Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology118910.36233/0372-9311-255ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleComparative analysis of the structure and expression of the vasH regulatory gene of type VI secretion system in toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae strainsСравнительный анализ структуры и экспрессии регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio choleraehttps://orcid.org/0000-0003-4366-0562ZadnovaSvetlana P.ЗадноваСветлана Петровна
Russian Federation

D. Sci. (Biol), leading researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

д.б.н., в.н.с. лаб. патогенных вибрионов

svetlanazadnova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2355-7018PlekhanovNikita A.ПлехановНикита Александрович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

к.б.н., с.н.с. лаб. патогенных вибрионов

svetlanazadnova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9779-166XSpirinaAlina Yu.СпиринаАлина Юрьевна
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

м.н.с. лаб. патогенных вибрионов

svetlanazadnova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5506-4285KritskiyAndrey A.KрицкийАндрей Александрович
Russian Federation

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of pathogenic vibrios

к.б.н., зав. лаб. патогенных вибрионов

svetlanazadnova@mail.ruRussian Research Anti-Plague Institute “Microbe”Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»1512202299668269114032022Copyright ©; 2022, Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Spirina A.Y., Kritskiy A.A.Copyright ©; 2022, Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Kрицкий А.А.2022Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Spirina A.Y., Kritskiy A.A.Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Kрицкий А.А.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1189

Objective. The comparative analysis of the structure of the regulatory gene vasH of the type VI secretion system and its expression in toxigenic and non-toxigenic V. cholerae O1, biovar El Tor strains.

Materials and methods. We used 35 strains isolated from patients and from the environmental samples in the territory of Russia and Ukraine between 1970 and 2017. Analysis of the structure of the vasH gene and the amino acid sequence of the protein was carried out using Ugene 1.32, Mega X, and Bioedit v. 7.0.9.0. The relative level of vasH expression was studied by 2–ΔΔCt.

Results. The The structure of the vasH gene and the amino acid sequence of VasH protein in toxigenic typical strains and genovariants of V. cholerae O1, El Tor biovar (genotype ctxA+tcpA+) have been shown to be identical to the reference V. cholerae n16961 O1, El Tor biovar strain. The vasH sequence is variable in isolates lacking ctxA and tcpA genes (ctxA–tcpA–), and does not differ from the reference in ctxA–tcpA+ (with the exception of one strain). The studied toxigenic typical strains and the genovariants have a similar relative level of expression of the vasH gene. In isolates that do not contain the ctxA and tcpA genes, the expression of this gene is comparable to toxigenic strains, and is 3.1 times higher in ctxA–tcpA+ strains than that of ctxA–tcpA– and 2.14–2.6 times higher than that of toxigenic ones.

Conclusion. The analysis of toxigenic and non-toxigenic V. cholerae O1, biovar El Tor strains isolated in Russia and Ukraine in different periods of the current cholera pandemic confirmed the data of foreign researchers on vasH gene being intact in toxigenic isolates and variable in isolates lacking ctxA and tcpA genes. Meanwhile, the structure of vasH gene has been shown to be identical to that of toxigenic ones in 99% of the studied ctxA–tcpA+ strains. The expression of the vasH gene has been detected in all studied strains, being the highest in ctxA–TtcpA+ strains. Only two non-toxigenic strains presumably synthesizing the functionally inactive VasH protein have been identified.

Цель работы — сравнительный анализ структуры регуляторного гена vasH системы секреции 6-го типа и его экспрессии в токсигенных и нетоксигенных штаммах Vibriо cholerae О1 серогруппы El Tor биовара.

Материалы и методы. В работе использовали 35 штаммов, выделенных от больных и из внешней среды с 1970 по 2017 г. на территории России и Украины. Анализ структуры гена vasH и аминокислотной последовательности белка проводили с применением программ UGENE 1.32, MEGA X, BioEdit v. 7.0.9.0. Относительный уровень экспрессии vasH изучали методом 2–ΔΔCt.

Результаты. Установлено, что у токсигенных типичных штаммов и геновариантов V. cholerae О1 El Tor биовара (генотип ctxA+tcpA+) структура гена vasH и аминокислотная последовательность белка VasH идентична референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor биовара. У изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA (ctxA–tcpA–), последовательность vasH является вариабельной, у ctxA–tcpА+ (за исключением одного штамма) — не отличается от референсного. Изученные токсигенные типичные штаммы и геноварианты имеют схожий относительный уровень экспрессии гена vasH. У изолятов, не содержащих гены ctxA и tcpA, экспрессия данного гена сопоставима с токсигенными, а у ctxA–tcpА+ штаммов в среднем в 3,1 раза выше, чем у ctxA–tcpA–, и в 2,14–2,60 раза больше, чем у токсигенных.

Заключение. На модели токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Тor биовара, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры на территории России и Украины, подтверждены данные зарубежных исследователей о наличии интактного гена vasH у токсигенных и вариабельного у изолятов, не имеющих гены ctxA и tcpA. В то же время показано, что у 99% изученных ctxA–tcpA+ штаммов структура vasH идентична токсигенным. Экспрессия гена vasH обнаружена у всех изученных штаммов, при этом наибольшей она была у ctxA–tcpА+. Выявлено всего два нетоксигенных штамма, предположительно синтезирующих функционально неактивный белок VasH.

Vibrio choleraetype VI secretion systemstructure and expression of vasH regulatory geneVibrio choleraeсистема секреции 6-го типаструктура и экспрессия регуляторного гена vasHФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, 410005, Саратов, РоссияKaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1): 48–89. https://doi.org/10.1128/CMR.8.1.48.Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9): 3296–9. https://doi.org/10.1128/jcm.40.9.3296-3299.2002Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P., Charles R.C., Jean-Charles R.R., et al. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2011; 364(1): 33–42. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1012928Bundi M., Shah M.M., Odoyo E., Kathiiko C., Wandera E., Miring’u G., et al. Characterization of Vibrio cholerae O1 isolates responsible for cholera outbreaks in Kenya between 1975 and 2017. Microbiol. Immunol. 2019; 63(9): 350–8. https://doi.org/10.1111/1348-0421.12731Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Naji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016-2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230–3. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Naji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016–2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230–3. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor isolated in Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2011; 26(3): 102–10. https://doi.org/10.3103/S0891416811030062Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 26(3): 11–8.Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Ya., Polovinkina V.S., Kozhevnikova A.S., Kulikalova E.S., et al. Detection of "hybrid" Vibrio cholerae El Tor strains during epidemic complications in Siberia and Far East. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 88(5): 12–8. (in Russian)Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Половинкина В.С., Кожевникова А.С., Куликалова Е.С. и др. Обнаружение «гибридных» штаммов Vibrio cholerae eltor при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 88(5): 12–8.Zadnova S.P., Kul'shan' T.A., Cheldyshova N.B., Kritskiy A.A., Plekhanov N.A., Smirnova N.I. Comparative analysis of survival capacity among typical and genovariant strains of Vibrio cholerae, biovar El Tor in vivo and in vitro. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2015; (4): 65–9. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2015-4-65-69 (in Russian)Заднова С.П., Кульшань Т.А., Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ выживаемости типичных штаммов и геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор in vitro и in vivo. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; (4): 65–9. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2015-4-65-69Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(11): 3739–49. https://doi.org/10.1128/JCM.01286-11Satchell K.J.F., Jones C.J., Wong J., Queen J., Agarwal S., Yildiz F.H. Phenotypic analysis reveals that the 2010 Haiti cholera epidemic is linked to a hypervirulent strain. Infect. Immun. 2016; 84(9): 2473–81. https://doi.org/10.1128/IAI.00189-16Pukatzki S., Ma A.T., Sturtevant D., Krastins B., Sarracino D., Nelson W.C., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006; 103(5): 1528–33. https://doi.org/10.1073/pnas.0510322103Ma A.T., McAuley S., Pukatzki S., Mekalanos J.J. Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells. Cell. Host. Microbe. 2009; 5(3): 234–43. https://doi.org/10.1016/j.chom.2009.02.005Joshi A., Kostiuk B., Rogers A., Teschler J., Pukatzki S., Yildiz F.H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends. Microbiol. 2017; 25(4): 267–79. https://doi.org/10.1016/j.tim.2016.12.003Monakhova E.V., Bozhko N.V. Study of the expression of contact-dependent secretion systems by cholera vibrios on a model Dictyostelium discoideum. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2010; 87(4): 89–92. (in Russian)Монахова Е.В., Божко Н.В. Изучение экспрессии контакт-зависимых систем секреции холерными вибрионами на модели Dictyostelium discoideum. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 87(4): 89–92.Zheng J., Shin O.S., Cameron D.E., Mekalanos J.J. Quorum sensing and a global regulator TsrA control expression of type VI secretion and virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2010; 107(49): 21128–33. https://doi.org/10.1073/pnas.1014998107Miyata S.T., Kitaoka M., Wieteska L., Frech C., Chen N., Pukatzki S. The Vibrio cholerae type VI secretion system: evaluating its role in the human disease cholera. Front. Microbiol. 2010; 1: 117. https://doi.org/10.3389/fmicb.2010.00117Ishikawa T., Sabharwal D., Bröms J., Milton D.L., Sjöstedt A., Uhlin B.E., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infect. Immun. 2012; 80(2): 575–84. https://doi.org/10.1128/IAI.05510-11Miyata S.T., Unterweger D., Rudko S.P., Pukatzki S. Dual expression profile of type VI secretion system immunity genes protects pandemic Vibrio cholerae. PLoS Pathog. 2013; 9(12): e1003752. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003752Unterweger D., Miyata S.T., Bachmann V., Brooks T.M., Mullins T., Kostiuk B., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system employs diverse effector modules for intraspecific competition. Nat. Commun. 2014; 5: 3549. https://doi.org/10.1038/ncomms4549Townsley L., Mangus M.P.S., Mehic S., Yildiz F.H. Response of Vibrio cholerae to low temperature shifts: CspV regulation of type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(14): 4441–52. http://dx.doi.org/10.1128/AEM.00807-16.Crisan C.V., Chande A.T., Williams K., Raghuram V., Rishishwar L., Steinbach G., et al. Analysis of Vibrio cholerae genomes identifies new type VI secretion system gene clusters. Gen. Biol. 2019; 20(1): 163. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1765-5Santoriello F.J., Michel L., Unterweger D., Pukatzki S. Pandemic Vibrio cholerae shuts down site-specific recombination to retain an interbacterial defence mechanism. Nat. Commun. 2020; 11(1): 6246. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20012-7Kitaoka M., Miyata S.T., Brooks T.M., Unterweger D., Pukatzki S. VasH is a transcriptional regulator of the type VI secretion system functional in endemic and pandemic Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2011; 193(23): 6471–82. https://doi.org/10.1128/JB.05414-11Seibt H., Aung K.M., Ishikawa T., Sjöström A., Gullberg M., Atkinson G.C., et al. Elevated levels of VCA0117 (VasH) in response to external signals activate the type VI secretion system of Vibrio cholerae O1 El Tor A1552. Environ. Microbiol. 2020; 22(10): 4409–23. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15141Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods. 2001; 25(4): 402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. METHODS. 2001; 25(4): 402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262Kritskiy A.A., Cheldyshova N.B., Tuchkov I.V., Smirnova N.I. Development of the algorithm for identification of the level of Vibrio cholerae ctxA and toxR gene expression using RT-PCR with Real-Time hybridization-fluorescent registration of results. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2017; (3): 53–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57 (in Russian)Крицкий А.А., Челдышова Н.Б., Тучков И.В., Смирнова Н.И. Разработка алгоритма определения уровня экспрессии генов ctxA и toxR Vibrio cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (3): 53–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-53-57Smirnova N.I., Agafonova E.Yu., Shchelkanova E.Yu., Agafonov D.A., Krasnov Ya.M., Livanova L.F., et al. Genomic diversity of nontoxigenic Vibrio cholerae O1 strains isolated in the territory of Russia and neighboring states. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2018; 36(2): 97–109. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84 (in Russian)Смирнова Н.И., Агафонова Е.Ю., Щелканова Е.Ю., Агафонов Д.А., Краснов Я.М., Ливанова Л.Ф. и др. Геномное разнообразие нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1, выделенных на территории России и сопредельных стран. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(2): 76–84. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84Zadnova S.P., Badanin D.V., Plekhanov N.A., Polunina T.A., Kotova N.V., Kritskiy A.A., et al. Comparative proteomic profiles of typical strain and genetically altered variant of Vibrio cholerae O1, biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2020; (3): 150–3. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-150-153 (in Russian)Заднова С.П., Баданин Д.В., Плеханов Н.А., Полунина Т.А., Котова Н.В., Крицкий А.А. и др. Сравнительные протеомные профили типичного штамма и генетически измененного варианта Vibrio cholerae О1 серогруппы биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (3): 150–3. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-150-153Bernardy E.E., Turnsek M.A., Wilson S.K., Tarr C.L., Hammer B.K. Diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae in natural transformation and contact-dependent bacterial killing indicative of type VI secretion system activity. Appl. Environ. Microbiol. 2016; 82(9): 2833–42. https://doi.org/10.1128/AEM.00351-16