в начале гена в позиции 55 был делетирован нуклеотид (С) (таблица). У штаммов, не имеющих гены ctxA и tcpА, структура гена vasH была вариабельной, выявлено 6–18 единичных нуклеотидных замен. Несмотря на присутствие значительного количества однонуклеотидных полиморфизмов, они в большинстве были синонимичными. Несинонимичные замены выявлены у 4 штаммов (М1332, 433, 132, М1526). У штамма V. cholerae М1337 (Астрахань, 2000), кроме однонуклеотидных полиморфизмов, в позиции 1341–1352 обнаружена делеция 12 нуклеотидов (таблица).

 

Структура и относительный уровень экспрессии гена vasH в штаммах V. cholerae O1 El Tor биовара / Structure and relative level of expression of the vasH gene in strains of V. cholerae O1 El Tor biovar

№ No.	Штамм V. cholerae V. cholerae strain	Место; год; источник выделения штамма The site, year and source of isolation strains	Структура гена vasH* vasH* gene structure	Относительный уровень экспрессии гена vasH Relative level of vasH gene expression
Токсигенные типичные штаммы | Toxigenic typical strains
1.	М1062SSAB01	Россия, Астрахань; 1970; человек Russia, Astrakhan; 1970; patient	инт int	0,23 ± 0,015
2.	М888LRBH01			0,4 ± 0,02
3.	М893SSAA01			0,05 ± 0,001
4.	М818LAHM01	Россия, Балаково; 1970; человек Russia, Balakovo; 1970; patient	инт int	1,0**
5.	М1011SSAC01	Россия, Уфа; 1972; человек Russia, Ufa; 1972; patient	инт int	Не определяли Not identified
Токсигенные генетически изменённые штаммы | Toxigenic altered strains
6.	М1270VXCC01	Россия, Набережные Челны; 1993; человек Russia, Naberezhnye Chelny; 1993; patient	инт int	0,51 ± 0,02
7.	М1275LRAF01	Россия, Дагестан; 1993; человек Russia, Dagestan; 1993; patient	инт int	0,40 ± 0,025
8.	М1293JFFW01	Россия, Дагестан; 1994; человек Russia, Dagestan; 1994; patient	инт int	0,14 ± 0,015
9.	R17644JRTW01	Россия, Ачинск; 1997; человек Russia, Achinsk; 1997; patient	инт int	1,0 ± 0,04
10.	М1327LRFE01	Россия, Дагестан; 1998; человек Russia, Dagestan; 1998; patient	инт int	0,63 ± 0,01
11.	М1344NEDY01	Россия, Казань; 2001; человек Russia, Kazan; 2001; patient	инт int	0,34 ± 0,015
12.	М1429LAEM01	Россия, Белорецк; 2004; человек Russia, Beloretsk; 2004; patient	инт int	0,29 ± 0,025
13.	RND18826AYOM01	Россия, Тверь; 2005; человек Russia, Tver; 2005; patient	инт int	0,72 ± 0,015
14.	Р-18899LAKM01	Россия, Мурманск; 2006; человек Russia, Murmansk; 2006; patient	инт int	1,09 ± 0,035
15.	L3226JDVX01	Россия, Москва; 2010; человек Russia, Moscow; 2010; patient	инт int	0,07 ± 0,001
16.	89NDXR01	Украина, Ялта; 2010; внешняя среда Ukraine, Yalta; 2010; environmental sample	инт int	0,16 ± 0,015
17.	M1509NEDZ01	Россия, Москва; 2012; человек Russia, Moscow; 2012; patient	инт int	0,49 ± 0,02
18.	3265/80JRQL01	Россия, Москва; 2014; человек Russia, Moscow; 2014; patient	инт int	0,6 ± 0,03
Нетоксигенные ctxА–tcpА+ штаммы | Non-toxigenic ctxА–tcpА+ strains
19.	М1395LQBY01	Россия, Астрахань; 1981; внешняя среда Russia, Astrakhan; 1981; environmental sample	инт	2,13 ± 0,085
20.	56MWRD01	Украина, Мариуполь; 1995; внешняя среда Ukraine, Mariupol; 1995; environmental sample	инт int	0,88 ± 0,06
21.	866MWRF01	Украина, Ялта; 1996; внешняя среда Ukraine, Yalta; 1996; environmental sample	ΔС55	0,77 ± 0,005
22.	85NEDU01	Украина, Бердянск; 1999; человек Ukraine, Berdyansk; 1999; patient	инт int	0,30 ± 0,01
23.	Р18778NIFI01	Россия, Ростов; 2005; человек Russia, Rostov; 2005; patient	инт int	1,72 ± 0,03
24.	М1501LRAE01	Россия, Элиста; 2011; человек Russia, Elista; 2011; patient	инт int	1,75 ± 0,045
25.	М1518LQZR01	Россия, Элиста; 2012; внешняя среда Russia, Elista; 2012; environmental sample	инт int	0,64 ± 0,025
26.	М1524LQZS01	Россия, Элиста; 2013; внешняя среда Russia, Elista; 2013; environmental sample	инт int	Не определяли Not identified
27.	2613PYCA01	Россия, Элиста; 2015; внешняя среда Russia, Elista; 2015; environmental sample	инт int	0,50 ± 0,03
28.	124PYCD01	Россия, Элиста; 2017; человек Russia, Elista; 2017; patient	инт int	0,93 ± 0,01
Штаммы, не имеющие гены ctxА и tcpА | Strains lacking ctxА and tcpА genes
29.	М1332PYCE01	Россия, Челябинск; 2000; человек Russia, Chelyabinsk; 2000; patient	3/18	0,50 ± 0,005
30.	М1337NEEB01	Россия, Астрахань; 2000; человек Russia, Astrakhan; 2000; patient	0/8; Δ1341-1352	0,71 ± 0,045
31.	Р-18748NIFH01	Россия, Сочи; 2004; человек Russia, Sochi; 2004; patient	0/13	0,24 ± 0,005
32.	M1526VUAA01	Россия, Элиста; 2012; внешняя среда Russia, Elista; 2012; environmental sample	1/6	0,21 ± 0,025
33.	132VUAC01	Россия, Элиста; 2013; внешняя среда Russia, Elista; 2013; environmental sample	1/9	0,36 ± 0,035
34.	433NEDW01	Россия, Сочи; 2015; внешняя среда Russia, Sochi; 2015; environmental sample	3/18	Не определяли Not identified
35.	3178PYCH01	Россия, Элиста; 2017; внешняя среда Russia, Elista; 2017; environmental sample	0/8	0,07 ± 0,001

Примечание. В надстрочном индексе штаммов указан сокращённый код доступа в GenBank; инт — нуклеотидная последовательность идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара; * — цифры через черту (/) показывают количество несинонимичных замен/общее количество замен; ** — штамм-калибратор.

Note. In the superscript, the GenBank accession number is specified; int — nucleotide sequence is identical to the reference strain of V. cholerae N16961 O1, biovar El Tor; * — numbers separated with a slash (/) show the ratio of non-synonymous substitutions to total number of substitutions; ** — calibrator strain.

 

Аминокислотная последовательность белка VasH

Согласно данным литературы, белок VasH включает 530 аминокислот и функционально разделён на три участка: N-терминальный регуляторный (1–187), воспринимающий сигналы внешней среды; центральный (193–414) и С-терминальный (485–525) с ДНК-связывающим НТН (496–512) доменом. Белок VasH активен только при взаимодействии с альтернативной σ⁵⁴ субъединицей (белок RpoN), связывание с которой происходит в центральном домене, где расположены Walker A (220–229) и Walker B (286–296) мотивы. Мутанты с делетированными НТН или Walker доменами синтезируют функционально неактивный белок VasH [11, 23, 24].

Изучение последовательности аминокислот в VasH белке у взятых в анализ штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара показало, что у всех токсигенных изолятов она идентична референс-штамму (таблица). У нетоксигенных ctxA–tcpA+ штаммов, за исключением V. cholerae 866, последовательность аминокислот в VasH также была идентична референсному. Делеция одного нуклеотида в начале гена в штамме 866 привела к изменению всей аминокислотной последовательности белка (рисунок). Вполне вероятно, что синтезируемый данным штаммом белок-регулятор VasH будет функционально неактивным.

 

Фрагменты аминокислотной последовательности белка VasH некоторых штаммов V. cholerae. ref — референс-штамм V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. Жирным шрифтом выделены изменённые участки. / Fragments of the amino acid sequence of VasH protein of some Vibrio cholerae strains. ref — reference strain V. cholerae N16961 O1, El Tor biovar. Altered regions are highlighted in bold.

 

У штаммов Р-18748 и 3178, имеющих только синонимичные замены, аминокислотная последовательность VasH белка идентична референсному. В штамме М1337 в результате делеции большого участка гена значительно изменена карбоксильная область белка, затронувшая и НТН домен (рисунок). Подобные изменения приводят к биосинтезу белка, не способного взаимодействовать с генами-мишенями [23].

Несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы в штаммах V. cholerae M1526, 132, М1332 и 433 вызвали замены аминокислот в различных участках белковой молекулы VasH. В штамме М1526 в регуляторной аминотерминальной области вместо аспарагиновой кислоты включён гистидин (H116D). У штамма V. cholerae 132 в линкерной области между Walker A и Walker B доменами выявлен лизин (A267L). В штаммах М1332 и 433 в начале регуляторного N участка присутствует изолейцин (I14V), а не валин, как у референсного, а в линкерной области между σ⁵⁴-связывающим и НТН доменами произошла смена аминокислот S447P и V449A. Однако, по данным литературы, указанные замены не влияют на функциональные свойства белка VasH [23].

Уровень экспрессии гена vasH

Заключительный этап работы был посвящён определению у взятых в анализ штаммов относительного уровня экспрессии гена vasH. В результате значительные отличия между типичными штаммами V. cholerae О1 El Tor биовара и геновариантами по экспрессии данного гена не выявлены. У типичных штаммов среднее значение относительного уровня экспрессии гена vasH составило 0,42, у геновариантов — 0,5 (таблица). У изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA, экспрессия vasH также была невысокой (среднее значение 0,35). В то же время выявлено статистически достоверное (p < 0,05) различие в уровне экспрессии vasH у штаммов с генотипом ctxA–tcpA+. Они отличались повышенным уровнем экспрессии данного гена (среднее значение 1,07). Среди штаммов данной группы выявлены три (М1395, Р18778, М1501), которые имели наиболее высокий уровень экспрессии гена vasH по сравнению с другими взятыми в работу штаммами (выделены жирным шрифтом в таблице).

Обсуждение

В ранее проведённой работе при сравнительном протеомном масс-спектрометрическом сканировании бактериальных лизатов клеток типичного штамма V. cholerae М1062 О1 El Tor биовара и геноварианта М1509, выращенных в LB-бульоне при 37^оС, у последнего было обнаружено присутствие 2 белков Т6SS [28]. Отсутствие биосинтеза белков Т6SS в лабораторных условиях у типичного токсигенного штамма согласуется с данными литературы. У указанных штаммов Т6SS активна только in vivo или при культивировании в определённых условиях — повышенная осмолярность среды с содержанием 300 мМ NaCl, сниженная до 26^оС температура [17]. Обнаружение экспрессии белков Т6SS у геноварианта позволило высказать предположение, что у данных штаммов изменился механизм регуляции Т6SS и она стала активной при культивировании штаммов в лабораторных условиях. Проверку данной гипотезы мы начали с изучения структуры и экспрессии глобального регуляторного гена vasH. В результате установлено, что у всех изученных типичных штаммов и геновариантов V. cholerae О1 El Tor биовара нуклеотидная последовательность гена vasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. Отличия между ними по экспрессии указанного гена также не выявлены (таблица). Видимо, указанные штаммы различаются по экспрессии других генов Т6SS, но для проверки данного предположения необходимы дальнейшие исследования.

Кроме завезённых токсигенных штаммов, в работе были использованы штаммы V. cholerae О1 El Tor биовара, не имеющие гены ctxA и tcpA (таблица). Важность исследования данных штаммов заключается в том, что при попадании в организм человека они не способны вызвать холеру, но могут быть причиной острых кишечных инфекций. Нетоксигенные штаммы ежегодно выделяются из водных объектов нашей страны при мониторинговых исследованиях. При этом механизмы их длительного сохранения во внешней среде до конца не изучены. Из литературных источников известно, что водные штаммы V. cholerae являются гетерогенной группой по составу и структуре генов Т6SS [19, 22], которые активно экспрессируются в данных штаммах, что повышает их выживаемость во внешней среде [16, 29].

Проведённые нами исследования показали, что вариабельным ген vasH был только у штаммов, не содержащих гены ctxA и tcpA; 90% взятых в анализ ctxA–tcpA+ штаммов, подобно токсигенным, имели интактную последовательность гена vasH (таблица). При изучении экспрессии гена vasH с использованием ОТ-ПЦР в режиме реального времени выявлено, что относительный уровень экспрессии данного гена у ctxA–tcpA+ штаммов в среднем в 3,1 раза выше, чем у изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA, а также в 2,6 и 2,14 раза больше, соответственно, чем у типичных штаммов и геновариантов. Именно среди ctxA–tcpA+ штаммов выявлены 3 изолята (М1395, Р18778, М1501), экспрессия vasH у которых была наибольшей (таблица). Для установления причины повышенной экспрессии vasH в ctxA–tcpA+ штаммах нами был проведён анализ структуры гена rpoS (VC0534), кодирующего биосинтез σ⁵⁴-РНК полимеразы, необходимой для активации транскрипции vasH [23, 24]. Однако полученные сведения не позволили решить указанную проблему (данные не приводятся). Возможно, увеличение транскрипции vasH у ctxA–tcpA+ штаммов может быть обусловлено изменениями в экспрессии гена rpoS или структуре и экспрессии негативных регуляторов luxO (VC1021) и tsrA (VC0070), блокирующих транскрипцию vasH [13, 15]. Планируется продолжение данных исследований.

Заключение

При сравнительном анализе токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара, изолированных на территории России и Украины с 1970 по 2017 г., подтверждены данные зарубежных исследователей о наличии интактного гена vasH у токсигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor биовара и вариабельного у штаммов, не содержащих гены ctxA и tcpA. В то же время в данной работе показано, что изученные нетоксигенные ctxA–tcpA+ изоляты, как и токсигенные штаммы, имеют интактный ген vasH. Транскрипционная активность гена vasH выявлена у всех взятых в анализ штаммов, а наибольший уровень экспрессии данного гена отмечен у ctxA–tcpA+ штаммов. Необходимо отметить, что среди изученных 35 штаммов обнаружено только два нетоксигенных изолята (866, М1337 — 5,7%), предположительно синтезирующих функционально неактивный белок VasH, что ещё раз указывает на важную роль данного регулятора в биологии V. cholerae.

Об авторах

Светлана Петровна Заднова

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автор, ответственный за переписку.
Email: svetlanazadnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4366-0562

д.б.н., в.н.с. лаб. патогенных вибрионов

Россия, Саратов

Никита Александрович Плеханов

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: svetlanazadnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2355-7018

к.б.н., с.н.с. лаб. патогенных вибрионов

Россия, Саратов

Алина Юрьевна Спирина

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: svetlanazadnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9779-166X

м.н.с. лаб. патогенных вибрионов

Россия, Саратов

Андрей Александрович Kрицкий

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Email: svetlanazadnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5506-4285

к.б.н., зав. лаб. патогенных вибрионов

Россия, Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы