Subsets of T regulatory cells in patients with IgE-mediated allergy

Full Text

Введение

Патофизиологические механизмы развития аллергических болезней включают комплексную последовательность иммунологических событий, которые вызывают ответ со стороны клеток в таргетных органах и приводят к развитию воспаления, ремоделированию тканей и нарушению их функций.

Формирование и сохранение толерантности к аллергенам является отличительной чертой иммунного ответа у здоровых людей без атопии, и постулируется, что важнейший компонент этой иммунной «неотвечаемости» образование функциональных аллерген-специфических Т-регуляторных клеток (Treg). Три основные субпопуляции аллерген-специфических Т-клеток (Thl, Th2 и Tregs) в различных пропорциях содержатся в организме и у здоровых людей, и у страдающих аллергией. Этот факт обосновывает предположение, что изменение баланса между аллерген-специфическими Тh2и Treg-клетками может быть основной причиной как развития толерантности к аллергенам, так и проявления аллергической сенсибилизации [1].

По своему видовому составу и структуре Treg-клетки представляют одну из самых сложных Т-клеточных групп. Их гетерогенность, которая проявляется в особенностях фенотипа, условиях индуцирования и механизмах супрессии, до конца не изучена.

На сегодняшний день CD4 Treg-клетки можно разделить на две основные субпопуляции: естественные Treg, происходящие из тимуса, и индуцибельные Treg, которые образуются вне тимуса после антигенной стимуляции.

Естественные Treg можно разделить на следующие субпопуляции: наивные Treg (nTreg), эффекторные Treg (Treg eff) и Treg-клетки памяти (Treg m).

В свою очередь индуцибельные Treg (iTreg) подразделяются на: FOXP3+ Т-клетки, индуцированные на периферии; регуляторные Т-клетки типа 1 (Tr1), продуцирующие IL-10, с основным фенотипом CD4+CD25+FOXP3^-; и Th3-клетки, продуцирующие в основном TGF-β [2].

Согласно последним данным, некоторые субпопуляции T-регуляторных клеток, а именно Тh17/Т-регуляторные клетки (Thl7/Treg), развиваются из периферических индуцированных CD4+FOXP3+ Tregs. Доказано, что у человека эта субпопуляция обладает супрессивной активностью, которая, однако, слабее таковой у индуцированных Treg-клеток. С другой стороны, кроме регуляторных функций, эти клетки обладают способностью к продукции IL-17a, т.е. Thl7/Treg обладают фенотипическими характеристиками и Тh17-, и Treg-клеток и способствуют развитию аллергических заболеваний [3].

В этой связи целью данного исследования стало определение фенотипа и количества различных Т-регуляторных клеток у пациентов с клинически выявленной IgEобусловленной аллергией, а также установление возможных различий в величине циркулирующих Т-регуляторных субпопуляций у пациентов по сравнению со здоровыми людьми без атопии.

Материалы и методы

Группы исследования. В исследование были включены 20 пациентов с клинически выявленной ингаляционной IgE-обусловленной аллергией (сезонный и круглогодичный аллергический ринит) и 10 здоровых людей без аллергических проявлений на ингаляционные аллергены (контрольная группа). Дизайн исследования был одобрен Комиссией по этике НЦЗПБ (София, Болгария).

Группа больных с аллергией состояла из 13 мужчин и 7 женщин в возрасте от 19 до 58 лет с основным диагнозом «аллергический ринит», а контрольная группа состояла из 6 мужчин и 4 женщин в возрасте от 26 до 59 лет.

Тяжесть аллергических симптомов оценивали путём подсчёта общего симптомокомплекса, который включает цифровую оценку жалоб на ринорею, чихание, назальную конгестию и зуд в носу и глазах.

Наличие сенсибилизации. Для доказательства специфической сенсибилизации пациентам и участникам контрольной группы проводили кожное тестирование (приктест) набором ингаляционных аллергенов «Бул Био НЦЗПБ ЕООД» (домашняя пыль, D. pteronyssinus, Alternaria alternata, кошка, пыльца деревьев и луговых трав). Пробы учитывали через 20 мин, при этом кожные реакции считали положительными при диаметре папулы и эритемы > 3 мм.

Проточная цитометрия. С помощью стандартной 8-параметрической проточной цитометрии (BD FACSCanto II) клеток крови у всех обследованных определяли процентное соотношение и абсолютное число субпопуляций CD4 Т-регуляторных клеток (табл. 1).

 

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ выполняли с использованием программы Prism версия 5 (GraphPad Software Inc, США). Сравнивали долю и абсолютное число исследованных Т-регуляторных субпопуляций пациентов обеих групп посредством двустороннего непарного T-теста. Разницу считали статистически значимой при р < 0,05.

 

Результаты

Клиническая характеристика участников исследования. В среднем общая оценка аллергических симптомов со стороны верхних дыхательных путей у пациентов соста

вила 10,5 ± 3,92 балла из 20. Посредством кожно-аллергических проб было установлено, что 10 (50%) пациентов сенсибилизированы к пыльце злаковых трав; 6 (30%) к бытовым аллергенам (домашняя пыль, микроклещи и/или кошка); 4 (20%) к плесени (Alternaria alternata).

В среднем общая оценка аллергических симптомов со стороны верхних дыхательных путей у индивидов контрольной группы составляла 0 баллов. Кожно-аллергические пробы с использованием ингаляционных аллергенов не выявили сенсибилизацию у лиц контрольной группы.

Подробная информация о пациентах и здоровых лицах из контрольной группы представлена в табл. 2.

 

Определение субпопуляций Т-регуляторных клеток. Данные сравнительного анализа исследованных субпопуляций Тreg-клеток у пациентов с клинически выявленной IgE-обусловленной аллергией и у здоровых людей представлены в табл. 3.

 

Определение доли и абсолютного числа FOXP3+CD4+ Treg посредством проточной цитометрии позволило установить, что их статистически значимо меньше у пациентов с ингаляционной аллергией, чем у людей без атопии: в среднем 0,6% против 3,3%, p < 0,05; и 8,7 против 55 клеток/µ1,р<0,001 (рис. 1). Эта разница была обусловлена в основном субпопуляцией Treg m с фенотипом CD4+CD45+ FOX3^low RO+. У пациентов они в среднем составили 29,8% из всех CD4+ Treg, в то время как в контрольной группе 52,5%,р < 0,05.

 

 

При анализе субпопуляций Treg-клеток, индуцированных на периферии у пациентов с аллергией к атопическим аллергенам, наблюдается значительное снижение числа и относительной доли Tr1-клеток: 0,26% против 1,1% среди представителей контрольной группы (р < 0,05) (рис. 2).

 

 

У пациентов с ингаляционной аллергией субпопуляция Thl7/Treg-клеток тоже была значительно уменьшена: в среднем 7,7% против 28,4% у здоровых людей, р < 0,01 (рис. 3).

 

 

Обсуждение

При аллергии в организме развивается ряд патологических иммунных реакций в ответ на воздействие со стороны аллергенов окружающей среды. У пациентов формируется в основном Тh2-иммунный ответ, который стимулирует В-клетки к продукции IgE-антител. На данный момент достаточно данных, свидетельствующих о том, что Т-регуляторные клетки могут повлиять на Тh2-ответ in vitro. Однако исследование иммунного ответа на аллергены у здоровых индивидов показывает, что у них существует такой же периферийный Т-клеточный репертуар, который выявляет идентичные Тклеточные эпитопы, как и у пациентов с аллергией [4].

Имеются предварительные данные о том, что у индивидов без атопии число Т-регуляторных клеток с возрастом увеличивается, а у пациентов с IgE-обусловленной аллергией субпопуляции естественных Т-регуляторных клеток уменьшаются по сравнению со здоровыми людьми [5, 6].

Полученные нами результаты также показывают, что у пациентов с атопией налицо статистически значимое уменьшение числа естественных Т-регуляторных клеток, в основном в субпопуляции Treg-клеток памяти. Это, несомненно, вызывает нарушение иммунного гомеостаза у людей с атопией и может привести к развитию сверхчувствительности к разнообразным аллергенам в окружающей среде.

С другой стороны, индукция и образование периферийной иммунной толерантности имеет существенное значение для поддержания стабильности иммунной системы.

В течение последних 20 лет особое внимание в исследованиях уделяется индуцированной на периферии субпопуляции Treg-клеток. По сравнению с естественными CD4+CD25+ Treg-клетками Тг1-клетки обычно не экспрессируют CD25 или FOXP3. Доказано, что Тr1-клетки индуцируются путём продолжительной активации CD4 Т-клеток аллергеном в присутствии IL-10. Они отличаются и по своему уникальному цитокиновому профилю, охарактеризованному как IL-10+TGFβ+IFNγ+IL-5"IL-4"IL-2^low/neg. Считается, что Тг1 составляют основную субпопуляцию индуцибельных, периферических Т-регуляторных клеток, которая имеет отношение к формированию иммунных ответов при аллергии, так как они продуцируют большие количества IL-10 и TGF-β [7].

В отличие от естественных Treg-клеток, которые управляют регуляторными иммунными функциями во всём теле и вносят свой вклад в поддержание иммунного гомеостаза, Тr1-клетки регулируют локальную иммунную микросреду, в которой существуют специфические антигены. Благодаря своим иммуносупрессивным свойствам Тr1-клетки обеспечивают поддержание периферической иммунной толерантности и подавляют развитие аллергических и аутоиммунных заболеваний [8]. У здоровых людей аллерген-специфические Тг1 составляют доминирующую Т-клеточную субпопуляцию, которая подавляет аллергические ответы на различные аллергены в окружающей среде [9].

Более того, наблюдаемое нами статистически значимое уменьшение субпопуляции именно Тr1-клеток у пациентов с клинически проявленной ингаляционной аллергией является ещё одним подтверждением гипотезы о том, что аллергические заболевания возникают прежде всего вследствие нарушения периферической иммунной толерантности, поддерживаемой Тr1-клетками.

Thl7/Treg-клетки представляют относительно малую популяцию на периферии здоровых индивидов: от 4 до 8% от общего числа CD4+CD25+ Tregs. Поскольку они экспрессируют на своей поверхности CCR6 (CD 196) и CCR4 (CD 194), считается, что эти клетки лучше представлены в тканях, чем в периферической крови. Хотя эти клетки проявляют антагонистические функции и Т-регуляторных, и Thl7 эффекторных клеток, считается, что данная субпопуляция играет важную роль в контроле патогенеза ряда аутоимунных заболеваний. Роль этих клеток в развитии аллергических заболеваний не изучена детально. В одном исследовании сообщалось, что по сравнению со здоровыми людьми у пациентов с аллергическим ринитом повышено число Th2, ТЫ7 и IL-Па-продуцирующих Treg и налицо сравнимое число Th1и Treg-клеток [10].

Наше исследование показало, что в периферической крови пациентов с аллергическим ринитом число Thl7/Treg-клеток с фенотипом CD4+CD25^hi  FOXP3+CD127^- CD196+CD39+ статистически значимо снижено по сравнению со здоровыми индивидами. Данный факт требует более детального исследования и объяснения.

Заключение

Полученные нами результаты показывают, что у пациентов с IgE-обусловленной аллергией статистически значимо меньшие число и относительная доля основных субпопуляций Т-регуляторных клеток по сравнению со здоровыми людьми. Уменьшение числа естественных Т-регуляторных клеток, в частности Treg-клеток памяти, а также индуцированных на периферии Тг1и Thl7/Treg-клеток, приводит к нарушению механизма периферической Т-клеточной толерантности, вследствие чего происходит чрезмерная активация Th2-клеток.

Следовательно, дисрегуляция иммунной системы и потеря периферической толерантности лежат в основе развития ряда широко распространённых аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит, астма и др.

Таким образом, определение числа и доли различных субпопуляций Т-регуляторных клеток посредством проточной цитометрии можно эффективно использовать для комплексной клинико-иммунологической оценки состояния каждого пациента с IgE-обусловленной ингаляционной аллергией, в том числе в процессе специфической иммунотерапии.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

G. S. Nikolov

National Center of Infectious and Parasitsic Diseases

Author for correspondence.
Email: labalerg@ncipd.org
ORCID iD: 0000-0003-2949-7834
Georgi S. Nikolov, MD PhD, Department «Immunology», Sofia, 1504, Bulgaria Болгария

Y. D. Todorova

National Center of Infectious and Parasitsic Diseases

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4708-6887
Sofia, 1504, Bulgaria Болгария

M. H. Nikolova

National Center of Infectious and Parasitsic Diseases

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8180-4892
Sofia, 1504, Bulgaria Болгария

R. G. Emilova

National Center of Infectious and Parasitsic Diseases

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0018-1361
Sofia, 1504, Bulgaria Болгария

D. M. Hristova

Aleksandrovska University Hospital

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9710-1312
Sofia, 1431, Bulgaria Болгария

P. J. Kostova-Shahid

Aleksandrovska University Hospital

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-3012-1861
Sofia, 1431, Bulgaria Болгария

B. N. Petrunov

National Center of Infectious and Parasitsic Diseases

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8435-6175
Sofia, 1504, Bulgaria Болгария

References

Supplementary files