EFFECT OF PULSE-PERIODIC CORONA DISCHARGE ON VIABILITY OF ESCHERICHIA COLIM17 CELLS IN BIOFILMS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Биопленки обеспечивают микроорганизмам надежную защиту от действия негативных факторов окружающей среды. Они могут включать в себя один или несколько видов микроорганизмов и образовываться в различных полостях макроорганизма, в том числе на слизистых оболочках желудочно-кишечного, респираторного и урогенитального тракта, а также на поверхности кожи [7]. Патогенные микроорганизмы формируют биопленки в тканях пораженного макроорганизма. От окружающей среды они отделены мембраноподобной структурой - поверхностной пленкой, основным элементом которой является трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой соответствует универсальной плазматической мембране [5]. Исследования особенностей строения и организации биопленок условно патогенных бактерий с помощью методов электронной микроскопии показали, что помимо наличия защитной поверхностной пленки все клетки сообщества заключены в полисахаридный межклеточный матрикс [6]. Вероятно, он придает дополнительную устойчивость бактериальным клеткам к антимикробным препаратам, что способствует хронизации инфекционного процесса и торпидному характеру течения заболевания, неподдающемуся базисной терапии, действию врожденного иммунитета и этиотропных препаратов [5]. Известно, что бактерии в составе биопленок устойчивы к концентрации антибиотиков, в 100 - 1000 раз превышающей терапевтические дозировки для подавления жизнедеятельности клеток в виде планктонных (суспензионных) форм [El-Azizi M. et al., 2009]. В связи с этим, в настоящее время наиболее актуальным направлением является разработка новых способов разрушения биопленок, включая антимикробные и пробиотические препараты, бактериоцины и другие физико-химические воздействия [1]. Одним из наиболее перспективных способов деструкции бактериальных клеток является воздействие электрического разряда. В частности, сегодня существуют электроразрядные технологии для бактерицидной обработки воды [11], стерилизации медицинского инструмента [10] и выполнения хирургических операций [Shashurin A. et al., 2014]. Активно изучаются возможности получения «холодной» неравновесной плазмы газового электрического разряда атмосферного давления [12]. Последнее актуально для разработки технологий дезинфекции живых и температурочувствительных материалов [Dobrynin D. et al., 2009]. Перечисленные выше примеры применения электрического разряда в большинстве своем основаны на генерировании импульсно-периодических электрических разрядов с частотами от нескольких десятков герц до единиц мегагерц. Слаботочной стадией их развития является корона - источник неравновесной плазмы с температурой газа менее 400 K [12]. Благодаря низким токам разряда (10-10 - 10-5 А) и в случае низкой плотности мощности, выделяемой в рабочем объеме газа, ИПКР можно рассматривать как перспективный инструмент для плазменной антимикробной обработки кожных покровов человека и материалов, чувствительных к тепловым и электрическим нагрузкам. Однако коронная стадия разряда неустойчива и способна мгновенно переходить в сильноточную искру/дугу. Поэтому длительность импульсов питающего напряжения должна быть меньше, чем время, требуемое для развития стримера и полного пробоя разрядного промежутка. Несмотря на указанный недостаток, известно много работ, посвященных стерилизации жидких веществ и поверхностей твердых тел с использованием коронного разряда. При этом механизмы бактерицидного действия могут быть весьма разнообразны в зависимости от свойств обрабатываемой среды и параметров напряжения питания электроразрядной установки. Главными факторами, ответственными за инактивацию микроорганизмов при инициировании электрического разряда в газе или жидкости, являются электрический ток [Babaeva N.Yu. et. al., 2010] и химически активные частицы, в том числе веществ - бактерицидов, рождаемые в результате его прохождения через кислород и/или азот содержащую среду [Graves D. B. 2012]. Механизм гибели бактериальной клетки при прохождении через нее электрического тока определяется его видом (DC/AC/pulsed), величиной и длительностью воздействия. Сравнительный анализ антимикробного потенциала разных видов электрического тока показал, что механизмы инактивации микроорганизмов электрическим током по-прежнему остаются не до конца изученными и часто оказываются противоречивыми [8]. Однако среди них можно выделить: разрушение клеточной мембраны и блокировку процесса клеточного деления - за счет прямого действия электрического тока; повышение температуры обрабатываемого вещества и его электролиз, следствием которого является рождение химически активных частиц как результат прохождения электрического тока через среду. Очевидно, что все перечисленные процессы можно ожидать при обработке вещества коронным разрядом. Поэтому справедливо предположить, что инициирование ИПКР в воздухе - среде, содержащей кислород - вблизи поверхности, заселенной микроорганизмами, приведет к ее дезинфекции. Особый интерес представляет влияние ИПКР на бактериальное сообщество - биопленку, поскольку она является основным способом существования микроорганизмов в естественных условиях обитания в организме человека и окружающей природной среде [3, 9]. Представляется, что ИПКР в воздухе способен оказывать бактерицидное воздействие на микробные биопленки, разрушая клетки внутри них и их дополнительные защитные слои. Поэтому настоящая работа посвящена исследованию влияния ИПКР в воздухе на бактериальные биопленки на примере культуры E. coli M17. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования служили биопленки грамотрицательных бактерий E. coli M17 из пробиотического препарата колибактерин (Микроген НПО, НПО «Биомед», Россия). Для получения бактериальных биопленок односуточные бульонные культуры E. coli M17 в питательном бульоне М244 (HiMedia, Индия) плотностью 108 КОЕ/ мл тампоном наносили на поверхность питательного агара МО12 (HiMedia, Индия). Выращивание биопленок проводили в условиях термостата при температуре 37°C в течение суток. Для получения ИПКР в воздухе авторами разработан и изготовлен импульсный высоковольтный источник питания, включающий импульсный высоковольтный преобразователь напряжения (ИВПН) и импульсный высоковольтный трансформатор (ИВТ), способный генерировать сигнал переменного напряжения с амплитудой 30 - 60 кВ и частотой следования импульсов 250 - 400 кГц. Выходной импульс напряжения подавался на высоковольтный электрод, которым служил многожильный провод с общей площадью сечения 2,5 мм2. Он устанавливался перпендикулярно поверхности агара на расстоянии 3 мм от нее. Диаметр области, охваченной разрядом, составлял 4 - 6 мм. Ток разряда, соответствующий описанным условиям эксперимента, равен 0,27 А. Морфологический анализ клеток и структуры бактериальных биопленок E. coli M17 проводили на ультратонких срезах с использованием трансмиссионого электронного микроскопа (ТЭМ). Пробы отбирали из зон подавления роста клеток E. coli M17, в том числе с участков визуально не выявляемого роста микроорганизмов. Особенность подготовки образцов заключалась в сохранении исходной структуры и пространственного расположения исследуемых объектов. С этой целью участки роста бактерий, вырезанные вместе с агаром, предварительно фиксировали в 2,5% растворе глутаро-вого альдегида на буфере Хенкса (pH 7,2) при температуре 4°C, наливая фиксатор в основание агаровой пластинки, чтобы не повредить поверхностные структуры микробных сообществ и не нарушить их целостность. Заключенные сверху в агарозный гель пробы промывали дистиллированной водой и подвергали вторичной фиксации в 1% водном растворе четырехокиси осмия (ОзО4), проводя трехкратную отмывку от фиксатора. Затем препараты обезвоживали в серии этилового спирта возрастающей концентрации, в смеси спирта и ацетона и в ацетоне, после чего их заливали в смолу spurr. Для устранения ошибок из заливочных блоков делали заготовки на пирамитоме Pyramitome (LKB-11800, Швеция), что обеспечивало возможность правильной ориентировки исследуемого объекта и оценке местоположения инактивированных участков при дальнейшем изготовлении ультратонких срезов. Срезы готовили на ультратоме LKB-8800 (LKB, Швеция), окраску проводили уранилацетатом и цитратом свинца. Детали разработанного нами метода описаны в [2, 4]. Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Воздействию ИПКР подвергали клетки E. coli M17 непосредственно после нанесения посевной дозы на плотную питательную среду (ex tempore), исследуя таким образом влияние коронного разряда на формирование бактериального газона. Кроме того, ИПКР обрабатывали уже сформированные 1-суточные биопленки E. coli M17 и анализировали изменения в структуре бактериальных клеток и биопленок. В первом случае измеряли зону подавления роста бактерий и оценивали инактивацию клеток, обработанных коронным разрядом в течение 90 и 180 сек. Во втором варианте опытов исследовали влияние ИПКР на морфологические свойства клеток в уже сформированных биопленках, обработанных в течение 90 сек. Расстояние между поверхностью питательной среды и высоковольтным электродом составляло во всех случаях 4 мм. Свежезасеянные культуры E. coli M17 после их обработки коронным разрядом культивировали в течение 24 часов при температуре 37оС в условиях термостатирова-ния. Зоны задержки роста бактерий, сформированные в результате бактериального газона на растущие клетки, составляли 10 и 13 мм в диаметре при длительности обработки 90 и 180 сек. соответственно. Следует отметить, что вокруг зоны полной инактивации клеток регистрировали зону разряженного роста отдельно лежащих колоний бактерий, которая составляла 4 - 5 мм. За пределами этой зоны наблюдали развитие сплошного бактериального газона. Наличие зоны разряженного роста свидетельствует о гибели значительной части клеток не только в зоне непосредственного воздействия ИПКР, но и в прилежащей к этой зоне области. На рис. 1 представлены ультратонкие срезы биопленок E. coli M17 и биопленок, на которые воздействовали коронным разрядом. Результаты исследования целостности биопленок на ультратонком уровне после воздействия ИПКР представлены на рис. 2. В этом случае в структуре биопленок E. coli M17 обнаружено чередование зон с полностью разрушенными клетками, на месте которых возникали пустоты, и участков слияния бактерий в единый симпласт, при этом границы между клетками становились неразличимыми. При большем увеличении электронно-микроскопического изображения можно оценить целостность поверхностной пленки - одной из важнейших защитных структур биопленки. На отдельных участках биопленки после воздействия ИПКР просматривалась практически неповрежденная структура поверхностной пленки, при этом однако трехслойная мембрана, входящая в ее состав, оставалась неразличимой. На Рис.1. (вверху слева). Ультратонкий срез фрагмента биопленки E.coli M17: a - контроль; b - после воздействия ИПКР в течение 90 сек, зона фокальной деструкции (стрелка). ТЭМ. Рис.2. (вверху справа). Ультратонкий срез биопленки E.coli M17, a - контроль, пп - поверхностная пленка; b - после воздействия ИПКР 90 сек, п - пустоты, с - симласт клеток, пп - поверхностная пленка. ТЭМ. Рис. 3. (внизу слева). Ультратонкий срез фрагмента биопленки E.coli M17 после воздействия ИПКР 90 сек: п - пустоты, с - симласт клеток, пп - поверхностная пленка. ТЭМ. Рис. 4. (внизу справа). Ультратонкий срез биопленки E.coli M17 после воздействия ИПКР 90 сек: г - глобулярные включения в цитоплазме клеток, с - симласт клеток. ТЭМ. рис. 3 представлен фрагмент биопленки с разрушенным участком поверхностной пленки, на котором целостность данной структуры нарушена. Большая часть клеток E.coli M17 внутри биопленок после обработки ИПКР проявляла ярко выраженные деструктивные изменения. Из цитоплазмы исчезала зона нуклеода, в которой в интактном состоянии должны просматриваться нити ДНК (рис. 4). В таких клетках цитоплазма становилась гомогенной и электронноплотной, что свидетельствует о ее нефункциональности. Большинство клеток разрушены, в результате чего толща биопленки заполнена пустотами. Часть поврежденных клеток плотно прилегала друг к другу, сливаясь в единую однородную структуру - симпласт, при этом межклеточный матрикс в толще биопленки не просматривался. В цитоплазме клеток, которые после воздействия ИПКР не сливались в гомогенную массу, наблюдалось появление характерных для сублетального теплового воздействия глобулярных включений (рис. 4). Таким образом, на электронно-микроскопическом уровне показано, что воздействие ИПКР приводит к значительным морфо-функциональным изменениям как в самих бактериях E. coli M17, так и в структуре их биопленок. Разрушенные клеточные компоненты бактерий и характерная разреженность цитоплазмы сопровождались появлением в ней глобулярных включений, свидетельствующих о деструктивных изменениях, происходящих в клетках при их обработке коронным разрядом. ОБСУЖДЕН И Е Показано, что генерируемый в воздухе импульсно-периодический коронный разряд средней частоты способен оказывать бактерицидное и бактериостатическое воздействие на культуру Е. coli М17 как на клеточном, так и на популяционном уровне. Воздействие ИПКР подавляет образование растущих биопленок и приводит к разрушению уже сформированного микробного сообщества. Электронно-микроскопический анализ клеток и биопленок Е. coli М17 после воздействия ИПКР свидетельствует о нескольких механизмах их повреждения. На популяционном уровне изменяется соотношение морфологических типов клеток, что проявляется в увеличении доли деструктурированных и полностью лизированных форм бактерий. Деструктивные изменения клеток после воздействия ИПКР выражены в образовании фокальных нарушений в цитоплазматической мембране, расширении периплазматического пространства, разреженности и образовании глобулярных структур в разрушеной цитоплазме. Представленные в настоящей работе экспериментальные данные по изменению ультраструктурной организации биопленок E. coli M17 после воздействия ИПКР способствуют выявлению деталей, необходимых для анализа и дифференцировки механизмов его бактерицидного и бактериостатического действия, а также для сравнительной оценки негативного влияния других физико-химических факторов окружающей среды.

About the authors

O. V Rybalchenko

St. Petersburg State University

O. M Stepanova

St. Petersburg State University

O. G Orlova

St. Petersburg State University

A. M Astafiev

St. Petersburg State University

A. A Kudryavtsev

St. Petersburg State University

V. V Kapustina

St. Petersburg State University

References

Supplementary files