WHEN WILL THE NEW TUBERCULOSIS VACCINE APPEAR?

Full Text

На заседаниях конгресса «Мир вакцины 2013» (Лилль, Франция) его участники обсудили состояние и перспективы вакцинологии в Европе, в том числе: организацию разработки новых вакцин - от научных исследований до маркетинга и практического использования; организацию и методы контроля качества новых вакцин; методы введения вакцин в организм; биотехнологические инновации; терапевтические и профилактические вакцины для неинфекционных заболеваний (диабета, аллергии и др.); новые вакцины против гриппа, японского энцефалита, ротавирусной, норови-русной и ротавирусной инфекций, малярии и других заболеваний. В повестке конгресса была также проблема противодействия глобальному антивакцинальному движению в интернете и СМИ. В данном сообщении представлен краткий критический обзор по разработке новых туберкулезных вакцин. Материалы конгресса не опубликованы в бумажном формате, они некоторое время были доступны на его сайте только участникам форума [10]. Лилль стал местом проведения Конгресса не случайно. В 2013 г. научный мир отметил 150-летие французского микробиолога Альбера Кальмета (1863 -1933), который вместе с многолетним соратником ветеринаром Камилем Гереном (1872 - 1961) создал противотуберкулезную вакцину ВСО. Именно Лиллю суждено было стать родиной вакцинного штамма БЦЖ. Эта работа началась в 1908 г. в местном филиале парижского Института Пастера, которым А.Кальметт руководил четверть века с 1895 г. В то время туберкулез особенно поражал рабочую бедноту промышленных районов северных провинций Франции. Исследования по аттенуации и селекции первоначально вирулентного для коров штамма Mycobacterium bovis продлились до 1919 г., когда ослабленные бактерии перестали вызывать смертельные заболевание у животных и на их основе была создана вакцина для профилактики коровьего туберкулеза. В 1919 г. Кальметта и Герена перевели в Институт Пастера в Париже. Там они в 1921 г. завершили разработку вакцины БЦЖ для применения на людях и в том же году впервые успешно привили новорожденных в больнице Шарите. В 1925 г. профессор Л.А.Тарасевич получил от Кальметта штамм БЦЖ Mycobacterium bovis, зарегистрированный у нас как БЦЖ-1. После всестороннего экспериментального и клинического изучения вакцины в 1928 г. было рекомендовано вакцинировать новорожденных из очагов туберкулезной инфекции. Тогда же вакцина была принята Лигой Наций. Однако из-за яростных возражений ее широкое применение задержалось вплоть до конца 2 Мировой войны. Продолжившиеся исследования убедительно доказали, что вакцинация БЦЖ защищает детей от самых опасных форм инфекции, таких как милиарный туберкулез и туберкулезный менингит. С середины 1950-х годов до 1962 г. вакцину БЦЖ у новорожденных применяли в основном перорально. С 1962 г. для вакцинации и ревакцинации стали использовать более стандартизованный внутрикожный метод введения этой вакцины или вакцины с уменьшенной дозой антигенной нагрузки вакцинируемых (БЦЖ-М). В связи с юбилейной датой одного из авторов единственно принятой во всем мире вакцины БЦЖ заседание конгресса, названное «БЦЖ и разработка новых туберкулезных вакцин», открылось докладом «Год Кальметта: БЦЖ - от прошлого к настоящему» (Prof. Camille Locht, Институт Пастера в Лилле). Остальные выступления были посвящены оценке новых кандидатных вакцин против туберкулеза. Проблема профилактики туберкулеза (ТБ) по-прежнему актуальна для многих стран мира, в том числе и для России. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в последние 30 лет серьезно осложнилась из-за эпидемии ВИЧ-инфекции, а также в связи с агрессивным распространением заболеваний, вызванных возбудителями с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ). Поиск кандидатов для замены вакцины БЦЖ идет уже давно. Мнения о профилактической эффективности вакцины БЦЖ крайне противоречивы: одни считают ее бесполезной, другие доказывают ее 80% и выше эффективность. Несмотря на многочисленные исследования до сих пор многие аспекты иммунитета при туберкулезе, в том числе иммунологические эффекты БЦЖ-вакцинирования, остаются непроясненными [17]. Одна из статей, посвященных юбилею вакцины БЦЖ, так и названа - «БЦЖ-вакцинация: спустя 90 лет еще так много предстоит узнать» [14]. Однако прогресс в изучении цитокинов и Толл-рецепторов несколько расширил представление о гуморальных и клеточных механизмах иммунной защиты при различных инфекциях, в том числе при туберкулезе [12, 16 - 18, 20, 22]. Основным недостатком этой вакцины, которая применяется в мире более 90 лет и является единственным разрешенным средством иммунопрофилактики ТБ, считают то, что она способствует повышению сопротивляемости организма только к первичной инфекции (у детей), но не предотвращает реактивацию патогена в латентной стадии, в частности у взрослых. Кроме того, живая вакцина БЦЖ может вызывать генерализованную БЦЖ-инфекцию у лиц с выраженным иммунодефицитом, в том числе при ВИЧ-инфекции [9]. Отмечена также нестабильная эффективность БЦЖ, например, она ощутимо падает с приближением к экватору, что объясняют частыми предшествующими контактами жителей этой климатической зоны с различными микобактериями. Редкие случаи постпрививочных осложнений охотно «раздуваются» антивакцинальным сообществом, при этом обычно ссылаются на опыт Англии, Германии и других развитых стран, где обязательная вакцинация против туберкулеза отменена, забывая упомянуть, что там на это пошли только после стабильного улучшения эпидемической ситуации по туберкулезу, из-за чего массовые прививки стали экономически нецелесообразными (снижается соотношение расходы/эффективность). В нашей стране всеобщая БЦЖ-вакцинация новорожденных сохраняется с 1962 г. Кроме того, до 2014 года проводилась регулярная ревакцинация детей в 7 и 14 лет. В соответствии с новым национальным календарем профилактических прививок теперь в РФ ревакцинация детей в 14 лет против туберкулеза отменена [1]. Доклад ВОЗ об итогах борьбы с туберкулезом за 2012 год констатирует, что глобальное бремя этой инфекции в мире остается чрезвычайно большим [4]. Так, в 2011 г. в мире зарегистрировано около 8,7 млн случаев заболевания ТБ (из них 13% в сочетании с ВИЧ-инфекцией), 1,4 млн смертей от ТБ, в т.ч. почти 1 млн случаев смерти среди ВИЧ-отрицательных и 430 тыс среди ВИЧ-положительных лиц. ВОЗ отмечает, что РФ входит в число 22 стран с высоким уровнем (бременем) ТБ, где регистрируется более 80% случаев заболевания в мире. На долю РФ вместе с Бразилией, Индией, Китаем и Южной Африкой (страны БРИКС) приходится 60% расчетного числа случаев туберкулеза с МЛУ-ТБ. Там же указано, что самая высокая процентная доля МЛУ-ТБ среди больных сконцентрирована в странах Восточной Европы и Средней Азии. Это в основном РФ и другие бывшие республики СССР. Поэтому в Европе для разработки новой, более эффективной противотуберкулезной вакцины прилагаются большие финансовые и интеллектуальные усилия. Общую характеристику портфеля конструируемых препаратов дал Dr. Luc Hessel, один из руководителей TBVI (TuBerculosis Vaccine Initiative). Штаб-квартира TBVI находится в г. Лелистад в Нидерландах. Разработка всех туберкулезных вакцин в Европе проходит под жестким контролем этого европейского некоммерческий фонда, который имеет финансовую поддержку многих правительств ЕС, организаций и частного сектора. В орбиту TBVI вовлечены видные ученые, биотехнологи, клиницисты из более 50 ведущих мировых университетов, НИИ и биотехнологических компаний, разрабатывающих и продвигающих в практику новые противотуберкулезные вакцины. В руках TBVI находится управление портфелем вакцин и биомаркеров, а также отбор наиболее перспективных кандидатов. Один из основных принципов TBVI состоит в том, что новые вакцины должны быть доступными прежде всего для развивающихся стран с высоким бременем туберкулеза. Сейчас TBVI поддерживает разработку около 40 туберкулезных вакцин-кандида-тов, которые по их предназначению можно разделить на 2 группы: вакцины для праймирования, т.е. для первичной иммунизации против ТБ взамен ныне повсеместно принятой вакцины BCG; бустерные вакцины, которые при ревакцинации должны усилить эффект иммунизации вакциной BCG, заменив ее или будучи примененными одновременно с ней. Для прайминга разработаны или находятся в стадии разработки 12 вакцин-кандидатов, в т.ч. фазу II клинических испытаний прошли 2 вакцины: генно-модифицированная вакцина BCG (rBCG-VPM1002) и аттенуированная вакцина на основе штамма M. tuberculosis (att. MTB-MTBVAC). Одна вакцина успешно проходит предклинические испытания (rBCGdeltaZMP1). Девять вакцин разрабатываются, в т.ч. четыре - на основе генно-модифицированного штамма BCG, четыре - на основе ослабленных штаммов микобактерий туберкулеза человеческого типа и одна - на базе генной модификации микобактерий вида M. microti. В качестве бустерных вакцин рассматриваются 17 кандидатов, из них фазу II клинических испытаний прошли 6 вакцин: MVA85A, M72/AS01, H1/IC31, H1/CAF01, H56/IC31, SAV/Ag85A, которые представлены как модифицированными штаммами M. bovis, так и парциальными белками M. tuberculosis. Две вакцины прошли или проходят предклинические испытания: HBHA и MTBVAC+ (убитая вакцина на базе M. tuberculosis). В разработке еще 9 бустерных вакцин-кандидатов, в т.ч. 4 представлены белковыми адъювантами, 2 - на основе липидов, 2 - на основе вирусных компонентов, 1 - на базе ДНК. На конгрессе были доложены и обсуждены характеристики трех наиболее продвинутых туберкулезные вакцин: VPM1002 (Dr. Leander Grode, Германия), H1&H56 (Dr. Morten Ruhwald, Дания) и MVA85A (Dr. Helen Fletcher , Англия). Вакцина MVA85A представляет собой генно-модифицированный вакцинный вирус коровьей оспы (штамм «Анкара»), в котором экспрессирован антиген 85А туберкулезных микобактерий человеческого типа (M. tuberculosis). Авторы планировали использовать свою вакцину в качестве бустерной с целью повысить защитный иммунный эффект после BCG. Однако хорошо поставленные клинические испытания этого препарата на большом числе детей в Южной Африке дали пока, по оценке экспертов и самих авторов, разочаровывающие результаты [21]. Работы ведут в основном исследователи Дженнеровского центра в Оксфорде (Англия). Вакцина H1&H56 - это по существу 2 вакцины, разрабатываемые в Дании (Statens Serum Institut, Copenhagen). Более ранняя разработка - вакцина H1 имеет своей основой комплекс из двух иммуногенно активных протеинов 85B и ESAT-6 M. tuberculosis. Она планировалась в качестве бустерной после вакцины BCG и в настоящее время проходит клинические испытания. Сравнительно недавно авторы вышли на более перспективную, по их мнению, модификацию этой вакцины, которую назвали H56. Вакцина H56 отличается от Н1 тем, что помимо острофазных белков возбудителя туберкулеза человека (85B и ESAT-6), к ним добавлен микробный белок латентной стадии Rv2660c. По оптимистическому мнению разработчиков, эта комбинация будет превосходить как единственно разрешенную вакцину BCG, так и вакцину Н1. Однако пока эти исследования не вышли за рамки предклинических испытаний на мышах и яванских макаках [15]. Следует добавить, что обе представленные выше датские разработки включают дополнительно систему адъювантов CAF01. Вдохновленные успешным экспериментом на мышах, авторы вакцины Н56 полагали, что она: обеспечит защиту на поздних стадиях инфекции и это будет революцией в истории борьбы с ТБ; эффективна в качестве буст-иньекции к БЦЖ; обеспечит защиту организма от реактивации туберкулеза даже при иммунизации уже инфицированного организма [3]. Однако в последнее время прогресса в разработке этой вакцины не наблюдается. Вакцина VPM1002 представляется наиболее продвинутой и перспективной для замены вакцины БЦЖ. Под патронажем TBVI ее разрабатывает группа немецких исследователей из MPG (общества Макса Планка), VPM (управления вакцинными проектами в GmbH) и HZI (Центра им. Гельмгольца по исследованию инфекций). Сейчас проектом руководят опытные менеджеры из VPM (Ганновер, Германия), в частности д-р Леандер Гроде. Целью работы этой группы ученых являлось создание на основе рекомбинатного штамма БЦЖ более безопасной и эффективной живой вакцины против туберкулеза для жителей эндемичных регионов и групп риска, включая неэндемичные страны. В частности, новая вакцина не должна вызывать осложнений и генерализации вакцинной инфекции у иммунодефицитных лиц (ВИЧ-СПИД), но в то же время, должна формировать более прочный противотуберкулезный иммунитет как у детей, так и у взрослых. Завершается вторая фаза клинических испытаний вакцины, и индийский Serum Institute уже заключил контракт с VPM на право использования различных патентов и технологий, связанных с новой туберкулезной вакциной [11]. Важнейшим этапом конструирования этой вакцины явилась «изощренная» двойная генная модификация штамма BCG. Ее целесообразность теоретически обосновали и при содействии коллег претворили в реальность немецкие ученые S.H.Kauf-mann и L. Grode. Они опирались на результаты расшифровки полного генома возбудителя туберкулеза [2] и новые данные о роли уреазы микобактерий в подавлении полноценного иммунного ответа организма, что обеспечивает длительную внутриклеточную персистенцию не только патогенных M. tuberculosis, но и вакцинного щтамма БЦЖ [7]. Хорошо известно, что для туберкулеза характерна внутриклегочная инфекция, что обусловлено высокой способностью возбудителя к персистенции внутрилегочных макрофагов. Микобактерии используют такой механизм для ускользания от антител, комплемента, фагоцитоза и других внеклеточных факторов защиты макроорганизма. В итоге тормозится клеточный иммунный ответ с активацией популяции Th1 и цитотоксических CD8 лимфоцитов. Как же это происходит? Оказалось что многие микобактерии имеют ген уреазы, синтез этого фермента приводит к производству аммиака из мочевины и сдвигу в слабощелочную сторону рН микросреды внутри фагосомы, в которой вегетируют клетки M. tuberculosis и других видов [15]. Это препятствует нормальному разрушению оболочки фагосомы кислыми продуктами метаболизма клетки-хозяина и слиянию фагосомы с лизосо-мальными пузырьками. Поэтому микобактерии сохраняются в фагосоме макрофагов очень долго, т.е. имеет место незавершенный фагоцитоз [13]. В результате отсутствует полноценный процессинг бактерий с выходом комплекса антигенных детерминант с белками класса II HLA для иммунной презентации ТЫ клеткам и дальнейшей стимуляции эффективного иммунного ответа. Полагают, что это свойство микобактерий во многом объясняет недостаточный иммунный ответ на инфицирование M. tuberculosis, что может быть особенно критично для индивидуумов со слабой степенью общей иммунорезистентности. Исследования показали, что сказанное выше относится и к уреазопозитивному вакцинному штамму БЦЖ [19]. Это обстоятельство вполне может объяснить низкую профилактическую эффективность БЦЖ-вакцинации, особенно контрастирующую по сравнению с высокой эффективностью других живых вакцин. Поэтому создатели новой вакцины выключили ген уреазы (ureC) путем делеции его части в ДНК штамма M. bovis вакцины BCG Кальметта-Герена (подтип «Прага»). Полезность этой операции была подтверждена группой исследователей, показавших, что уменьшение синтеза уреазы таким штаммом способствует лучшей презентации антигенов и стимулирует более высокую активацию CD4+ клеток [16]. Дополнительно в геном был интегрирован ген листериолизина (HLY) из Listeria monocytogenes. Листериолизин обладает высокой мембрано-перфорирующей активностью, но для этого требуется соответствующая рН, которая появляется как раз после ингибирования синтеза уреазы, защелачивающей микросреду в фагосоме с микобактериальными клетками [8]. Таким образом, лизин (HLY) дополнительно способствует разрушению мембраны фагосомы, в которую заключены клетки вакцинного штамма, и слиянию ее с лизосомными пузырьками, после чего происходит процессинг и перемещение антигенов вакцинного штамма из фаголизосом в цитоплазму для соединения с белками комплекса HLA. Это обеспечивает более активное включение дальнейших стадий иммунного ответа, таких как презентация бактериальных антигенов, их распознавание и т.д. Доказано, что при этом также стимулируется апоптоз зараженных макрофагов и других антигенсодержащих клеток [5]. Оригинальное название сконструированного вакцинного штамма - HLY+rBCG, или ureC HLY+rBCG. Отработан в режиме GMP весь производственный процесс получения стабильного препарата. Вакцина производится методом глубинной ферментации на минимальной среде. Конечный продукт - лиофилизат живых генно-модифицированных бактерий. Завершена разработка технологии по стандартам GMP с учетом масштабирования производства. По данным разработчиков, современный 30 л глубинный ферментер дает за полный цикл продукцию приблизительно от 1 до 3 млн доз. Лиофилизация на пилотной установке позволяла сушить до 3000 флаконов, суммарно содержащих около 60 000 доз вакцины. Каждый флакон содержит 20 доз (около 5x106 КОЕ). Исследование стабильности показало, что активность лиофили-зированной вакцины сохранялась в течение 42 месяцев (2x106 КОЕ/флакон). Доклинические исследования с применением нового вакцинного штамма HLY+rBCG проводились на морских свинках, макаках и белых мышах. Побочных эффектов не было выявлено. Успешно завершены токсикологические исследования на кроликах, изучено влияние на прибавку веса у новорожденных кроликов. Безопасность проверялась и на иммунодефицитных мышах с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Исследование в течение 105 дней на SCID мышах с различными концентрациями живых вакцинных клеток показало, что даже наивысшая доза (3x108 КОЕ/животное) была ниже ЛД50. Аналогичное исследование было проведено на мышах с нокаутированным геном IFN-y, при этом была показана 100 % выживаемость животных до максимально примененнной дозы (4x106 КОЕ/ животное). Экспериментальное изучение протективной способности проводилось на модели аэрозольного заражения мышей рекомбинантным штаммом БЦЖ (HLY+rBCG) и патогенными микобактериями туберкулеза. При этом было установлено, что она значительно лучше защищает даже от аэрозольного инфицирования M. tuberculosis, чем родительская вакцина БЦЖ. В этих экспериментах были изучены тонкие механизмы взаимного влияния различных цитокинов и их роль в развитии антигенспецифического Т-клеточного иммунного ответа на генно-модифицированный штамм БЦЖ [18]. Установлено, что вакцина HLY+rBCG существенно лучше, чем исходная вакцина БЦЖ, стимулировала формирование необходимых композиций Т-клеток, в частности ТЫ, ТЫ7 и других клеток, ответственных за одновременный синтез не одного, а нескольких цитокинов, таких как IL-12, 17, 18, IFN-y, TNF-a [17, 18, 20, 22]. Исследование в рамках фазы Ib открытого рандомизированного контролируемого испытания вакцинного штамма HLY+rBCG для оценки его безопасности и имму-ногенности в сравнении с БЦЖ показало, что однократная вакцинация до 5x105 КОЕ безопасна и хорошо переносится здоровыми добровольцами (80 человек в Германии). Рекомбинантная вакцина BCG высоко иммуногенна: она индуцировала CD4+ и CD8+ T-клетки, которые играют важную роль в защите против туберкулеза, причем этот эффект был выше, чем при использовании стандартной вакцины BCG. Надо отметить, что в последнее время пристальное внимание привлекает IL-18 - цитокин из семейства IL-1, продуцируемый активированными макрофагами. Считают, что именно IL-18 является ключевым фактором защиты макроорганизма от внутриклеточных микобактерий, поскольку сильнее других цитокинов стимулирует синтез IFN-y такими клетками, как Th1 и NK. Контроль элиминация живой вакцины из организма привитых показал, что все образцы крови, мочи, слюны и кала вакцинированных лиц были отрицательными при исследовании методом ПЦР [5, 6]. Следующее исследование проводилось по аналогичной схеме на 24 здоровых добровольцах в Южной Африке в возрасте 18 - 45 лет, проживающих в эндемичных по туберкулезу районах. Полученные результаты по безопасности и иммуногенности были сравнимы с данными исследования в Германии. Наконец там же в Южной Африке проведено клиническое изучение рекомбинантной живой вакцины BCG на 48 детях (контрольная прививка БЦЖ 12 детям). Вакцинацию проводили в течение первых 8 дней после рождения младенцам из региона с высокой встречаемостью туберкулеза, но без установленного контакта с HIV и БЦЖ. Краткий итог проведенных работ на детях: 1) вакцинация штаммом HLY+rBCG здоровых новорожденных из популяции с эндемичным туберкулезом столь же безопасна и легко переносима, как обычная прививка БЦЖ; 2) иммунный ответ относительно стимуляции IFNy и CD4+ и CD8+ T-клеток схож с таким же при однократной вакцинации эквивалентной дозой БЦЖ. Вместе с тем, разработчики отметили выраженные достоинства рекомбинантной вакцины HLY+rBCG: более сильная активация лимфоцитов CD4+ и СD8+ и цитокинов IL-12, IFNy,TNFa; большая безопасность по сравнению с БЦЖ для лиц с иммунодефицитом. Было также установлено что она индуцирует более глубокую защиту от микобактерий туберкулеза генотипа Beijing/W (Пекин) с множественной лекарственной устойчивостью, в то время как родительская БЦЖ не обладает такой высокой протекцией. Если обобщить все сказанное выше, то благодаря реализации главной идеи генной модификации родительского вакцинного штамма БЦЖ удалось освободить изолированные в зараженной клетке его антигены и включить в работу широкий спектр механизмов клеточного иммунного ответа. К их числу можно отнести: а) одновременную активацию Th^ Th17 клеток; б) вовлечение в процесс мультифункциональных клеток, способных продуцировать сразу несколько разных цитокинов, определяющих защиту от туберкулезной инфекции; в) ускоренный рекрутинг антиген-специфических Т-лимфоцитов в легких, что обеспечивает раннее начало борьбы с патогенными микобактериями. Всего этого был лишен родительский штамм вакцины БЦЖ. Поэтому даже против аэрогенной модели экспериментальной туберкулезной инфекции, обусловленной микобактериями с МЛУ, защита новой вакциной была доказательно более успешной, чем при вакцинации классической вакциной БЦЖ. Авторы пришли к важному выводу, что протективная эффективность живой рекомбинантной противотуберкулезной вакцины HLY+rBCG выше по сравнению с родительской БЦЖ прежде всего из-за намного более сильной стимуляции перекрестного клеточного иммунитета антигенами M. bovis BCG против M. tuberculosis [5, 6].Это было подтверждено иммунологическими исследованиями в ходе доклинических и клинических исследований. Начата подготовка к проведению рандомизированного контролируемого исследования для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности рекомбинантной живой вакцины VPM1002 (HLY+rBCG) в сравнении с БЦЖ на ВИЧ-инфицированных и ВИЧ-неинфицированных новорожденных без прививки BCG [13]. Есть основания полагать, что через несколько лет впервые появится новая и более эффективная противотуберкулезная живая вакцина на базе генно-модифицированного вакцинного штамма, созданного более 100 лет тому назад Кальметтом и Гереном. Эту вакцину предполагается использовать как для прайминга, так и для последующей ревакцинации, тем самым полностью заменив классическую вакцину БЦЖ.

About the authors

A. M Korolyuk

St. Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera, St. Petersburg State Pediatric Medical University

L. A Zazimko

St. Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera

S. V Petrovsky

St. Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files