EFFECT OF SEROTONIN ON IMMUNE COMPETENT CELLS OF BIOMODELS UNDER THE CONDITIONS OF VACCINATION AGAINST PLAGUE AND TULAREMIA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Регулировка иммунных функций в макроорганизме осуществляется посредством целого ряда биологически активных веществ (БАВ) - иммуномодуляторов и нейротрансмиттеров, среди которых немаловажное значение отведено биогенному амину серотонину. Серотонин, как известно, выступает в роли медиатора воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным иммуномодулирующим действием, усиливает хемотаксис и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, увеличивает содержание эозинофилов в крови, способствует дегрануляции тучных клеток, регулирует в лейкоцитах такие процессы, как миграция, фагоцитоз, секреция цитокинов [1, 13]. Помимо эндогенного серотонина, уровень которого меняется не только под влиянием целого ряда внешних и внутренних причин, но и при лечении острых токсических реакций некоторыми группами антидепрессантов ингибиторов моноаминооксидазы и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, в организм постоянно попадает определенное количество экзогенного серотонина. Так, употребление продуктов питания, богатых этим БАВ (финики, бананы, сливы, инжир, томаты, молоко, соя, черный шоколад), в определенной мере влияет на уровень нейромедиатора в плазме крови. Любое изменение концентрации БАВ в организме не может не отражаться на процессах регулировки механизмов иммунного ответа при вакцинации, в том числе против чумы и туляремии. Для специфической профилактики чумной и туляремийной инфекций в России применяют живые вакцины. Вакцина чумная живая сухая Yersinia pestis EV НИИЭГ обеспечивает у привитых развитие иммунитета продолжительностью до 1 года [7], а иммунизация живой туляремийной вакциной Francisella tularensis 15 НИИЭГ приводит к формированию у людей длительного протективного иммунитета (до 5 лет) [8, 12]. Вакцинация людей любой живой вакциной сопровождается выраженными изменениями иммунного статуса за счет модификации целого ряда морфофункциональных параметров в иммунокомпетентных клетках крови - лимфоцитах и фагоцитах [3]. Жизненный цикл иммунокомпетентных клеток характеризуется многократными процессами активации, дифференцировки и пролиферации. Характеристика процессов апоптоза и пролиферации на фоне взаимодействия клеток и тканей макроорганизма с чумным и туляремийным микробами вакцинных штаммов имеет важное значение для оценки состояния иммунной системы - одной из главных гомеостатических систем организма при вакцинации. Одним из наиболее адекватных методов оценки молекулярных изменений, происходящих в клетках, позволяющим одновременно определять структурные изменения, статус хроматина и ДНК, а также механизм гибели индивидуальной клетки и ее положение в клеточном цикле на момент исследования, является проточная цитометрия. В этой связи и в аспекте разработки современной стратегии и тактики специфической профилактики чумы и туляремии [2, 8] изучение возможного влияния биогенного амина серотонина на противочумный и противотуляремийный вакцинальные процессы имеет актуальное значение. Целью данной работы явилась сравнительная оценка влияния серотонина на развитие апоптоза и пролиферативную активность клеток иммунной системы биомоделей in vivo и in vitro в динамике формирования иммунитета к чуме и туляремии. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 при температуре 28°С в течение 48 ч, вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ - на FT агаре с глюкозо-витаминной добавкой (ГНЦ ПМБ) при температуре 37°С в течение 48 ч. Изучение влияния серотонина в опытах in vivo на процессы пролиферации и апоптоза лейкоцитов крови, клеток центрального (тимуса), периферического (селезенка) органов иммунной системы проводили на мышах нелинейных и линии BALB/c весом 18 - 20 г, полученных из отдела экспериментальных животных РосНИПЧИ «Микроб». Экспериментальных животных делили на 6 групп: нелинейные мыши (1 - интактные; 2 - иммунизированные EV НИИЭГ в дозе 1х105 м.к./0,2 мл; 3 - иммунизированные Y. pestis EV НИИЭГ в дозе 1х105 м.к./0,2 мл на фоне примиро-вания серотонином); мыши линии BALB/c (1 - интактные; 2 - иммунизированные F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 1х103 м.к./0,2 мл; 3 - F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 1х103 м.к./0,2 мл на фоне примирования серотонином). Серотонин-креатинин сульфат («Merck», Germany) применяли в виде свежеприготовленного водного раствора, стерилизованного фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. В работе использовали физиологическую концентрацию серотонина 10-5 М [6]. Серотонин (10-5 М) вводили за 30 мин до иммунизации однократно подкожно в область спины в объеме 0,5 мл. Для забора крови, селезенки и тимуса животных выводили из эксперимента в соответствии с правилами работы с экспериментальными животными. Лейкоциты крови, спленоциты и тимоциты получали общепринятыми методами [9]. При изучении in vitro действия серотонина на развитие апоптоза и пролиферации лейкоцитов крови на 21 сутки иммуногенеза опытными образцами являлись пробы дефибринированной крови мышей BALB/c, содержащие в качестве индуктора взвесь двухсуточной культуры Y.pestis EV НИИЭГ (при микробной нагрузке 5х108 м. к. на 1 мл крови) с/без серотонина в концентрации 10-5 М, а также тулярин (при микробной нагрузке 5х108 м.к. на 1 мл крови) с/без серотонина в концентрации 10-5 М. Контролем являлись пробы крови интактных животных. Тулярин - коммерческий препарат, представляющий собой взвесь туляремий-ных бактерий вакцинного штамма 15 НИИЭГ, убитых нагреванием в 0,9% растворе натрия хлорида при 70°С в течение 1 ч (НПО «Микроген», Омск). Анализ относительного содержания ДНК иммунокомпетентных клеток проводили на проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE после специфической окраски смесью красителей митрамицина и этидиум бромида предварительно обеззараженного и фиксированного (70±1)% этанолом материала [11]. Клетки иммунной системы, находящиеся на стадии гибели по типу апоптоза, идентифицировали как клетки с пониженным содержанием ДНК (<2С), пролиферирующие клетки (S+G2/M) с дифференцировкой по фазам митотического цикла характеризовались повышенным содержанием ДНК (>2С) [5]. Для количественного учета процессов апоптоза и пролиферации использовали коэффициент, который равен отношению апоптотических клеток к пролиферирующим и отражает баланс этих процессов [10]. Параллельно подтверждали наличие апоптозных клеток морфологическими методами в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, с применением комплекса «Мекос-Ц» и программы «Денситоморфометрия». Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2010. Для определения достоверности различий между анализируемыми выборками определяли среднюю арифметическую ряда, среднее квадратичное отклонение, среднюю ошибку средней арифметической. РЕЗУЛЬТАТЫ В результате цитофлуориметрического анализа влияния серотонина на процессы пролиферации и апоптоза лейкоцитов крови, клеток центрального (тимуса), периферического (селезенка) органов иммунной системы было установлено, что примирование серотонином за 30 мин до иммунизации Y. pestis EV нелинейных мышей вызывает достоверное повышение пролиферативной активности лейкоцитов крови и спленоцитов на ранней стадии вакцинального процесса (1 Таблица 1. Влияние серотонина in vivo на интенсивность апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток нелинейных мышей в условиях вакцинации Y. pestis EV НИИЭГ Относительное содержание (в %), M±m Индуктор апоптоза Иммунокомпетентные клетки апоптотических клеток (< 2С ДНК) пролиферирующих клеток (> 2С ДНК) 1 сут 7 сут 21 сут 1 сут 7 сут 21 сут Y pestis EV Лейкоциты крови 3,6±0,1 2,7±0,2 6,4±0,6* 4,9±0,4* 6,5±0,1* 7,4±0,7* Y pestis EV + серотонин 4,0±0,3 3,5±0,3 4,5±0,5 6,2±0,3** 7,5±0,5* 7,9±0,7* Y. pestis EV Тимоциты 4,8±0,2 5,1±0,4* 4,5±0,5 24,9±1,6 21,3±0,7* 24,3±1,0 Y. pestis EV + серотонин 6,2±0,3** 5,9±0,5* 4,2±0,2 25,0±0,5 21,0±0,5* 24,4±1,6 Y. pestis EV Спленоциты 4,8±0,01 4,6±0,2 6,8±0,6* 19,8±1,5* 19,4±0,6* 23,8±1,7 Y. pestis EV + серотонин 6,3±0,3** 6,2±0,3** 4,1±0,1** 26,9±0,6** 21,2±0,9* 23,3±1,0 Контроль Лейкоциты крови 3,4±0,3 11,7±0,7 Тимоциты 3,2±0,06 25,2±0,4 Спленоциты 3,9±0,2 25,4±0,9 Примечание. * Достоверность различий по отношению к контролю (p<0,05), ** достоверность различий опытных проб с серотонином от проб без серотонина (p<0,05). Таблица 2.Влияние серотонина in vivo на интенсивность апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток мышей BALB/c в условиях вакцинации F.tularensis 15 НИИЭГ на 21 сутки иммуногенеза Относительное содержание (в %), M±m Иммунизирующий препарат Иммунокомпетентные клетки апоптотических клеток (< 2С ДНК) пролиферирующих клеток (> 2С ДНК) F.tularensis 15 НИИЭГ Лейкоциты крови 3,1±0,27 14,4±0,4* F.tularensis 15 НИИЭГ + серотонин 3,7±0,13* 19,5±0,29** F.tularensis 15 НИИЭГ Тимоциты 3,8±0,09* 30,3±0,32 F.tularensis 15 НИИЭГ + серотонин 3,2±0,58 33,2±0,88* F.tularensis 15 НИИЭГ Спленоциты 3,1±0,07 27,5±0,26 F.tularensis 15 НИИЭГ + серотонин 4,2±0,55 32,1±0,77* F.tularensis 15 НИИЭГ Клетки перитонеального экссудата 1,6±0,05 22,1±0,31 F.tularensis 15 НИИЭГ + серотонин 1,6±0,21 27,6±1,07 Контроль Лейкоциты крови 2,5±0,05 19,1±0,36 Тимоциты 2,9±0,07 28,8±0,1 24,7±0,25 Спленоциты 2,8±0,22 24,3 ±0,49 Клетки перитонеального экссудата 1,8±0,1 24,3±0,62 Примечание. * Достоверность различий по отношению к контролю (p<0,05), ** достоверность различий опытных проб с серотонином от проб без серотонина (p<0,05). сутки) по отношению к аналогичному показателю в группе животных, иммунизированных без серотонина. Следует отметить, что количество пролиферирующих тимоцитов под воздействием серотонина на 1 и 21 сутки не изменялось, но снижалось на 7 сутки иммуногенеза (табл. 1). Модулирующее влияние серотонина на характер распределения клеток иммунной системы по клеточному циклу проявлялось не только в изменении относительного содержания пролиферирующих клеток в крови и органах иммунной системы, но и в изменении относительного количества апоптотических клеток. Примирование серотонином нелинейных мышей перед последующей иммунизацией Y. pestis EV приводило к повышению у них в тимусе и селезенке в индуктивную фазу иммунного ответа (1 сутки) количества гиподиплоидных клеток (<2С ДНК) по сравнению с аналогичным показателем экспериментальных животных, иммунизированных Y. pestis EV (p<0,05). Под влиянием серотонина на 7 сутки иммуногенеза отмечалось увеличение апоптотических спленоцитов (p<0,05), однако на 21 сутки вакцинального процесса процент апоптотических спленоцитов снижался (p<0,05). Известно, что в процессе иммунного ответа осуществляется коррекция соотношения функциональных субклассов Т-клеток, при этом используется неравномерность вовлечения CD4+ и CD8+-клеток в пролиферацию и апоптоз. По-видимому, под влиянием серотонина происходит повышение интенсивности отрицательной клональной селекции Т-клеток в ответ на иммунизацию Y. pestis EV, что согласуется с последними данными зарубежных исследователей о выраженном модулирующем действии серотонина на Т-клеточное звено иммунитета [14]. При изучении in vivo влияния серотонина на процессы пролиферации и апоптоза лейкоцитов крови, тимоцитов, спленоцитов, клеток перитонеального экссудата мышей BALB/c в условиях вакцинации F. tularensis 15 НИИЭГ установлено, что значимые функциональные изменения под воздействием серотонина происходили, в основном, на 21 сутки иммуногенеза в лейкоцитах крови (табл. 2). В результате цитофлуориметрического анализа показано, что иммунизация вакцинным штаммом F.tularensis 15 НИИЭГ вызывала уменьшение (p<0,05) пролиферирующих лейкоцитов крови животных в сравнении с аналогичным параметром в контрольной группе. При введении серотонина мышам до вакцинации F.tularensis 15 НИИЭГ достоверно повышался (p<0,05) процент пролиферирующих (>2С) лейкоцитов крови по отношению к аналогичному показателю в группе животных, иммунизированных без серотонина. В том числе, под влиянием серотонина наблюдалось увеличение (p<0,05) количества гиподиплоидных (<2С ДНК) лейкоцитов крови относительно аналогичного параметра в группе контрольных животных. В тимусе и селезенке серотонин не оказывал значимого влияния на относительное содержание апоптотических клеток, однако в присутствии серотонина достоверно повышался процент пролиферирующих тимоцитов и спленоцитов по сравнению со средним значением аналогичного параметра в группе контрольных животных. Постоянство клеточного состава тканей органов иммунной системы обеспечивается в организме балансом процессов пролиферации и апоптоза. Баланс между двумя этими процессами определяет Т-клеточный гомеостаз в организме. В наших экспериментах показано, что серотонин не нарушает гомеостаз иммунной системы, так как коэффициент соотношения апоптотических клеток к пролиферирующим во всех группах животных не превышал 1. Проведенное морфологическое исследование с помощью комплекса «Мекос-Ц» позволило зарегистрировать в мазках крови мышей, окрашенных по Романовскому-Гимза, лейкоциты (лимфоциты, нейтрофилы) с характерными морфологическими изменениями (уменьшение размера, сморщивание, уплотнение и фрагментация ядерного хроматина при сохранении клеточной мембраны), что свидетельствовало о том, что анализируемые клетки вступили на апоптотиче-ский путь. Результаты, полученные в экспериментах in vivo на мышах нелинейных и линии BALB/c, сравнивались по показателям апоптоза и пролиферации с аналогичными данными для опытов, выполненных в условиях in vitro. Через 21 сутки после иммунизации мышей линии BALB/c вакцинными штаммами Y. pestis EV НИИЭГ и F.tularensis 15 НИИЭГ нами был проведен анализ влияния серотонина на интенсивность апоптоза и пролиферации лейкоцитов крови, стимулированных живыми клетками Y. pestis EV НИИЭГ и аллергеном туляремийного микроба (тулярином) после инкубации при температуре 37°С в течение 6 ч и 24 ч. В опытах in vitro отмечено, что в пробах с живыми клетками вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ процент апоптотических лейкоцитов крови превышал в среднем в 11 раз аналогичный показатель в пробах с тулярином. Примечательно, что серотонин в концентрации 10-5 М через 6 ч инкубации при температуре 37°С замедлял in vitro развитие индуцированного апоптоза лейкоцитов крови интактных мышей BALB/c в ответ как на клетки Y. pestis EV НИИЭГ с 18,6±0,8% (в пробах с Y. pestis EV НИИЭГ) до 11,3±0,7% (в пробах с Y. pestis EV НИИЭГ и серотонином), так и на тулярин с 2,3±0,05% (в пробах с тулярином) до 1,4±0,03% (в пробах с тулярином и серотонином). Полученные показатели согласуются с установленными нами ранее данными о том, что серотонин ингибирует развитие раннего (через 6 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека под действием Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis I серовара, относящихся к одной эволюционной линии [10]. В пробах с тулярином и в сочетании тулярина с серотонином количество пролиферирующих лейкоцитов уменьшалось почти в 2 раза по сравнению с аналогичными показателями в пробах без индуктора. Через 24 ч инкубации количество апоптотических и пролиферирующих лейкоцитов крови в экспериментальных пробах, приготовленных in vitro, достоверно не отличалось от значений в контрольных пробах без индуктора. ОБСУЖДЕНИЕ Проведенные исследования позволили установить, что биогенный амин серотонин, в зависимости от сроков формирования вакцинального процесса (противочумного или противотуляремийного), оказывает in vivo различное действие на характер распределения клеток иммунной системы по клеточному циклу, изменяя относительное содержание пролиферирующих и апоптотических клеток в тимусе, селезенке и лейкоцитов крови, что свидетельствует об его иммуномодулирующих свойствах. Полагают, что серотонин влияет на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток через ось гипоталамус-гипофиз-надпочечники [1, 4]. При иммунизации живыми вакцинами формирование иммунного ответа идет в две фазы: нестерильную и стерильную. Длительность и напряженность иммунитета в целом напрямую зависит от продолжительности и выраженности нестерильной фазы. Выявленная в опытах in vivo и in vitro способность серотонина влиять на развитие процессов апоптоза в клетках крови и иммунокомпетентных органов вакцинированных против чумы мышей, по-видимому, косвенно сказывается на изменении продолжительности нестерильной фазы иммунного ответа, что, возможно, влияет на напряженность иммунитета. Известно, что различные подтипы серотониновых рецепторов 5-НТ определены на В- и Т- клетках, дендритных клетках, периферических мононуклеарных лейкоцитах крови и макрофагах [15]. Серотонин играет важную роль в активации Т-лимфоцитов и их взаимодействии с дендритными клетками [14]. Выявленное нами с помощью проточной цитометрии свойство серотонина стимулировать in vivo пролиферацию лимфоцитов (спленоциты, тимоциты, 70 - 90% лимфоцитов крови) мышей, вакцинированных F.tularensis 15 НИИЭГ, косвенно подтверждает активацию клеточного звена при противотуляремийном иммунном ответе. Зарубежные исследователи подчеркивают ключевую роль Т-лимфоцитов, включая СD4+ и CD8+ Т-клеток, формирующих пул Т-клеток памяти в формировании постинфекционного и поствакцинального противотуляремийного иммунитета [12]. Установленная рядом зарубежных авторов активация апоптоза в клетках крови под влиянием F.tularensis [16] согласуется с нашими данными, но отмеченная в исследованиях in vitro задержка апоптоза лейкоцитов крови у интактных биомоделей под воздействием тулярина на фоне серотонина связана, по-видимому, именно с добавлением БАВ. Можно предположить, что адекватность развития противочумного и противо-туляремийного иммунитета в определенной мере зависит от уровня серотонина в макроорганизме как БАВ, регулирующего целый ряд компенсаторноприспособительных и патологических процессов [1]. Таким образом, биогенный амин серотонин в физиологической концентрации оказывает равнозначный модулирующий эффект как на противочумный, так и на противотуляремийный иммунный ответ в условиях in vivo и in vitro, не нарушая при этом гомеостаз иммунной системы. Изменения, происходящие в клетках иммунной системы под влиянием серотонина, укладываются в рамки представлений об эффективно протекающем иммунобиологическом процессе.

About the authors

S. N Klyueva

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

A. L Kravtsov

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

T. N Schukovskaya

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

References

Supplementary files