EVALUATION OF THERAPEUTIC-PROPHYLACTIC EFFECTIVENESS OF CHEMICAL COMPOUND NIOC-14 AGAINST ECTROMELIA VIRUS IN VIVO

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Более 30 лет назад была успешно завершена программа глобальной ликвидации оспы, которая показала, что инфекционное заболевание можно не только поставить под контроль, но и полностью элиминировать его [14]. Однако прекращение с 1980 г. всеобщей вакцинации против натуральной оспы привело к тому, что к настоящему времени более половины населения Земли не имеет иммунитета против ортопоксвирусных инфекций. Человеческая популяция в настоящее время подвергается потенциальной опасности применения природных или рекомбинантных штаммов вирусов натуральной оспы (ВНО) и оспы обезьян (ВОО) в качестве биологического оружия [12]. Кроме того, появление вспышек оспы обезьян в популяции людей в Африке (в 1996 - 1997 гг. в Демократической Республике Конго, в 2005 г. в Судане) и ее распространение (в 2003 г. ВОО был завезен в США с партией экзотических животных - гамбийских или хомячковых крыс) представляет собой серьезную угрозу населению всего мира [1, 12]. Противовирусные препараты, эффективные в отношении ВНО и других патогенных для человека ортопоксвирусов, прежде всего ВОО, могли бы существенно снизить последствия возможного возникновения вспышек оспы. Спектр лечебно-профилактических препаратов, используемых для экстренной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, чрезвычайно ограничен. К этим средствам относятся тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды [13]. В настоящее время проводятся клинические испытания двух эффективных, биодоступных при пероральном введении противовирусных препаратов: CMX001 - эфирно-липидного аналога цидофовира с активностью на стадии репликации ДНК и ST-246 - нового ингибитора выхода вируса из клетки [12]. Препарат ST-246®, или Tecovirimat™ разработан компанией SIGA Technologies Inc. по лицензии ViroPharma Inc. (Corvallis, Oregon, США) [14]. ST-246 проявил высокую активность в экспериментах с использованием низших приматов, инфицированных штаммом Zaire-79 (V79-I-005) ВОО [9, 11]. При этом наиболее полное и детальное исследование противовирусной эффективности ST-246 было проведено на модели летальной инфекции мышей вирусом эктромелии (ВЭ), который является естественным патогеном для мышей и вызывает у них генерализованное заболевание, называемое мышиной оспой, аналогичное оспе у человека [12, 16]. Ранее нами было продемонстрировано, что новое химически синтезированное соединение НИОХ-14 обладает высокой, сравнимой с ST-246, активностью в отношении ортопоксвирусов, в том числе ВОО, in vitro и in vivo [3, 4, 6]. Цель работы - исследование фармакодинамических показателей лечебно-профилактической противовирусной эффективности НИОХ-14 в экспериментах на мышах, инфицированных ВЭ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для экспериментов использовали 235 аутбредных мышей ICR обоего пола массой 12-14 г. При выполнении исследований соблюдали «Пpавила доведения pабот с использованием экспеpиментальных животных» и [5]. Эвтаназию животных осуществляли методом цервикальной дислокации. В работе использовали вирус эктромелии (штамм К-1), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор». Вирус культивировали в клетках Vero с применением питательной среды DMEM (ГНЦ ВБ «Вектор»). Концентрацию вируса в культуральной жидкости определяли путем титрования методом бляшек в культуре клеток Vero, рассчитывали и выражали в lg БОЕ/мл [2, 15]. Концентрация вируса в использованных для работы образцах составляла 5,63±0,04 lg БОЕ/мл. Наработанные и использованные в работе серии ВЭ с указанным титром хранили при температуре минус 70°C. Величина ЛД50 ВЭ для мышей была равна 1,57 lg БОЕ/гол. Заражение мышей ВЭ производили интраназально по 40 мкл суммарно в обе ноздри в дозе 10 ЛД50, что составляло 2,57 lg БОЕ/гол. При пероральном введении мышам были исследованы фармакодинамические показатели противовирусной активности химического соединения НИОХ-14 (7-[№-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота), синтезированного в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова [7], с высокой активностью в отношении ортопоксвирусов, ранее описанной нами, в экспериментах in vitro и in vivo [3, 4, 6]. В качестве положительного контроля использовали химическое соединение с установленной противооспенной активностью - ST-246 (4-трифторметил-^(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[Г]изоиндол-2(Ш)-ил)-бензамид) [14], синтезированное в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова по описанной методике [10]. При оценке 50% эффективной дозы (ЭД50) НИОХ-14 вводили перорально один раз в сутки в дозах 0,78; 1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 мкг/г массы мыши через 1 ч после заражения и далее в течение 9 сут после заражения животных. Группе контрольных животных, инфицированных ВЭ, перорально вводили плацебо - раствор, содержащий 0,75% метилцеллюлозы и 1% твина-80. За животными наблюдали в течение 21 сут после заражения, ежедневно регистрируя количество павших мышей, определяли долю павших животных, подсчитывали коэффициент защиты (КЗ=% павших в контроле - % павших в опыте) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ). При определении СПЖ в каждой группе учитывали число животных, проживших определенное количество дней после заражения до гибели и число выживших животных. За максимальную продолжительность жизни выживших животных принимали 21 сутки после заражения ВЭ, т.е. гарантированное время прекращения специфической гибели инфицированных мышей, что было установлено эмпирически при многократном повторении аналогичных экспериментов. Для определения терапевтического окна препарат НИОХ-14 вводили один раз в сутки в дозе 50 мкг/г массы мыши в разные сроки до и после заражения ВЭ: за 1 сут до заражения (д/з), за 1 ч д/з, через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 сут после заражения, а далее введение НИОХ-14 продолжали в течение 9 сут после первого введения препарата. Наблюдение за животными осуществляли в течение 21 сут после заражения ВЭ, в каждой группе мышей регистрировали падеж и рассчитывали СПЖ. Через 6 сут после заражения и ежедневного (начиная с 1 сут после инфицирования) введения препаратов в дозе 50 мкг/г массы мыши у эвтаназированных мышей определяли концентрацию ВЭ (в lg БОЕ/мл) в сыворотке крови и 10% гомогенатах органов, полученных от 4 инфицированных мышей из каждой группы. Для этого использовали стандартный для ортопоксвирусов метод подсчета количества бляшек при внесении последовательных разведений образцов на монослой культуры клеток Vero [15]. В случаях, когда концентрация ВЭ в гомогенатах органов инфицированных мышей была ниже порога чувствительности метода титрования (<1,0 lg БОЕ/мл), проводили расширенное тестирование исходных образцов [15, 16]. Если концентрация ВЭ в гомогенатах органов была ниже порога чувствительности расширенного тестирования (<0,3 lg БОЕ/мл), использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном способе (0,3 lg БОЕ/мл). Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [2] с помощью [8] с оценкой достоверности отличий (р<0,05) для 95% доверительного уровня (I95). Сравнение доли выживших животных в инфицированных группах проводили по критерию %2 [2, 8]. Расчет ЭД50 производили на основании показателей выживаемости животных по методу Спирмана-Кербера [2]. Титры ВЭ в органах и СПЖ мышей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M±SM). Для сравнения титров ВЭ в органах использовали U-критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента, а для сравнения СПЖ мышей - U-критерий Манна-Уитни [2, 8]. РЕЗУЛЬТАТЫ В данной работе была проведена сравнительная оценка ЭД50 НИОХ-14 и ST-246, вводимых в разных дозах, при инфицировании мышей ВЭ в дозе, равной 10 ЛД50/гол. Было показано, что по показателю ЭД50 in vivo препараты НИОХ-14 и ST-246 достоверно не отличаются (табл. 1). При оценке выживаемости и СПЖ мышей, инфицированных 10 ЛД50 ВЭ, получавших НИОХ-14 и S-246 в разных дозах, было показано, что в дозе 12,5 мкг/г и выше оба препарата достоверно повышают относительно контроля и процент выживаемости, и СПЖ зараженных ВЭ мышей. Вместе с тем, при введении НИОХ-14 в дозах 6,25 и Таблица 1. Противовирусная эффективность препаратов НИОХ-14 и 3 12 мкг/г исследуемые ST-246 в экспериментах на мышах, инфицированных 10 ’ ЛД50 ВЭ (штамм К-1) , ф р показатели достоверно отличаются от контро- Доза препарата, Группы мышеи, мкг/г получавших препараты массы мыши Показатели выживаемости мышей, зараженных 10 ЛД50 ВЭ ЭД50, мкг/г массы мыши Кол-во и % выживших Коэффициент защиты, % СПЖ (сут) M±Sm НИОХ-14, n=10 50,0 10* (100) 100 21,0+0,00 & 3,59 для каждой дозы 25,0 10* (100) 100 21,0±0,00 & (2,29-5,63) препарата 12,5 8* (80) 80 19,7+2,98 & 6,25 7* (70) 70 17,9+5,30 & 3,12 6* (60) 60 16,8+5,59 & 1,56 2 (20) 20 12,7+4,76 0,78 0 (0) 0 9,8+2,30 ST-246, n=10 50,0 10* (100) 100 21,0+0,00 & 5,08 для каждой дозы 25,0 10* (100) 100 21,0+0,00 & (3,04-8,48) препарата 12,5 7* (70) 70 18,5+4,09 & 6,25 3 (30) 30 16,0+3,74 & 3,12 3 (30) 30 13,6+5,30 1,56 2 (20) 20 11,3+5,12 0,78 3 (30) 30 12,5+5,99 Контроль ВЭ, n=10 - 0 (0) - 10,2+2,78 - Примечание. л Доверительные интервалы, нет достоверны отличий по ЭД50 препаратов НИОХ-14 и ST-246; * отличие от контроля по критерию х2 при р<0,003; & отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р<0,001; n - число животных в группе (здесь и в табл. 2). ля, но не отличаются от значений, наблюдаемых при введении S-246 в тех же дозах. На основании анализа полученных результатов можно сделать заключение, что НИОХ-14 обладает сравнимой с ST-246 противовирусной эффективностью в отношении ВЭ in vivo. Далее для НИОХ-14 проводили определение терапевтического окна, т. е. периода времени, в течение которого введение препарата после инфицирования организма оказывается эффективным (табл. 2). Было показано, что если НИОХ-14 начина- Таблица 2. Определение терапевтического окна препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах, инфицированных 10 ЛД50 ВЭ (штамм К-1) Группы мышей, которым начинали вводить НИОХ-14: Показатели выживаемости мышей, зараженных 10 ЛД50 ВЭ Кол-во и % выживших Коэффициент зашиты, % СПЖ (сут) M±Sm За 1 сут д/з, n=10 10*(100) 100 21,0+0,00 & За 1 ч д/з, n=10 10*(100) 100 21,0±0,00 & Через 1 сут п/з, n=10 10*(100) 100 21,0+0,00 & Через 2 сут п/з, n=10 10*(100) 100 21,0+0,00 & Через 3 сут п/з, n=10 9*(90) 90 19,8+3,79 & Через 4 сут п/з, n=10 10*(100) 100 21,0+0,00 & Через 5 сут п/з, n=10 6* (60) 60 17,5+4,90 & Через 6 сут п/з, n=10 6* (60) 60 16,1+6,38 Контроль ВЭ, n=10 0 (0) - 10,2+2,78 ратов пик гибели (до 50%) мышей наблюдается через 7 сут после заражения ВЭ, поэтому начинать введение НИОХ-14 через 7 сут после инфицирования мышей ВЭ не было целесообразным для данного исследования. При оценке титров ВЭ через 6 сут после заражения мышей его не обнаружили ли вводить мышам за 1 сут или за 1 ч до заражения ВЭ, а также через 1 и 2 сут после заражения ВЭ и далее один раз в день в течение 9 сут, то выживаемость в этих группах мышей была 100%. Введение НИОХ-14 через 3 и 4 сут после заражения мышей ВЭ тоже обеспечивало соответственно 90 и 100% выживаемость животных. Дальнейшее задерживание сроков начала введения препарата до 5 и 6 сут после инфицирования животных ВЭ приводило к снижению их выживаемости до 60%, хотя этот показатель все равно оставался достоверно выше, чем в контрольной группе. Нами было установлено, что без применения противовоспенных препав сыворотке крови у контрольных животных и у мышей после введения препаратов. В это время у контрольных животных наиболее высокие титры ВЭ наблюдались в носовой полости, легких и селезенке (табл. 3). В остальных органах (трахее, головном мозге, печени, почках и поджелудочной железе) титры ВЭ были достоверно меньше, чем в легких. Введение НИОХ-14, также как ST-246, приводило к снижению титров ВЭ в легких более чем на 1 lg относительно контроля. В носовой полости и головном мозге при использовании обоих противовирусных соединений количество ВЭ становилось значимо меньше, чем в контроле. Более того, через 6 сут после заражения ВЭ при введении НИОХ-14 в печени, селезенке, почках и поджелудочной железе концентрация ВЭ у всех 4 мышей была ниже порога чувствительности метода титрования (<1,0 lg БОЕ/мл), а при расширенном тестировании диапазон титров ВЭ составлял 0,3 - 0,9 lg БОЕ/ мл. В результате применение НИОХ-14 и ST-246 приводило к достоверному снижению продукции ВЭ в легких, носовой полости и головном мозге, а также практически полному отсутствию ВЭ в трахее, печени, селезенке, почках и поджелудочной железе инфицированных мышей. Таблица 3. Титры ВЭ в органах у мышей через 6 сут после инфицирования 10 ЛД50 ВЭ в контроле и ежедневном введения препаратов НИОХ-14 или ST-246 Группы мышей, получавших препараты Средние величины титров ВЭ (lg БОЕ/мл, M±Sm) в органах мышей, зараженных 10 ЛД50 ВЭ Носовая полость Трахея Легкие Мозг Печень Селезенка Почки Поджелуд. железа НИОХ-14, 1,15+0,44 0,60+0,26 4,85+0,39 0,85+0,53 0,60+0,26 0,60+0,26 0,60+0,26 0,60+0,26 50,0 мкг/г, n=4 * # * # * * # * # * # * # * # ST-246, 50,0 1,19+0,73 0,60+0,26 4,68+0,43 0,71+0,38 0,73+0,40 0,63+0,30 0,60+0,26 0,60+0,26 мкг/г, n=4 * # * # * * # * # * # * # * # Контроль ВЭ, 5,43+1,51 2,44+0,45 6,18+0,46 2,15+0,48 4,61+0,91 5,82+1,75 1,51+0,28 3,03+0,80 n=4 # # # # # Примечание. * Отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни и t-критерию Стьюдента при р<0,05; # отличие от титров ВЭ в легких в соответствующей группе животных по U-критерию Манна-Уитни и t-критерию Стьюдента при р<0,05. Как видно из всех представленных в данной работе результатов, НИОХ-14 обладает сравнимой с ST-246 противовирусной эффективностью в отношении ВЭ in vivo в применяемых дозах и схемах введения препаратов. ОБСУЖДЕНИЕ Как известно, химическое соединение ST-246 послужившее прототипом для синтеза новых полициклических гидрированных функциональных производных изоиндола, в том числе НИОХ-14 [7], обладает противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов [16]. При этом ST-246 не было активным в отношении респираторно-синцитиального вируса (Paramyxoviridae, одноцепочечная отрицательная РНК), ротавирусов (Reoviridae, двухцепочечная РНК), вируса диареи крупного рогатого скота (Flaviviridae, положительная одноцепочечная РНК), вируса лихорадки долины Рифт (Bunyaviridae, одноцепочечная отрицательная РНК) и некоторых других РНК- и ДНК-содержащих вирусов, за исключением ортопоксвирусов [16]. Оценка противовирусной активности НИОХ-14 в отношении аденовируса человека 5 серотипа, вируса простого герпеса 2 типа, вируса Коксаки А7 и вируса Западного Нила показала, что это соединение не ингибирует их репликацию in vitro в концентрациях до 80 мкг/мл. Отсутствие активности препаратов в отношении двух типов ДНК-содержащих вирусов и двух типов РНК-содержащих вирусов говорит о специфичности действия НИОХ-14 в отношении ортопоксвирусов [7]. Вероятно, НИОХ-14 обладает аналогичным механизмом противовирусной активности, что и ST-246. Было установлено, что мишенью ST-246 является белок р37 - высоко консервативный продукт гена F13L вируса осповакцины (гомологичные гены: C17L в ВНО и C19L в ВОО). Блокируя активный центр белка р37, ST-246 ингибирует образование внеклеточного оболочечного вируса, обеспечивающего его диссеминацию, и, следовательно, препятствует распространению ортопок-свирусных патогенов in vitro и in vivo [16]. Ранее нами была выявлена высокая противовирусная активность химически синтезированного соединения НИОХ-14 в отношении ортопоксвирусов, в том числе в отношении ВОО и ВНО, в культуре клеток Vero [3]. При этом 50% ингибирующие (эффективные) концентрации НИОХ-14 in vitro для данных вирусов находились в диапазоне от 0,001 до 0,051 мкг/мл. Последующие эксперименты на мышах, инфицированных ВЭ или ВОО, позволили предположить, что НИОХ-14 проявляет противовирусную активность, сравнимую с активностью ST-246 [4, 6]. Что касается значения ЭД50 для ST-246 in vivo, то данных об определении этой величины в экспериментах при интраназальной ортопоксвирусной инфекции у мышей в доступной научной литературе не найдено. Однако было показано, что при внутривенном заражении ВОО нечеловекообразных приматов ST-246 обеспечивал их эффективную защиту от гибели (от 50 до 95%) при его пероральном введении в диапазоне доз от >3 мг/кг до <10 мг/кг, причем введение ST-246 в дозах выше 20 мг/кг приводило к 100 % выживаемости инфицированных ВОО животных [11, 12, 16]. Далее для определения терапевтического окна НИОХ-14 и сравнительной оценки противовирусной активности НИОХ-14 и ST-246 у инфицированных ВЭ мышей нами была использована доза 50 мкг/г массы мыши, поскольку в предварительных экспериментах было показано, что НИОХ-14 и ST-246 в этой дозе проявляют 100% эффективность в отношении ВЭ. Кроме того, эта доза была выбрана на основании литературных данных, согласно которым ST-246 в диапазоне доз от 30 до 100 мкг/г массы мыши был эффективным в отношении летальных ортопоксвирусных инфекций у мышей [12, 14, 16]. В литературе описаны результаты определения терапевтического окна препарата ST-246, аналогом которого является НИОХ-14, в экспериментах на мышах, инфицированных ВЭ [12]. У мышей, которые начинали получать ST-246 в день заражения или через 4 и 5 сут после заражения, была 100% выживаемость. Если мышам начинали перорально вводить ST-246 через 6 сут после заражения, то живыми оставалось 73%, а в группах животных, получавших ST-246 начиная с 7, 8 или 9 сут после заражения, выживали соответственно 47, 13 и 13%, что не было статистически значимым отличием от контроля, где летальность составляла 100% инфицированных мышей [12]. Аналогичные нашим данные по снижению титров ВЭ в печени, селезенке и легких у мышей через 4, 6 и 8 сут после инфицирования были получены при изучении протективного действия ST-246 в дозе 50 мкг/г массы мыши при летальной инфекции ВЭ (штамм Moscow, 100 ЛД50) [16]. Авторы показали, что у мышей, получавших ST-246, титры ВЭ в печени, селезенке и легких зараженных животных были ниже предела обнаружения [16]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что НИОХ-14 также, как ST-246, ингибирует системное распространение вируса и защищает мышей от летальной инфекции ВЭ. По-видимому, это обусловлено тем, что НИОХ-14, являясь аналогом, вернее предшественником ST-246 [7], может иметь аналогичный механизм действия, а именно, ингибировать вирусный белок р37 и препятствовать освобождению внеклеточных форм вируса, которые обеспечивают диссеминацию вируса в организме и развитие заболевания [16]. Таким образом, в данной работе показано, что химическое соединение НИОХ-14 обладает высокой противовирусной эффективностью в отношении ВЭ in vivo. Более того, противовирусная эффективность НИОХ-14 по всем исследованным фармакодинамическим показателям сопоставима с противовирусной эффективностью аналогичного соединения ST-246, на основе которого в США разработан и проходит клинические испытания препарат против ортопоксви-русных инфекций [11, 12, 14]. Это позволяет сделать заключение о перспективности дальнейшего исследования НИОХ-14 с целью его использования в качестве субстанции для создания нового отечественного противооспенного препарата. Работа была выполнена при поддержке ГК № 78-Д и ГК № 47-Д в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 годы)».

About the authors

A. S. Kabanov

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

L. N Shishkina

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

O. Yu Mazurkov

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

M. O Skarnovich

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

N. I Bormotov

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

O. A Serova

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

Al. A Sergeev

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

Ar. A Sergeev

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

B. A. Selivanov

Novosibirsk Institute of Organic Chemistry

Novosibirsk, Russia

A. Ya Tikhonov

Novosibirsk Institute of Organic Chemistry

Novosibirsk, Russia

A. P Agafonov

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

A. N Sergeev

State Scientific Centre ofVirology and Biotechnology «Vector»

Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia

References

Supplementary files