Arp GENE NUCLEOTID SEQUENCES VARIABILITY IN RUSSIAN TREPONEMA PALLIDUM ISOLATES

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Молекулярная эпидемиология, возникшая как результат интеграции
молекулярно-генетических методов в традиционные эпидемиологические
исследования, с конца XX века стала одним из основных инструментов кон-
троля над распространением и изменчивостью возбудителей инфекционных
заболеваний [4]. В наибольшей степени этот подход оказался востребованным
при анализе эпидемиологии некультивируемых патогенов, ярким примером
которых является возбудитель сифилиса — Treponema pallidum subsp. pallidum
[1].
Отправной точкой для разработки метода генотипирования бледной тре-
понемы стала расшифровка ее полного генома [6] и последующее сравнение
с геномами других представителей вида T. pallidum [3, 12], позволившее иден-
тифицировать на бактериальной хромосоме наиболее вариабельные локусы.
На основании двух из них — генов arp и tprII — в 1998 году был предложен
первый метод молекулярного типирования T. pallidum subsp. pallidum [13], в
дальнейшем поддержанный CDC (США) и получивший широкое распростра-
нение при анализе эпидемиологии сифилиса во всем мире как CDC-метод [2,
10].
Использование для этих целей гена arp (acidic repeat protein) определялось
особенностями его структуры: наличием консервативных терминальных
участков (в том числе мембрана-связывающего домена и сайта для сигнальной
пептидазы I), а также находящегося между ними вариабельного фрагмента из
60-нуклеотидных тандемных повторов, занимающего 51% от общей длины
гена [9]. При этом предложенный подход к выявлению подобного полимор-
физма основан на амплификации соответствующего участка гена arp и по-
следующего определения количества 60-нуклеотидных повторов на основе
характеристик электрофоретической подвижности ампликона в агарозном
геле [13]. В зависимости от числа подобных повторов (от 2 до 22) идентифи-
цируемому изоляту присваивается соответствующий цифровой индекс, в
дальнейшем дополняемый буквенным обозначением, соответствующим
определенному профилю полиморфизма длин фрагментов рестрикции про-
дуктов амплификации генов tprII (16 вариантов).
Многолетний опыт использования CDC-метода заставил констатировать
ряд ограничений его дискриминирующей способности, в том числе связанных
с выраженным доминированием вариантов T. pallidum subsp. pallidum с четыр-
надцатью повторами в гене arp [2, 10]. В этой связи, для повышения разре-
шающей способности метода было предложено дополнительное секвениро-
вание генов tp0136, tp0319, tp0548 и 23S рРНК [5], а также вариабельного
участка гена tp0548 (позиции 131 — 215) [11]. При этом последний подход,
позволивший разделить подтип 14а на 2, а 14d на 4 отдельные подгруппы, по-
лучил наибольшее распространение и в настоящее время интегрирован в си-
стему молекулярного типирования при сифилисе.
Вместе с тем, анализ гена arp (слияние tp0433 — 0434) свидетельствует о
неполном раскрытии его дифференцирующего потенциала. Основанием для
этого утверждения являются данные о неидентичном характере нуклеотидных
последовательностей тандемных повторов, на основании которых могут быть
выделены их I, II, III и II/III подтипы [9]. Другой особенностью может являть-
ся различный порядок расположения этих подтипов в составе внутреннего
фрагмента гена arp [7]. Соответственно секвенирование гена arp вместо ру-
тинной детекции ПЦР-продуктов его амплификации представляется перспек-
тивным направлением совершенствования CDC-метода, приводящим моле-
кулярное типирование T. pallidum subsp. pallidum к стандартам мультилокус -
ного секвенирования бактериальных геномов.
В этой связи, целью настоящего исследования явился анализ вариабель-
ности нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента гена arp у
современных российских штаммов T. pallidum subsp. pallidum, выполненный
с использованием технологии капиллярного секвенирования (по Сенгеру).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включены 57 клинических изолятов, полученных в 2016
— 2017 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенеро-
логического профиля Центрального (Калужская область), Северо-Кавказ -
ского (Ставропольский край) и Сибирского (Республика Тыва) федеральных
округов. В качестве референса использован T. pallidum subsp. pallidum штамм
Nichols, культивируемый на тестикулярной модели у кроликов.
Выделение ДНК из исследуемого биоматериала проводилось с использо-
ванием набора реагентов «Проба-НК» (ДНК-технология, Россия). Присутст-
вие генетического материала T.pallidum subsp. pallidum в полученных образцах
подтверждалось методом ПЦР с праймерами к гену polA (регион 1156 — 1531
пар оснований), кодирующему специфическую ДНК-полимеразу I данного
микроорганизма [8].
Рутинное типирование подтвержденных клинических изолятов прово-
дили с использованием CDC-метода [13] путем амплификации гена arp, а
также амплификации генов подсемейства tprII с последующей рестрикцией
эндонуклеазой Tru9 I (НПО СибЭнзим, Россия) и оценкой электрофоретиче-
ской подвижности полученных продуктов в агарозном геле относительно
маркеров молекулярных масс GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (ThermoFisherScientific,
США). В соответствии с рекомендацией Marra С.М. et al. [11]
дополнительно проводили секвенирование вариабельного участка гена
tp0548.
Подбор праймеров для секвенирования вариабельного фрагмента гена arp
осуществляли с использованием банка аннотированных нуклеотидных по-
следовательностей Национального центра биотехнологической информации
США (GenBank NCBI USA) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/] и on-line
сервиса nucleotide BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/].
Амплификация гена arp проводилась с использованием термоциклера
DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Очистка ПЦР-
продукта после первого этапа амплификации проведена с использованием
набора «QIAquick PCR Purification Kit» (Qiagen, Германия). Очищенный ПЦР-
продукт был использован для второго этапа амплификации с применением
меченых терминирующих нуклеотидов из набора реагентов Big Dye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Осажденные продукты
ПЦР использовали для проведения секвенирования вариабельного фрагмен-
та гена arp на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с при-
менением программного обеспечения 3130 Data Collection v.3.0.
Первичная расшифровка нуклеотидных последовательностей вариабель-
ного фрагмента гена arp проведена в программе Sequencing Analysis 5.3.1. Для
выравнивания гена arp на референсные сиквенсы T.pallidum subsp. pallidum
использована программа Mega 5.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование 57 образцов генетического материала T.pallidum в соответ-
ствии с рутинной процедурой CDC относило их исключительно к 14 молеку-
лярному субтипу по гену arp. Наличие гена arp с четырнадцатью 60-нуклео-
тидными тандемными повторами продемонстрировано и в референс -
ном геноме T. pallidum
штамм Nichols. После-
дующее типирование
по генам tprII и tp0548
позволило частично
разделить анализиру-
емую выборку, выделив
в ней доминантный (14
d/f — 89,5%) и минор-
ные (14 b/g и 14 c/f по
3,5%; 14 b/f и 14 i/f по
1,7%) молекулярные субтипы. Однако однотипный характер гена arp су-
щественно снизил эффективность дискриминации данных клинических
изолятов. Тем самым полученный результат подтвердил декларированную
необходимость совершенствования CDC-метода, в частности, путем углублен-
ного анализа гена arp с применением технологии капиллярного секвениро-
вания.
Практическое решение этой задачи потребовало внесения изменений в
протокол амплификации гена arp, поскольку использование предложенных
Pillay А. et al. [13] прямого и обратного праймеров как на этапе фрагментации
анализируемого участка ДНК, так и в реакции амплификации с применением
меченых терминирующих нуклеотидов, не обеспечивало качественного про-
чтения концевых участков анализируемых нуклеотидных последовательно -
стей. В этой связи, нами была предложена процедура двухраундовой ампли-
фикации гена arp с использованием двух пар прямого и обратного праймеров
(табл. 1). При этом использование первой (внешней) пары праймеров ориен-
тировано на получение первичного ампликона размером 1643 п.о., располо-
женного между 388 и 1541 нуклеотидами в гене arp и наряду с его центральным
участком из 60-нуклеотидных тандемных повторов дополнительно включаю-
щего фрагменты 5’- и 3’-концевых консервативных участков. В свою очередь,
на этапе секвенирования с использованием терминирующих нуклеотидов ис-
пользовалась вторая (внутренняя) пара праймеров, амплифицирующая вну-
тренний участок гена arp, полученного после первого раунда амплификации
(рис. 1). Подобный подход обеспечил качественное прочтение участка гена
arp между 414 и 1409 нуклеотидами (размером 1015 п.о.), результатом которо-
го являлось как четкое определение количества 60-нуклеотидных повторов,
так и их первичных нуклеотидных последовательностей.
Результаты проведенного секвенирования во всех случаях подтвердили
присутствие во внутреннем участке гена arp четырнадцати тандемных повто-
ров, одновременно зафиксировав вариации их нуклеотидного состава, а так-
же различный характер взаимного
расположения подобных неидентич-
ных повторов.
Анализируемые повторы харак-
теризовались высоким содержа -
нием GC-пар (67%), наличием двух
палиндромных последовательностей
(CCGGCC и GAGGGGAG), а также
вариабельностью пяти триплетов в
позициях 6, 8, 15, 16 и 17 (табл. 2).
Наиболее частым вариантом являлся
60-нуклеотидный по-
втор с триплетом GTG
в 6 и AAG в 8 позици -
ях, а также триплетами
GAG, CGT и GAG в 15
— 17 позициях. Ранее
исключительное при-
сутствие аналогичных
60-нуклеотидных по-
второв было показано у
T. pallidum, выделен-
ных от обезьян, T. pallidum
subsp. pertenue и
T. pallidum subsp. endemi -
cum [7], что позволяет
предполагать их эволю-
ционную первич ность,
составившую основу для
последующей дивер-
генции гена arp. Вторым
по частоте встречаемо-
сти являлся повтор,
отличающийся от опи-
санного выше варианта
единственным одно-
нуклеотидным поли-
морфизмом — заменой
пиримидинового осно-
вания во втором поло-
жении 6 триплета, при-
водящим к изменению
кодируемой аминокис-
лоты с аланина на ва-
лин (GCG → GTG; A →
V). Более существен-
ными оказывались отли -
чия третьего и четвер-
того вариантов, нуклео -
тидные замены в 15
— 17 триплетах кото-
рых произошли по типу
транзиции, т.е. путем
замещения пу ринового
основание на пури-
новое, а пиримидино-
вое на пиримидиновое.
При этом замены пу -
ри новых осно ваний во
втором положении 15
(GAG → GGG) и 16
(CGT → CAT) трипле-
тов повлекли за собой изменение
кодируемых аминокислот с глутами-
новой кислоты на глицин (E → G) и с
аргинина на гистидин (R → H), а ну-
клеотидная замена в третьем положе-
нии 17 триплета (GAG → GAA), на-
против, не сопровождалась изме -
нением кодируемой аминокислотной
последовательности. Наконец, раз-
личия между третьим и четвертым
вариантами 60-нуклеотидного пов -
тора заключались в замене двух пу-
риновых оснований 8 триплета с
соответствующим изменением коди-
руемой аминокислоты с лизина на глицин (AAG → GGG; K → G). В целом
полученные данные достаточно хорошо согласуются с известными пред-
ставлениями о вариантах нуклеотидных последовательностей тандемных
повторов гена arp [7, 9], в то время как предложенная нами нумерация наи-
более корректно отражает вероятные последовательные изменения их пер-
вичной структуры.
Последующий анализ комбинаций расположения различных вариантов
60-нуклеотидных тандемных повторов во внутреннем участке гена arp приво-
дил к заключению существованию нескольких молекулярных субтипов дан-
ного гена (рис. 2).
Комбинация внутреннего участка гена arp у референсного штамма
Nichols при прочтении от 5’-конца заключалось в нерегулярном чередовании
повторов I и II типов, завершающихся двумя повторами IV типа на 3’-конце
фрагмента. Однако формула подобной комбинации 5’-II-II-I-II-I-I-II-II-II-
I-I-IV-IV-3’ не была зафиксирована ни у одного из современных россий-
ских клинических изолятов T. pallidum. На этом фоне наиболее распростра-
ненной в анализируемой выборке оказывалась комбинация 5’-IIII-
I-II-I-I-II-II-IV-I-I-I-III-IV-3’, установленная у 54 из 57 исследованных
клинических изолятов и по своей последовательности соответствующая
внутреннему фрагменту гена arp штамма Street 14 [12]. Тем самым соотнесе-
ние полученных данных с представлениями о существовании в глобальной
популяции T.pallidum subsp. pallidum двух обособленных генетических кла-
стеров, известными представителями которых являются штаммы Nichols
(Dallas, Chicago B и др.) и Street 14 (Philadelphia-1, AZ 11 и др.), приводило к
заключению о принадлежности российских изолятов к последней, также как
это было показано для возбудителей сифилиса, циркулирующих в странах
Восточной Европы [5]. На этом фоне у трех клинических изолятов, посту-
пивших из Северо-Кавказского федерального округа (Ставропольский край),
была обнаружена ранее неизвестная комбинация внутреннего участка гена
arp, состоящая только из повторов I и II типов, описываемая формулой 5’-IIII-
I-II-I-I-II-II-I-II-II-I-I-I-3’ и обозначенная нами как молекулярный ва-
риант Stavropol (рис. 2). Тем самым подобная находка развивает предполо-
жение о существовании в глобальной популяции T. pallidum subsp. pallidum
более значительного разнообразия гена arp, что ранее было показано на при-
мере одного из регионально распространенных вариантов — выделенного в
Индии штамма Madras [7].
ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярное типирование T. pallidum subsp. pallidum, основанное на ис-
следовании вариабельных генов arp, tprII и tp0548, в настоящее время стало
распространенным и востребованным инструментом слежения за глобальной
и региональной эпидемиологией сифилиса [1, 2]. В то же время, длительный
опыт использо вания данного метода заставил констатировать ряд ограничений
его дискриминирующей способности, в том числе определяемых высокой
частотой встречаемости гена arp с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандем-
ными повторами.
Предложенным в настоящем исследовании подходом к повышению эф-
фективности генотипирования T. pallidum явился переход от электрофорети-
ческой детекции ампликонов гена arp к секвенированию его внутреннего
вариабельного участка, реализованный с использованием оригинальной двух-
раундовой процедуры амплификации.
Проведенное секвенирование гена arp позволило получить три согласую-
щихся результата: 1) отнести все исследуемые гены к вариантам с 14 нуклеотид -
ными повторами; 2) подтвердить существование 4 вариантов 60-нуклеотидных
повторов, отличающихся по составу 6, 8 и 15 — 17 триплетов [7, 9]; 3) описать
различные комбинации подобных неидентичных повторов. При этом прин-
ципиально важным результатом стало выявление в российской популяции
нескольких вариантов гена arp. Подавляющее большинство из них (54 из 57)
относились к варианту, характерному для геногруппы Street 14, что впервые
показывает её доминирование в обследованных субъектах Российской
Федерации. С другой стороны, вариант последовательного расположения
60-нуклеотидных повторов, характерный для геногруппы Nichols, был зафик-
сирован только у соответствующего референсного штамма, что свидетельст -
вует о произошедшем полном вытеснении данного генотипа. Наконец еще
одной принципиально важной находкой стало обнаружение ранее неизвест-
ного варианта гена arp, имеющего четко ограниченный ареал распростране-
ния.
Таким образом, результаты проведенного исследования принципиально
подтвердили целесообразность секвенирования гена arp для повышения эф-
фективности молекулярного типирования T. pallidum, позволив дифференци-
ровать вариант данного гена с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандемны-
ми повторами на несколько молекулярных субтипов. Планируемое увеличение
количества исследуемых клинических изолятов с вовлечением субъектов
Российской Федерации с традиционно высоким уровнем заболеваемости
сифилисом потенциально должно еще более расширить дискриминирующую
эффективность предложенного метода, позволив охарактеризовать пандеми-
ческий и региональные молекулярные варианты T. pallidum subsp. pallidum.
Одновременно продолжение исследований в обозначенном направлении
явится шагом, приводящим молекулярное типирование возбудителя сифили-
са к стандартам мультилокусного секвенирования бактериальных геномов.

About the authors

O. A. Obraztsova

State Research Center of Dermatovenerology and Cosmetology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

K. A. Aleinikova

State Research Center of Dermatovenerology and Cosmetology

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. A. Kubanov

State Research Center of Dermatovenerology and Cosmetology

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

D. G. Deryabin

State Research Center of Dermatovenerology and Cosmetology

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files